Tese de Mestrado - Isabella versao final corrigida - UFF

3.8 Zimografia
3.8.1 Preparo do extrato tecidual
Os músculos inoculados e controles foram coletados e imediatamente
congelados e preservados em nitrogênio líquido (-165 o C). Os músculos foram
pesados e homogeneizados (1/10, p/v) em tampão de extração (100 mM Tris-
HCl, pH 7,6, 200mM NaCl, 100mM CaCl2 e 1% Triton X-100) à 4 o C. Após a
centrifugação (15.000 xg), o sobrenadante foi dividido em alíquotas de 100 µl, e
a concentração protéica determinada utilizando-se uma curva padrão de
albumina pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951). A mesma quantidade de
proteína total foi usada para zimografia (60 μg/poço).
3.8.2 Gel para zimografia
As zimografias foram executadas segundo protocolo previamente
descrito (Heussen & Dowdle, 1980) em gel de poliacrilamida SDS-PAGE a
7,5% contendo gelatina do tipo A de pele suína (Sigma Chem. Co, St. Louis,
Mo. EUA) na concentração de 2 mg/mL e os géis de entrada poliacrilamida 5%
(w/v). A eletroforese foi realizada com a concentração de 60μg de proteína para
cada uma das amostras aplicadas nos géis a 165 Volts por um tempo médio de
60 minutos (Power Pac 200 – Bio-Rad, EUA). Após a eletroforese os géis
foram lavados duas vezes em 2.5% Triton X-100 para total remoção do SDS
seguido de incubação a 37◦C em tampão contendo o substrato (10 mM Tris–
HCl buffer, pH 7.5, 5 mM CaCl2, ZnCl2 1µM ) por 24 horas. SDS é o agente
responsável pela ativação das metaloproteases mesmo na forma inativa sem
clivagem proteolítica (Talhouk et al., 1991). Os géis foram corados pelo
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