Biotecnologia

Figura 6 - Transdução de EGFP em fibroblastos humanos(XP12RO) infectados com AdEGFP (10 MOI).A. Análise por microscopia de fibroblastos infectadoscom o AdEGFP, em luz branca fluorescente e luz UV(100X). B. Citometria de fluxo de células XP12ROantes e depois da infecção com o AdEGFP. M1 =porcentagem do total de células que expressam aproteína EGFPFigura 7 - Expressão de EGFP após a infecção doAdEGFP (10 MOI) em fibroblastos humanos. A.Visualização do extrato de proteínas totais de célulasXP12RO não infectadas e previamente infectadascom o AdEGFP, sob a luz UV. B. Western-blotda proteína EGFP (38 KDa) em função do tempoapós a infecção viral. 1. uma hora, 2. duas horas, 3.quatro horas, 4. oito horas, 5. doze horas, 6. 24 horas,7. quarenta e oito horas e 8. setenta e duashoras. Foi utilizado o anticorpo anti-EGFP comosondaEGFP foi detectada 24 horas após ainfecção, usando-se microscópio defluorescência invertido e citometria defluxo, figura 5. Essa dose foi capaz deinfectar mais de 97% da populaçãocelular sem qualquer efeito citopáticovisível, mesmo após as células ficaremuma semana em contato com o vírus.A extração de proteínas totais de célulasinfectadas ou não pelo AdEGFP járevela a alta expressão do transgene,bastando compará-los sob a luz UV,figura 6A. A proteína EGFP foi detectadapor Western-blot 4 horas após ainfecção. O maior nível de expressãoobtido foi em 48 horas após a infecção;em 72 horas, já observamos uma diminuiçãoda expressão, provavelmentedevido à diluição da proteína com aduplicação celular, figura 6B.Discussão e PerspectivasA tecnologia de transferência gênicapor adenovírus é, sem dúvida, umdos métodos mais poderosos que temoshoje em dia para introdução degenes em células de mamíferos. Osadenovírus têm um amplo espectro decélulas permissivas, de modo que vetoresderivados desses vírus podemser utilizados para transferir genes deinteresse para células de várias espécies(incluindo humanos) e de diferentestecidos. Uma vez que o maquináriode infecção dos adenovírus independedo ciclo celular, podem ser infectadascélulas em replicação ou diferenciadas.É possível ainda trabalhar comcélulas primárias (não imortalizadas)ou com linhagens transformadas, ondea eficiência de infecção é idêntica.Após a infecção, a expressão do transgenecomeça tão logo o DNA viralatinja o núcleo celular e tem início aexpressão gênica transiente (Marchettoe cols., 2001). Logicamente, níveiscontrolados de expressão podem seratingidos com o uso de promotoresespecíficos ou indutíveis. Além disso,em células somáticas, como o DNAadenoviral não integra no genoma celular,o risco da freqüência de mutaçõesinsercionais e da atenuação daexpressão genética é reduzido, o quegeralmente acontece quando genomasestranhos se integram no DNAcelular (Verma e Somia, 1997). Essesvírus recombinantes podem prontamenteco-expressar mais de um transgenena mesma célula alvo com baixatoxicidade, indicando que a grandemaioria das células sobrevive ao processode infecção. Métodos convencionaispara a criação de vetores recombinantessão geralmente baseados emfenômenos de recombinação in vivo,seja em células HEK293, seja em E.coli.Esses métodos são trabalhosos e ineficientes,envolvendo um tempo muitogrande durante a purificação de placasvirais para o isolamento de possíveiscandidatos a adenovirus recombinantes.Mesmo após todo esse esforço, écomum encontrar contaminação comvírus selvagem. Esses processos nãosão satisfatórios para um futuro usoclínico e, uma vez que não estão baseadosem uma clonagem direta, favorecema emergência de vírus com replicação-eficientedurante a amplificação.O método utilizado aqui, desenvolvidopor Mizuguchi e Kay (1998),oferece uma alternativa mais direta esimples, contornando todos esses reveses.Com um protocolo elegante,baseado apenas em ligações in vitro, o42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002