Biotecnologia

ashige e Skoog, 1962), e mantidas,por dois dias, em câmara de crescimento,sob condições controladas defotoperíodo (16h de luz e 8h de escuro)e temperatura de 26°C. Após esseperíodo, as sementes que germinaram,ou se for o caso, as folhas declones micropropagados, são inoculadasem meio líquido MS contendoAgrobacterium tumefaciens (na densidadede 10 7 -10 9 células/mL) e mantidasem co-cultivo por 24h, na presençade acetoseringona (20 mg/L), sobagitação constante (100 rpm). Em seguida,as sementes ou as folhas sãotransferidas para placas de Petri contendomeio MS sólido para o co-cultivoem meio sólido por mais 48h. O materialé posteriormente lavado em águaestéril contendo 200 mg/L de cefotaxima,submetido à secagem em papelde filtro estéril, antes de ser transferidopara meio MS sólido contendo 100mg/L de cefotaxima. A figura 4A mostraa expressão transitória do geneuidA que codifica a enzima β-glucuronidase(GUS), sob o controle do promotor35S do vírus do mosaico dacouve-flor (CaMV), em folhas cotiledonares,após 15 dias do co-cultivo. Podeseobservar que a transformação doscotilédones ocorre preferencialmentenas regiões periféricas (Figura 4B). Afigura 5 mostra a sequência completado processo de transformação de E.grandis x E. urophylla de cotilédonesou folhas de clones micropropagados.Após a inoculação dos tecidos com aAgrobacterium, o material é transferidopara o meio de formação de calo M1(Tabela 1) contendo 5 mg/L de geneticinaG-418 (Figura 5C). Posteriormente,os cali são transferidos para omeio de indução de brotações M2(Tabela 1) na presença do agenteseletivo (Figura 5D), até a formação debrotações, que são, então, mantidasem meio de alongamento (MA, Tabela1) por 30 dias, sendo, em seguida,transferidas para meio de enraizamento(ME, Tabela 1) (Figura 5E). Uma vezformadas as raízes, as plântulas sãotransferidas para vaso e mantidas emcâmara de crescimento sob condiçõescontroladas (Figura 5F). A análise molecularpara a confirmação da integraçãodo gene de interesse no genomada planta é feita com o auxílio datécnica de Southern blot, como ilustradona figura 5G, para quatro plantastransgênicas de E. grandis x E. urophyllaque expressam o gene Lhcb1*2de ervilha (Gonzáles et al., 2002).AgradecimentosEsse projeto foi financiado pelaFAPESP (Inovação Tecnológica 98/01394-0), Cia. Suzano de Papel e Celulose,CNPq/Rhae e CAPES.Referências BibliográficasAzmi A Dewitte W, Drevet C, VanonckelenH, Landre P, Boudet AM,Jouanin L, Chriqui D (1997) Budregeneration from Eucalyptus globulusclones and seedlings throughhormonal imbalances induced byAgrobacterium tumefaciens strain82.139. 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