BAġKENT ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ Biyokimya Anabilim ...

3.5. Doku SOD Aktivitelerinin SaptanmasıKaraciğer ve böbrek dokusunda SOD aktivite tayini Sun ve ark‟larının yöntemi modifiyeedilerek gerçekleştirildi (62). Bu yöntemde ksantin ve ksantin oksidaz kullanılarakoluşturulan O -. 2 , renkli formazan oluşturmak üzere nitroblue tetrazolyum (NBT) bileşiğiile reaksiyona girmektedir.Doku örnekleri 0,1 M pH 7,4 fosfat tamponu ile hazırlanan % 1,17 KCl içinde cam-camhomojenizatör kullanılarak homojenize edildi (1/10, w/v). Homojenat örnekleri 15,000g‟de 30 dk +4ºC‟de santrifüjlenerek süpernatant elde edildi. Elde edilen süpernatantfosfat tamponu ile karaciğer dokusu için 1/ 10, böbrek dokusu için 1/5 seyreltilerekenzim kaynağı olarak kullanıldı.Ksantin oksidaz çözeltisi, son derişimi 167 U/L olacak şekilde soğuk 0,1 M pH 7,4 fosfattamponu ile taze olarak hazırlandı.SOD çalışma reaktifi; 0,3 mM ksantin, 0,6 mM EDTA, 150 M NBT, 400 mM Na 2 CO 3çözeltisi ve 1g/l sığır albumini içerecek şekilde hazırlandı.SOD standartları: 10 g/ ml derişimde hazırlanan stok SOD Standart çözeltisinden 90,70, 50, 30, 15, 10 ng/ml‟lik standartlar taze olarak hazırlandı.Her tübe 2,45 ml SOD çalışma reaktifi, 0,5 ml standart veya enzim kaynağı (örnek körüiçin 0,5 ml su) eklendikten sonra tüpler 25ºC su banyosuna kondu. Tüplere son hacim 3ml olacak şekilde 50 l ksantin oksidaz eklendi. Her tüp 20 dakika inkübe edildiktensonra reaksiyon 1ml 0,8 mM CuCl 2 eklenerek durduruldu. Formazan oluşumu 560 nm‟de(Shimadzu-1601) saptandı. Bu şartlar altında örnek körünün absorbansı 0,139 olarakölçüldü ve aşağıdaki eşitlik kullanılarak % inhibisyonlar hesaplandı.% inhibisyon =(Akör – A örnek )A körX 100Doku örneklerinin SOD aktivitesi hesaplamaları standart derişimlerine karşı %inhibisyonların gösterildiği standart eğriden hesaplanmıştır (Şekil 3.2). Bir ünite SOD,34