BAġKENT ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ Biyokimya Anabilim ...

TEġEKKÜRBilgi ışığı ile her zaman yolumu aydınlatan, tezin her aşamasında destek ve katkıları ileyanımda olan değerli hocam Prof. Dr. Suna Türkoğlu‟na,Sonsuz desteği ve sabrı sayesinde bu tezin ortaya çıkmasını sağlayan, hayatın getirdiklerikarşısında her zaman yanımda olan değerli hocam ve tez danışmanım Doç. Dr. DeryaAldemir‟e,Destek ve katkılarıyla her zaman yanımda olan Doç.Dr. Müge Tecder Ünal‟a,Her aşamada bana destek olup yardım eden çalışma arkadaşım ve dostum Uzm. Kim. EdaÖzturan Özer‟e,Destek ve yardımlarını hiç esirgemeyen , her zaman yanımda olan çalışma arkadaşlarım vedostlarım Sinan Karaçoçuk ve Dr. Eda Akçay‟a,Sonsuz sabır ve destekleri için eşim başta olmak üzere tüm aileme teşekkür ederim.

ABSTRACTProtective Effect of Catechins in Acetaminophen Induced Hepato-nephro ToxicityAcetaminophen (APAP) is an analgesic and antipyretic agent that has been proven to leadfatal hepatic necrosis and nephrotoxicity when taken overdose. Catechins, as a member offlavonols comprise most of the polyphenolic content of green tea. This study is aimed toevaluate the protective role of catechins on APAP induced hepatic and renal injury.Swiss albino mice included in the study were divided into 6 groups as follows: Controlgroup (n=7), APAP group (n=7), Epigallocatechingallat (EGCG) group (n=7), Polyphenon60 group (n=7), EGCG + APAP group (n=8), Polyphenon 60 + APAP group (n=8). Alladministrations were achieved intraperitoneally, APAP as 550 mg/kg in a single dose,whereas EGCG and polyphenon 60 as 25 mg/kg/day for 7 days prior to APAP treatment.APAP treatment resulted in a significant increase in serum AST and ALT activitieswhereas a significant decrease in paraoxonase activity when compared to controls.Following APAP treatment; a significant increase in liver malondialdehyde (MDA) levels,a significant decrease in reduced glutathione (GSH) levels, glutathione peroxidase (GPx)and PON activities without any alteration in superoxide dismutase (SOD) activity wereobserved with respect to controls. There were no significant alterations in renal tissues.These findings were confirmed with histopathological results. EGCG and polyphenon 60administrations caused a significant decrease in AST and ALT activities and a significantincrease in PON activity when compared to APAP treated group. Also; both catechinsincreased liver MDA and GSH concentrations together with GPx and PON activities withrespect to APAP group, whereas decreased hepatic and renal SOD activity significantly.Our results indicate that this dose of APAP administration induced liver injury withoutcausing any nephrotoxicity. However, catechins seem to lead oxidative stess both byelevating liver MDA levels and decreasing SOD activity in both tissues, besides providinga protection over serum transaminase levels. Taken together, our data suggest thatcatechins, in this applied dose and time, have no ability to protect against APAP toxicity.Key words: APAP toxicity, catechins, paraoxonase, oxidative stressiv

ĠÇĠNDEKĠLERSayfaÖzetiiiİngilizce özetivİçindekiler dizinivKısaltmalar ve simgeler diziniviiŞekiller diziniviiiTablolar diziniix1. Giriş 12. Genel Bilgiler 22.1. Asetaminofen 42.1.1. Asetaminofenin Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri 42.1.2. Emilimi ve Dağılımı 42.1.3. Metabolizması 52.1.4. Asetaminofen Toksisitesi 82.2. Oksidatif Stres 122.2.1. Lipit Peroksidasyonu 132.2.2. Glutatyon 142.2.3. Süperoksit Dismutaz 182.2.4. Glutatyon Peroksidaz 182.2.5. Paraoksanazlar 192.2.6. Hepatotoksisite ve Oksidatif Stres 212.2.7. Nefrotoksisite ve Oksidatif Stres 232.3. Katekinler 232.3.1. Kimyasal Özellikleri 242.3.2. Emilim ve Doku Dağılımı 242.3.3. Metabolizması 252.3.4. Katekinlerin Antioksidan Etkileri 283. Gereç ve Yöntem 303.1. Kimyasallar 303.2. Deney Hayvanları ve Gruplar 31v

3.3. Serum Biyokimyasal Parametrelerinin Ölçümü 323.4. Doku MDA ve GSH Derişimlerinin Saptanması 323.5. Doku SOD Aktivitelerinin Saptanması 343.6. Doku GPx Aktivitelerinin Saptanması 353.7. Doku ve Serum PON Aktivitelerinin Saptanması 363.8. Doku Total Protein Analizi 363.9. Histolojik Analiz 373.10. İstatistiksel Analizler 374. Bulgular 384.1. APAP ve Katekin Uygulamasının Serum Parametreleri Üzerine Etkisi 384.1.1. AST, ALT, BUN ve Kreatinin Üzerine Etkisi 384.1.2. PON Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi 384.2. Karaciğer Üzerine Etkileri 394.2.1. MDA Derişimleri 404.2.2. GSH Derişimleri 414.2.3. Doku SOD Enzim Aktivitesi Üzerine Etkileri 424.2.4. Doku GPx Enzim Aktivitesi Üzerine Etkileri 424.2.5. Doku PON Enzim Aktivitesi Üzerine Etkileri 434.3. Böbrek Üzerine Etkileri 444.3.1. MDA ve GSH Derişimleri 444.3.2. Doku SOD, GPx ve PON Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkileri 444.4. Histolojik Bulgular 455. Tartışma 546. Sonuç 667. Kaynaklar 68vi

KISALTMALAR VE SĠMGELER DĠZĠNĠ4-HNE 4-hidroksinonenalALP Alkalen fosfatazALT Alanin aminotransferazAPAP AsetaminofenAST Aspartat aminotransferazBUN Kan üre nitrojeniC KatekinCG KatekingallatDGT Kafeinsizleştirilmiş yeşil çayEC EpikatekinECG EpikatekingallatEGC EpigallokatekinEGCG Epigallokatekin gallatGC GallokatekinGCG GallokatekingallatGPx Glutatyon peroksidazGR Glutatyon redüktazGSH Redükte glutatyonGST Glutatyon-S-transferazH 2 O 2 Hidrojen peroksitHDL Yüksek dansiteli lipoproteinIL-1 İnterlökin-1IL-6 İnterlökin-6i.p. İntraperitonealLDL Düşük dansiteli lipoproteinMDA MalondialdehitNAC N-asetilsisteinNAPSQI N-asetil-p-benzosemikuinoiminNAPQI N-asetil-p-benzokuinominNBT Nitroblue tetrazolyumNF- Nükleer faktör-NO Nitrik oksit.-O 2 SüperoksitOH·Hidroksil radikaliPGES Prostoglandin endoperoksit sentazPON ParaoksanazPUFA Poliansatüre yağ asitleriROS Reaktif oksijen türleriSOD Süperoksit dismutazTNF-α Tümör nekroz faktör - alfavii

ġEKĠL DĠZĠNĠSayfaŞekil 2.1 Asetaminofen 5Şekil 2.2. Asetaminofen Metabolizması 7Şekil 2.3. APAP Aracılı Hepatotoksisitenin Moleküler Mekanizması 10Şekil 2.4. Böbrekte GSH Kaynaklı APAP-Cys Oluşumu ve Nefrotoksisite 12Şekil 2.5. Reaktif Oksijen Moleküllerinin Oluşumu ve Endojen Antioksidanlar 13Şekil 2.6. Lipit Peroksidasyonu ve Ürünleri 14Şekil 2.7. GSH Aracılı Detoksifikasyon Mekanizması 15Şekil 2.8. GSH‟ın Antioksidan İşlevi 17Şekil 2.9. -glutamil Döngüsü 17Şekil 2.10. PON 1‟in hücreden HDL aracılı salınımı 20Şekil 2.11. Hepatik CYP450 Sistemi ve Detoksifikasyon 21Şekil 2.12. Çay Katekinlerinin Yapısı 24Şekil 2.13. Katekinlerin Metabolizması 28Şekil 3.1. GSH Standart Eğrisi 33Şekil 3.2. SOD Standart Eğrisi 35Şekil 3.3. BSA Standart Eğrisi 37Şekil 4.1. Serum PON Aktiviteleri 39Şekil 4.2. Karaciğer MDA Derişimleri 41Şekil 4.3. Karaciğer GSH Değişimleri 41Şekil 4.4. Karaciğer SOD Aktiviteleri 42Şekil 4.5. Karaciğer GPx Aktiviteleri 43Şekil 4.6. Karaciğer PON Aktiviteleri 43Şekil 4.7. Böbrek SOD Aktiviteleri 45Şekil 4.8. Fare Karaciğer Kesiti Histopatolojisi 46Şekil 4.9. Fare Karaciğeri Transmisyon Elektron Mikroskobu Analizi 47Şekil 4.10. Fare Karaciğeri Transmisyon Elektron Mikroskobu Analizi 48Şekil 4.11. Fare Karaciğeri Transmisyon Elektron Mikroskobu Analizi 49Şekil 4.12. Fare Karaciğeri Transmisyon Elektron Mikroskobu Analizi 50Şekil 4.13. Fare Böbrek Kesiti Histopatolojisi 51Şekil 4.14. Fare Böbreği Transmisyon Elektron Mikroskobu Analizi 52Şekil 4.15. Fare Böbreği Transmisyon Elektron Mikroskobu Analizi 53viii

TABLO DĠZĠNĠSayfaTablo 2.1. Katekinlerin Metabolizması 25Tablo 4.1. Serum Biyokimyasal Parametreleri 38Tablo 4.2. Serum PON Aktiviteleri 39Tablo 4.3. Doku MDA GSH Derişimleri ile SOD, GPx ve PON Aktiviteleri 40Tablo 4.4. Böbrek Dokusu MDA ve GSH Derişimleri 44Tablo 4.5. Böbrek Dokusu SOD, GPx ve PON Aktiviteleri 45ix

1.GĠRĠġAsetaminofen (APAP), dünyada en fazla kullanılan analjezik-antipiretik ajanlardan biridir.Terapötik dozlarda kullanıldığında yararlı olan APAP‟ın yüksek dozlarda kullanıldığındadeney hayvanları ve insanlarda hepatik nekroz, böbrek toksisitesi ve ölüme neden olduğuyapılan çalışmalarla gösterilmiştir (1).APAP‟ın metabolizması başlıca karaciğerde gerçekleşmektedir. Terapötik dozlardaalındığında % 80-85‟i sülfat-glukronit konjugasyonu ile, % 10-15‟i hepatik CYP450sistemi (CYP2E1-1A2) ile detoksifiye edilmektedir. Yüksek doz APAP uygulaması sonrasıkonjugasyon yolu doygunluğa ulaştığı için CYP450 yolu ile metabolize edilen APAPmiktarı artar ve bu durum toksik reaktif metabolit oluşum hızında artışla sonuçlanır (2, 3).APAP‟ın toksisitesinden sorumlu olan major metaboliti N-asetil-benzokuinomin (NAPQI)dir. Terapötik dozlarda APAP alındığında, oluşan NAPQI glutatyon ile konjuge edilerekidrar yolu ile atılır (3). Farelere (balb/c) intraperitoneal (i.p.) yoldan uygulanan NAPQI‟nınLD 50 ‟si 20 mg/kg‟dır (4). Yüksek dozda APAP uygulandığında oluşan NAPQI miktarıartar. Bu artış, hücre içi redükte glutatyonda (GSH) azalma ile sonuçlanır ve ortamdakifazla NAPQI hücredeki makromoleküllerle etkileşerek sentrilobüler nekroza neden olur.Erken dönemde mitokondrial disfonksiyon görülürken bunu mitokondrial kollaps, onkotiknekroz izler ve sonuçta in vivo hücre ölümü meydana gelir (3,5). APAP toksisitesi sonucuoluşan renal hasarda da benzer şekilde NAPQI metabolitinin sorumlu olduğudüşünülmektedir. Yüksek doz APAP uygulaması hücrede glutatyonu tüketmekte ve artanNAPQI hücresel proteinlere bağlanmaktadır. Bunun sonucunda lipit peroksidasyonu başlarve renal hasar meydana gelir. APAP ile indüklenen hepatotoksisiteden farklı olarak oluşannefrotoksisitede; hepatik kaynaklı APAP metabolitleri ve GSH-konjugatları da roloynamaktadır. APAP toksisitesine bağlı gelişen nefrotoksisite, hepatotoksisiteden daha azgörülmesine rağmen, yapılan çalışmalarda karaciğer hasarı olmadan da oluştuğugösterilmiştir (6).APAP‟ın indüklediği toksisiteye karşı N-Asetilsistein‟in (NAC) hepatotoksisitedekikoruyucu etkisinin % 100 olduğu bilinmektedir. Günümüzde NAC dışında başka ajanlarınkoruyucu olduğuna dair birçok çalışma bulunmaktadır.1

Diğer yandan bazı çalışmalar göstermiş ki; bir GSH ön ilacı olan NAC, APAP ile ilişkilihepatotoksisiteye karşı koruyucu etki gösterirken nefrotoksisiteye karşı koruyucu etkisibulunmamaktadır (6).Çay dünyada sudan sonra en fazla tüketilen içecektir ve günümüzde yeşil çay özütlerinindiyet desteği olarak kullanımı artmaktadır. Yeşil çayın biyolojik aktivitelerinin büyükçoğunluğundan flavanoid içeriği sorumludur. Çayda bulunan flavanoidlerin büyük kısmıflavanol olan katekinlerdir. Katekinler çayın kuru ağırlığının % 25-35‟ini oluşturmaktadır.Katekinler suda çözünen renksiz bileşiklerdir (7). Taze çay yaprağında bulunan başlıcakatekinler:Katekin (C), epikatekin (EC), gallokatekin (GC), epigallokatekin (EGC), katekingallat(CG), epikatekin gallat (ECG), gallokatekin gallat (GCG) ve epigallokatekin gallat(EGCG)‟dır.İnce barsaktan absorbe edilen katekinler metilasyon, glukronidasyon ve sülfasyon ile hızlakonjuge metabolitlerine dönüşmektedir. Safraya atılan konjuge katekinler kolondakibakterilerce dekonjuge edilerek daha basit metabolitlere parçalanır. EGCG safra yolu ileEC ve ECG ise safra ve idrar yolu ile atılmaktadır. Oral, intravenöz (i.v.), i.p. uygulamasonrası katekinler için faz II reaksiyonu tanımlanmışken faz I reaksiyonu gösterilmemiştir(7, 8).Katekinlerin biyoyararlanımı, düşük absorpsiyon ve yüksek eliminasyon özelliklerinedeniyle sınırlıdır. Yarı ömrü en fazla olan katekin, EGCG (173dk) dir (9).Yeşil çayın başlıca polifenolik içeriğinden sorumlu olan EGCG‟dir ve çay yaprağının kuruağırlığının % 9-13‟ünü oluşturur. Yapılan çalışmalarda yeşil çay tüketimiyleilişkilendirilen yararlı etkilerin büyük çoğunluğundan EGCG‟nin sorumlu olduğugösterilmiştir. Yapılan bir çalışmada saf EGCG ile kafeinsizleştirilmiş yeşil çay (DGT)özütü kullanarak sıçanlardaki absorpsiyon ve eliminasyonları karşılaştırmış ve DGTuygulaması sonrası saf EGCG‟nin doku dağılımının en yüksek barsak sonra böbrek veakciğerde, en düşük ise karaciğer dokusunda olduğunu gözlemlemişlerdir (10). DGTuygulaması sonucunda saf EGCG‟ye göre EGCG‟ nin daha yavaş elimine olduğunugöstermişlerdir. DGT‟ nin diğer bileşenlerinin plazma ve doku proteinlerine bağlanmakiçin yarışması sonucu EGCG‟nin farmakokinetiğini değiştirdiği düşünülmektedir. Çay2

polifenollerinin major metabolize edilme yolu glukuronidasyon ve sülfasyondur. Çaypolifenollerinin glukuroniltransferaz ve sülfotransferaz için yarışmaları EGCG‟nineliminasyonunun inhibisyonuyla sonuçlanmaktadır (10).Oksidatif stres, serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma ve tamir sistemleriarasındaki dengenin bozulması durumudur. Reaktif oksijen türleri (ROS) hücrede lipit,protein, DNA gibi makromoleküllerle etkileşime girmektedir. Bu nedenle ROS ve lipitperoksidasyonu birçok hastalığın patogenezinde önemli rol oynamaktadır. Süperoksitdismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx), glutatyon redüktaz (GR), katalaz gibi hücreiçi ROS süpürücü etkiye sahip enzimler antioksidan durumun korunmasında önemli biryere sahiptir. Paraoksanaz 1 (PON1) enzimi organofosfatları, okside olmuşlipoproteinlerdeki lipit peroksitleri ve diğer ksenobiyotikleri hidrolize eden bir esterazolup, son dönemlerde antioksidan bir enzim olarak önemi artmaktadır.PON1, esas olarak karaciğerde sentezlenip seruma salınmaktadır. Enzimin düşükderişimlerde böbrek ve barsak dokularında da bulunduğu gösterilmiştir. Oksidatif stresinarttığı diyabet, hiperkolesterolemi ve kardiyovasküler hastalıklarda paraoksanazaktivitesinin azaldığı bilinmektedir. Yakın zamanda yapılan çalışmalarda PON1‟inoksidatif strese karşı koruyucu olduğu gösterilmiştir. Serbest radikal oluşumunun dagerçekleştiği ksenobiyotik metabolizması, primer olarak karaciğer mikrozomlarındagerçekleşmektedir. Bu nedenle hepatik PON1‟in bir antioksidan olarak karaciğer koruyucurolünün de olabileceği düşünülmektedir (11).Katekinler biyolojik sistemlerde antioksidan etkiye sahiptirler. EGCG, singlet oksijen,süperoksit anyon radikali (O 2 ∙ - ), peroksil radikali, hidroksil radikalinin (OH ∙ ) dahil olduğuçok geniş bir ROS süpürücü etki göstermektedir. Yapısındaki C halkasında gallat grubununvarlığı ve daha fazla hidroksil grubu içermesi EGCG‟a daha etkin antioksidan işlevkazandırmaktadır.EGCG ve diğer katekinlerin prooksidan etkisi de bulunmaktadır. Katekinlerinmetabolizasyonları radikal üretimine (fenolik radikal ve O 2˙¯ formuna dönüşerek) katkısağlamakta ve hücre apopitozuna neden olabilmektedir. Organizmada ikiyüzlü davranışsergileyen katekinlerin, karaciğerde toksik veya koruyucu etki göstermesinde uygulanandozun ve uygulama yolunun belirleyici olduğu ileri sürülmektedir (12, 13).3

Bu çalışmada APAP‟ın neden olduğu karaciğer ve böbrek toksisitesi üzerinde katekinlerinkoruyucu etkisinin incelenmesi amacıyla saf EGCG ile kafeinsiz yeşil çay özütü olanPolifenon 60 seçilerek her iki maddenin olası koruyucu etkilerinin biyokimyasal vehistopatolojik açıdan oksidatif stres bağlamında karşılaştırılması amaçlanmaktadır.4

2.GENEL BĠLGĠLER2.1. AsetaminofenAPAP, en sık kullanılan analjezik ve antipiretik ajanlardan biridir. Terapötik dozlardakullanıldığında oldukça etkili olmaktadır. Ancak, insanlar ve deney hayvanları üzerindeyapılan birçok çalışmada yüksek doz APAP uygulamasının karaciğer ve böbrektoksisitesine, hatta ölümlere yol açtığı gösterilmiştir.2.1.1. Asetaminofenin Fiziksel ve Kimyasal ÖzellikleriAPAP (C 8 H 9 NO 2 ), katı, kütlesi 151,2 g/mol olan, suda çözünürlüğü az, sentetik birmoleküldür (Şekil 2.1). Zayıf bir asit olması nedeniyle fizyolojik pH aralığında aniyonizeformda bulunmaktadır (14).ġekil 2.1. Asetaminofen2.1.2. Emilimi ve DağılımıAPAP, oral yol ile alımı takiben gastrointestinal kanaldan pasif transportla hızlıcaemilmektedir. Sistemik biyoyararlanımı % 70-90, plazma yarı ömrü 1,5-2 saat olup,biyoyararlanımı doz-bağımlı olarak gerçekleşmektedir. Oral emilim hızı midenin boşalımhızına bağlıdır. Gıdalar, postür, hastalık ve ilaçlar (propantelin, narkotik analjezikler) gibimide boşalmasını geciktiren faktörler APAP‟ın emilimini yavaşlatmaktadır. Açlıksırasında APAP‟ın emilimi çok hızlı gerçekleşmekte ve ilacın alımını takiben 15-30 dakikaiçinde plazma tepe değerine ulaşmaktadır.Emilim sonrası APAP birçok doku ve vücut sıvılarına hızlı bir şekilde dağılmakta olupdağılım hacmi 0,9 l/kg‟dır (2, 15, 16). Yapılan çalışmalarda en yüksek ilaç derişimlerininkaraciğer, böbrek ve gastrointestinal kanalda olduğu gösterilmiştir. Diğer dokuların aksinebeyine geçişi çok yavaş gerçekleşmektedir. APAP‟ın çok küçük bir kısmı da eritrositlere5

ağlanmaktadır. Aynı zamanda APAP rektal yoldan da emilmekte olup emilim hızıyavaştır (15,17-19).2.1.3. MetabolizmasıAPAP‟ın metabolizması esas olarak karaciğerde gerçekleşmekte olup aynı zamanda barsakve böbreklerde de metabolize edilmektedir. Terapötik dozda alınan APAP‟ın % 80-85‟iglukuronid-sülfat konjugasyonu ile, % 10-15‟i CYP450 enzim sistemi ile metabolizeedilmekte olup, %2-5‟i ise değişmeden idrarla atılarak uzaklaştırılmaktadır (2).APAP‟ın büyük kısmı glukuronidasyon ve sülfasyon yolu ile sülfat ve glukuronidkonjugatlarına dönüşür. Uygulanan APAP‟ın % 30-55‟i glukuronid ve sülfat konjugatıolarak idrarla atılırken glukuronid konjugatının az miktarı safrayada verilir (20). APAPdozu arttıkça sülfasyon ile konjugasyon yolu satüre olmaktadır. Yapılan bir çalışmada dozarttıkça safraya geçen glukuronid konjugatının 3 kat arttığı görülmüştür (21). APAP‟ınglukuronidasyon kapasitesi daha yüksek olmasına rağmen sülfasyona daha fazla ilgigöstermektedir (20, 21, 22).Normal dozda alınan APAP, çok az bir oranda CYP450 sistemi ile okside edilerek oldukçareaktif bir metaboliti olan NAPQI‟e dönüşür. NAPQI hızla GSH ile konjuge edilereksistein ve merkaptürik asit konjugatı şeklinde idrarla uzaklaştırılır (Şekil 2.2).İnsanlarda APAP metabolizmasında işlev gösteren en önemli CYP450 enzimleri, terapötikdoz APAP alımında CYP3A4, intoksikasyon ve daha yüksek doz APAP alımında iseCYP2E1 ve CYP1A2‟dir. Fare ve sıçanlarda ise CYP2E1 ve CYP1A2 enzimleri önemlidir(15, 20). 3-hidroksiparasetamol oluşumunda insanda CYP2A6, sıçanlarda CYP2B1 roloynamaktadır (23).6

ġekil 2.2. Asetaminofen metabolizması (19)Nicholls ve ark. yaptıkları çalışmada sülfat konjugatlarının %10‟unun farklı bir açil grubutaşıdığını göstermişlerdir ve son dönemlerde yapılan çalışmalarda sıçanlarda APAPmetabolizmasında transasetilasyon yolu tanımlanmıştır (24). Bu metabolik yolda oluşanmetabolit paraaminofenol (4-aminofenol)‟dür. Mugford ve ark.‟nın yaptıkları çalışmada,NAPQI ve paraaminofenol‟ün sıçanlarda asetaminofenle uyarılan böbrek toksisitesiyleilişkili olduğuna dair kanıtlar gösterilmiştir (25). Paraaminofenol‟ün büyük bir kısmı7

glutatyon konjugatına dönüşmekte ve çok az bir kısmı da tekrar asetaminofene dönüşerekhepatositte konjugasyona uğramaktadır.Sağlıklı bireylerde 20 mg/kg APAP‟ın ortalama renal klirensi 13 ml/dk olup renal klirensidrar akımı hızıyla ilişkili, pH ile ilişkili değildir. APAP‟ın glukuronid ve sülfatkonjugatlarının renal klirensinin daha yüksek olduğu buna karşın idrar akımı ve pH ileilişkisi gösterilememiştir. Böbrek fonksiyon bozukluğu olan hastalarda APAP‟ın plazmayarı ömrü değişmemekte ve APAP konjugatları birikmektedir (15).2.1.4. Asetaminofen ToksisitesiYüksek doz APAP alımı sonrası konjugasyon yolu hızla satüre olmakta ve CYP450 sistemiile okside edilen APAP oranı artmaktadır. Karaciğer GSH‟ı çok hızlı bir şekildetükenmeye başlayarak NAPQI artışını uzun süre tolere edememektedir. Sonuçta derişimihızla artan NAPQI, hücredeki makromoleküllere bağlanarak sentrilobüler nekroz ve hattahücre ölümüne neden olmaktadır. Fare, sıçan ve insan üzerinde yapılan çalışmalarda,yüksek doz APAP kullanımının şiddetli sentrilobüler nekrozla sonuçlandığı gösterilmiştir(2, 20).APAP akut renal tubüler nekroza da neden olmakta ve bu etkisi mikrozomal enzimaktivitesi ve glutatyon derişimine bağlı gelişebilmektedir. Yapılan çalışmalarda yüksek dozAPAP uygulaması sonrası fulminan karaciğer yetmezliği olmaksızın akut böbrekyetmezliğinin gelişebildiği gösterilmiştir. Bununla birlikte uzun dönem terapötik dozAPAP uygulamasının kronik böbrek hastalığı riskini arttırdığına işaret edilmektedir (15,20).Karaciğer ToksisitesiAPAP‟ın karaciğer üzerine toksik etkilerine CYP450 ile oksidasyonu sırasında oluşanNAPQI metaboliti neden olmaktadır. Toksik hasar özellikle sentrilobüler bölgedegerçekleşmektedir. NAPQI oluşumu APAP-GSH konjugatı oluşumunda hız sınırlayıcıbasamak olarak rol oynamaktadır. CYP450 enzimlerinin özellikle sentrilobüler bölgedeyüksek derişimde bulunması bölgesel toksisitenin oluşumunda NAPQI oluşumunun, düşükGSH derişiminden daha önemli olduğunu düşündürmektedir (20). Sülfasyonreaksiyonlarının periportal bölgede daha etkin olması ve glukuronidasyon reaksiyonlarının8

hem periportal hem de sentrilobüler bölgede gerçekleşmesi bölgesel toksisite oluşumundabu reaksiyonların belirleyici rol oynayabileceğini göstermektedir.Karaciğer toksisitesi oluşumunda birçok neden ortaya atılmıştır. Bunlar oksidatif stresinartması, oksidatif stres-ilintili lipit peroksidasyonu, NAPQI‟nın proteinlere ve lipitlerekovalan bağlanması ve nükleer etkilerdir (20).Oksidatif stres mekanizmasının APAP toksisitesinde önemli rol oynadığı kabuledilmektedir. APAP‟ın NAPQI‟ya oksidasyonunda artış, O ∙- 2 ve hidrojen peroksit (H 2 O 2 )oluşumunda artışla sonuçlanmaktadır. NAPQI‟nın yüksek oksidatif kapasitesi nedeniyleoluşan tiyol oksidasyonunun karaciğer toksisitesinin ana nedeni olabileceğidüşünülmektedir. NAPQI‟nın GSH‟ı okside etmesi sonucu hücede GSH/GSSG oranı veayrıca NADPH/NADP + oranı azalmaktadır. GSH derişiminde bu azalma, GPx enzimaktivitesinde azalma ve/veya kayıpla sonuçlanmaktadır. NAPQI ile proteinlerin sülfidrilgruplarının oksidasyonu ile protein-protein ve protein-GSH arasında disülfit köprülerioluşmaktadır. NAPQI ve proteinler arasındaki bu kovalan bağlanma hücrefonksiyonlarında kayıp ve hücre ölümüne neden olmaktadır.APAP toksisitesi nedeniyle oluşan oksidatif stresle lipit peroksidasyonu eş zamanlıgelişebilmektedir. APAP‟ın CYP450 ile metabolizasyonu, NAPQI ve O 2 • - oluşumuylasonuçlanmaktadır. O 2 • - derişimindeki artışı H 2 O 2 ve buna bağlı olarak OH • oluşumundakiartış takip eder. Bu oluşan OH ∙ lipitlerle reaksiyona girerek lipit peroksidasyonunubaşlatmaktadır (20).NAPQI hücresel proteinlere kovalan bağlanmaktadır. Öncelikli hedeflerinin mitokondrialproteinler olduğu düşünülmektedir (20). Yapılan çalışmalar sonucu 20‟den fazla NAPQIile bağlanan protein tanımlanmıştır. Bu proteinlerden bazıları, sitozolik N-10-formiltetrahidrofolat dehidrogenaz, mikrozomal glutatyon transferaz, mitokondridebulunan glutamat dehidrogenaz, karbomoil fosfat sentetaz I ve aldehit dehidrogenaz‟dır.Fareler üzerinde yapılan bir çalışmada toksik doz APAP uygulamasını takiben 2 saat içindeN-10- formiltetrahidrofolat dehidrogenaz enziminde % 20 ve glutamat dehidrogenaz enzimaktivitesinde % 25 azalma rapor edilmiştir (26).9

Deneysel çalışmalar sonucu APAP toksisitesinin nükleer etkilere de neden olduğugösterilmiştir. Yüksek doz APAP uygulamasının DNA‟yı etkileyerek apoptozise nedenolabileceği düşünülmektedir (20).Makrofaj aktivasyonunun da APAP toksisitesinde rol oynadığı son dönemlerde yapılanaraştırmalar sonucu gösterilmiştir. Kuppfer hücreleri fagositik makrofajlar olup, aktiveolunca sinyal molekülleri (hidrolitik enzimler, nitrik oksit, O 2 ∙ - gibi) salınımına nedenolmaktadırlar. APAP toksisitesi sırasında interlökin-1 (IL-1), interlökin-6 (IL-6) ve tümörnekroz faktör- TNF- salınımında artış gösterilmiştir. James ve ark. APAP toksisitesiyaptıkları farelerde sentrilobüler bölgede nitrotirozin oluşumu olduğunu tespit etmişlerdir.Nitrotirozin, peroksinitrit (ONOO - ) ve tirozinin reaksiyonu sonucunda oluşmaktadır. Nitrikoksit (NO) ve O 2 ∙ - çok hızlı etkileşerek peroksinitrit oluşumuna neden olmaktadırlar. Jamesve ark. yaptıkları çalışmada, O 2 ∙ - ‟in NO varlığında hızla peroksinitrit oluşturarakproteinleri nitratladığını, ancak ortamda NO bulunmadığı durumda lipit peroksidasyonunaneden olduğunu bulmuşlardır (Şekil 2.3) (20,26).ġekil 2.3. APAP aracılı hepatotoksisitenin moleküler mekanizması (20)(LPO; lipit peroksidasyonu. MPT: mitokondrial geçirgenlik değişimi)10

Böbrek ToksisitesiYüksek doz APAP‟ın sonrasında oluşan böbrek toksisitesinde prostoglandin endoperoksitsentaz (PGES), N-deasetilaz ve CYP450 enzimlerinin rol oynadığı düşünülmektedir.Toksik hasar genellikle proksimal tubüllerde gelişmekte olup glomerüler filtrasyon hızıbelirgin olarak azalmaktadır (20).PGES‟ın APAP‟a ilgisinin çok fazla olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle terapötikdozlarda APAP‟ın nefrotoksik metaboliti olan NAPQI ve N- asetil-p-benzosemikuinoimin(NAPSQI) oluşumuna neden olmaktadır. Sıçanlarda renal ve hepatik mikrozomlarda,APAP deasetilasyonla p-aminofenole dönüşmektedir. p-aminofenol PGES enzimininkatalizlediği reaksiyonla p-aminofenoksi radikalini oluşturmaktadır. Bu radikal 1,4-benzokuinoimin molekülüne dönüşmekte ve hücresel makromoleküllere kovalanbağlanabilmektedir (20).APAP kaynaklı nefrotoksisite gelişiminde CYP450 ile oksidasyonu ve GSH kaynaklıkonjugatları önemli rol oynamaktadır. Karaciğer ve böbrekte CYP450 enzimleri farklılıkgöstermesine rağmen, APAP‟ın NAPQI oksidasyonunu katalizleyen CYP450 aktivitesibenzerdir. Böbrek toksisitesi gelişiminde CYP2E1 enziminin önemli rol oynadığıdüşünülmektedir. Hu ve ark., yaptıkları çalışmada farelerde testosteron uygulamasınınAPAP bağlı renal toksisiteyi azalttığını göstermişlerdir (27). Testosteronun CYP2E1‟iindükleyerek bu etkiye neden olabileceği düşünülmektedir.Nefrotoksisiteye neden olan GSH kaynaklı APAP konjugatının APAP-Cys olabiliceğiyapılan çalışmalarla gösterilmiştir. APAP-Cys -glutamil transpeptidaz ( -GT)metabolizmasının ürünü olup, idrardaki major APAP metabolitidir. APAP-Cys uygulamasıyapılan bir çalışmada erkek CD-1 farelerde renal GSH düzeyinde azalma saptanmıştır.APAP-Cys renal GSH‟ı azaltarak nefrotoksisiteye neden olabilmektedir. NAPQI hücreselGSH ile renal proksimal tubül hücresinde konjuge edilerek oluşan konjugat tubüler lümenegeçmekte ve lumina yüzeyde yer alan enzimlerce ( -GT ve dipeptidaz) APAP-Cys‟edönüştürülmektedir. APAP-Cys bir -glutamil alıcısı gibi davranarak -Glu- Cys-APAPoluşturmakta ve bu nedenle GSH katabolizmasını artırmaktadır (Şekil 2.4). Sonuç olarakrenal GSH‟un tüketilmesine neden olmaktadır (20, 28, 29).11

ġekil 2.4. Böbrekte GSH kaynaklı APAP-Cys oluşumu ve nefrotoksisite (26)(DP: dipeptidaz, 5-ox: 5-oksoprolinaz, -GT: - glutamil transpeptidaz -GCS: -glutamilsistein sentetaz)2.2. Oksidatif StresOrganizmada gerçekleşen çeşitli tepkimelerde reaktif oksijen türleri (ROS) olarakadlandırılan yüksek oksitleme yetisine sahip moleküller üretilmektedir. ROS düşükderişimlerde hücresel sinyal sistemlerinde fonksiyon gösterirken, yüksek derişimlerdenükleik asit, lipit ve protein hasarına neden olmaktadır. Bu oksidan moleküllerin etkilerinekarşı organizma antioksidan savunma mekanizmaları geliştirmiştir. Antioksidanmekanizmalar, enzimatik ve non-enzimatik antioksidanlardan oluşmaktadır. SOD, GPx,katalaz, GR gibi enzimler ve GSH, vitamin E, vitamin C, flavanoidler gibi non-enzimatikendojen ve ekzojen molekülleri içermektedir. ROS ve antioksidan mekanizmalar fizyolojikşartlarda denge halinde bulunmaktadır (Şekil 2.5). ROS oluşumundaki artış ve/veyaantioksidan mekanizmalarda azalma bu dengeyi bozarak oksidatif strese neden olmaktadır.Oksidatif stres, kanser, diyabet, ateroskleroz, inflamatuar hastalıklar ve nörodejeneratifhastalıkların patogenezinde rol oynamaktadır (30,31).12

ġekil 2.5. Reaktif oksijen moleküllerinin oluşumu ve endojen antioksidanlar2.2.1. Lipit PeroksidasyonuLipit peroksidasyonu ROS aracılı hücre hasarının en önemli sonuçlarından biridir.Fizyolojik şartlar altında düşük hızda gerçekleşen lipit peroksidasyonunun oksidanlar veoksidatif stres ile oluşum hızı artabilmektedir. Lipit peroksidasyonunun en önemli hedefiçoklu doymamış yağ asidi (PUFA) içeriği fazla olan membran fosfolipitleridir. PUFA‟larve metabolitleri enerjinin sağlanması, hücre içi sinyal oluşumu ve gen ekspresyonunundüzenlenmesi gibi önemli fizyolojik rollere sahiptir. Bu nedenle lipit peroksidasyonumembran lipit tabakasının fizyolojik yapısını değiştirerek hücresel işlev kaybına nedenolabilmektedir.Peroksidasyon başlangıç, ilerleme ve sonlanma olmak üzere üç evrede gerçekleşmekte ve4-hidroksinonenal (4-HNE), malondialdehit (MDA), akrolein, glikoksal gibi oldukçatoksik aldehit yapıda ürünlerin oluşumuyla sonuçlanmaktadır (Şekil 2.6). Bu aldehitlerçok düşük veya nontoksik derişimlerde sinyal oluşumu, gen ekspresyonu, hücreproliferasyonu gibi önemli hücre fonksiyonlarını düzenleyici etki gösterebilmektedir. Bunakarşın yüksek derişimlerde hücresel proteinlerle reaksiyona girerek protein işlev13

ozukluğuna ve hücresel yanıtta değişime neden olabilmektedir. Yaygın olaraktanımlanmış toksik aldehitlerden biri MDA olup, araşidonik asit, eikozapentaenoik asit vedeksohekzaenoik asit peroksidasyonu sırasında oluşmaktadır. MDA, lizin residüleri ileetkileşerek düşük dansiteli lipoprotein (LDL) modifikasyonunda önemli rol oynamaktaolup, DNA ile etkileşimi sonrası mutasyonlara neden olabildiği yapılan çalışmalardagösterilmiştir (32 - 34).ġekil 2.6. Lipit peroksidasyonu ve ürünleri2.2.2. GlutatyonGSH ( -glutamilsisteinilglisin), glutamin, glisin, ve sisteinden sentezlenen bir tripeptitdir.En yüksek derişimi karaciğerde olmasına rağmen tüm hücrelerde bulunmaktadır. Bunedenle GSH homeostazında karaciğer önemli rol oynamaktadır. Glutatyon sentezi,sırasıyla -glutamilsistein sentetaz ve glutatyon sentetaz‟ın katalizlediği reaksiyonlarlasitozolde gerçekleşir. -glutamilsistein sentazın katalizlediği reaksiyon glutatyon sentezininhız sınırlayıcı basamağıdır (35).Glutatyon, redükte glutatyon (GSH) ve okside glutatyon (GSSG) olmak üzere iki formdabulunmaktadır. Redükte olan form hücrede baskın olan formdur. Hücre glutatyonunun%80-85‟i sitozolde, % 10-15‟i mitokondride ve çok az bir kısmı endoplazmik retikulumdabulunmaktadır. Mitokondrial GSH hücre için esansiyeldir. Glutatyon sentezi için gerekli14

enzimler mitokondride bulunmadığı için mitokondri GSH‟ı sitozolden sağlanmaktadır.Glutatyon transport kapasitesine sahip iki antiport taşıyıcı protein tanımlanmıştır. Bunlardikarboksilat taşıyıcı protein ve 2-oksoglutarat taşıyıcı protein‟dir (30, 36).Glutatyon hücre için en önemli antioksidan olmasının yanında, detoksifikasyon, redoksdurumunun düzenlenmesi, immün yanıt ve hücre farklılaşması gibi birçok hücre işlevininkontrolünde önemli rollere sahiptir.Glutatyonun işlevi ksenobiyotik ve/veya metabolitlerinin detoksifikasyonununsağlanmasında önemli rol oynamaktadır. Bu metabolitler spontan veya glutatyon-Stransferaz(GST)‟ ın katalizlediği reaksiyonlarla konjugat oluşturur. Hücre dışına taşınankonjugattan -glutamiltranspeptidaz ( -GT) enzimi ile -glutamil grubu, dipeptidaz enzimiile glisin yapıdan uzaklaştırılır. Sistein konjugatının N-asetilasyonla merkaptürik asitoluşturması sonucu detoksifikasyon süreci sonuçlanır (Şekil 2.7).GSH konjugatının merkaptürik asite metabolize edilmesi barsak, safra kanalları veböbrekte başlarken, N-asetilasyon basamağı böbrekte gerçekleşmektedir (36).ġekil 2.7. GSH aracılı detoksifikasyon mekanizması (35)Glutatyon protein olmayan tek tiyoldür ve hücre içi tiyol dengesinin, redoks durumununana belirleyicisidir. Ayrıca GSH/GSSG, NADP + /NADPH ve tiyoredoksin(TrxSS/Trx(SH) 2 ) gibi çiftler hücre içinde redoks ortamın sağlanmasına yardımcıolmaktadır. GSH derişimi diğerlerine göre 100 - 10000 kat daha fazla olduğu için redoks15

durumunun belirlenmesinde önemli rol oynamaktadır. GSH derişiminin yanındaGSH/GSSG molar oranı da redoks potansiyelinde belirleyicidir. Orta şiddette bir oksidatifstres sırasında GSH/GSSG oranı değişmeksizin GSH tüketilmekte ve GSSG‟nin GSH‟aindirgenmesi yolu ile redoks potansiyeli korunmaktadır. Hücre içi GSH havuzu farklıhücrelere göre değişim göstermektedir. Örneğin hepatositte yaklaşık 10 mM iken nöronGSH derişimi yalnızca 1mM‟dır. Bu nedenle hepatositin redoks kapasitesi nörona göredaha fazladır. Hücredeki enzimlerin aktiviteleri, sinyal oluşumu gibi birçok işlevingerçekleşmesi hücre içi tiyol düzeyine bağlıdır. Tiyol transferazın katalizlediği reaksiyonlaGSH ile protein arasında tiyol-disülfit değişimi gerçekleşmektedir:Bu reaksiyon tersinir olup, hücre içi GSH ve GSSG derişimlerine bağlıdır. Fizyolojikşartlarda hücresel GSSG içeriği çok düşük olduğu için protein disülfit oluşumu dasınırlıdır.Şiddetli oksidatif stres sırasında oluşan ROS, lipit peroksidasyonu ve hücre hasarına nedenolmaktadır ve oluşan H 2 O 2 ve organik peroksitler GSH ile indirgenmektedir. H 2 O 2 ‟inindirgenmesinde peroksizomlarda katalaz enzimi işlev görmektedir. Mitokondride katalazbulunmadığı için mitokandrial oksidatif strese karşı korunmada GSH çok önemli roloynamaktadır. Şiddetli oksidatif stres durumunda GSH azalırken GSSG derişimi artar.Artan GSSG ya aktif olarak hücreden uzaklaştırılmakta ya da proteinlerin sülfidrilgruplarıyla etkileşerek protein disülfit oluşumuna yol açmaktadır (Şekil 2.8). Şiddetlioksidatif stres hücresel GSH tüketimi ile sonuçlanmaktadır.ġekil 2.8. GSH‟ın antioksidan işlevi (35)16

Glutatyonun en önemli görevlerinden biri de sistein deposu olmasıdır. Sistein hücre dışıortamda kararsızdır ve hızlıca sistine okside olmaktadır. GSH‟ın sistein kaynağı olarakişlev göstermesi -glutamil döngüsü ile sağlanmaktadır (Şekil 2.9). -glutamil döngüsü enfazla böbrekte olmak üzere, karaciğer ve diğer bazı dokularda fonksiyon göstermektedir(35,36).ġekil 2.9. -Glutamil döngüsü2.2.3. Süperoksit DismutazSüperoksit dismutaz enzimi (SOD, EC1.15.1.1), en etkin hücre içi antioksidanlardanbiridir. SOD, oldukça reaktif olan süperoksitin, oksijen ve daha az reaktif bir tür olanH 2 O 2 ‟e dismutasyonunu katalizler.Bir metalloenzim olan SOD‟un insanlarda 3 izozimi tanımlanmıştır. Bunlar; sitozolikCu,Zn-SOD, mitokondrial Mn-SOD ve ekstraselüler SOD‟tur. Cu,Zn-SOD, molekülerağırlığı 32 kDa olup iki benzer alt birimden oluşmaktadır. Her alt birim Cu ve Zn içeren biraktif bölgeye sahiptir. Mn-SOD, homotetramerik olup (96 kDa) her alt birimi bir tane Mnatomu içermektedir. Ekstraselüler SOD, tetramerik, salgısal, Cu ve Zn içeren birglikoproteindir. Heparin ve heparan sülfat gibi bazı glikozaminoglikanlara yüksek ilgi17

göstermektedir. Memeli hücresinde bu izozimin kontrolü sitokinlerle düzenlenmektedir.Son dönemlerde streptomiçesler ve siyanobakterlerde 117 aminoasitten oluşan küçük birprotein olan Ni-SOD da tanımlanmıştır (37, 38).2.2.4. Glutatyon PeroksidazGPx (EC1.11.1.9), H 2 O 2 ‟in veya organik hidroperoksitlerin su veya alkole indirgenmesinikatalizleyen enzimdir.Selenyum bağımlı GPx‟lerin aktif bölgesinde bir selenosistein residüsü bulunmakta olupenzimin aktivitesi için esansiyeldir. GPx enzim ailesi aminoasit sekansı, substrat özgüllüğüve subselüler lokalizasyonuna göre 6 alt sınıfa ayrılmıştır:GPx-1: İlk tanımlanan GPx enzimidir. Sitozolik ve mitokondrial olup özellikleeritrosit, böbrek ve karaciğer en fazla bulunduğu yerlerdir.GPx-2: Sitozoliktir. Gastrointestinal sistem ve böbrek dokularında tespitedilmiştir.GPx-3: Ekstraselüler olup, gastrointestinal sistem ve böbrek dokularında tespitedilmiştir.GPx-4: Hem sitozol hem de membran yerleşimli olup renal epitel hücresi vetestislerde ekspresyonu çok fazla gerçekleşmektedir.GPx-5: Epididimal dokuda bulunmaktadır.GPx-6: Olfaktor epitelyum dokusunda tanımlanmışlardır.GPx-5 ve GPx-6 hariç diğer GPx enzimleri selenyum bağımlı enzimlerdir (38,39).18

2.2.5. ParaoksanazlarParaoksonazlar (PON1, PON2 ve PON3), HDL ile ilişkili enzimler olup, PON genleriinsanda 7. kromozomda, farede 6. kromozom uzun kolunda yer almaktadır. Karaciğerdesentezlenip plazmaya salınan PON1, çeşitli organofosforlu insektisitlerin, (paratyon,diazinon gibi) ve sarin, somon gibi sinir ajanlarının hidrolizini katalizlemektedir. Ayrıcaalifatik ve aromatik laktonların ve s-y-hidroksikarboksilik asitlerin laktonizasyonunukatalizler (40,41).PON1‟in fizyolojik fonksiyonu, spesifik okside lipitleri hidroliz etme işlevidir. PON2,karaciğer, böbrek, testis, beyin gibi birçok dokuda, PON3 ise karaciğerde ve çok azmiktarda böbrekte sentezlenmektedir. PON2 ve PON3‟ün paraoksonaz ve arilesterazaktiviteleri sınırlı olup aromatik ve uzun zincirli alifatik laktonları hidroliz aktiviteleriPON1‟e benzemektedir. Paraoksonaz ailesine ait 3 enzimin de LDL ve yüksek dansitelilipoprotein (HDL)‟deki lipitleri oksidasyondan koruma kapasitesi bulunmaktadır. PON1‟inbüyük kısmı HDL, % 5‟den azı VLDL ve şilomikronlarla ilişkili olup, LDL ile ilişkisigösterilememiştir. Diğer paraoksonazlardan farklı olarak PON2 ise HDL ile ilişkilideğildir. Yapılan çalışmalarda PON1‟in aterosklerotik lezyonlarda ve ox-LDL‟dekifosfolipitlerin ve/veya spesifik kalıntıların hidrolizi ile ateroskleroza karşı koruyucu etkisiolduğu gösterilmiştir (42).PON1‟in katalitik bölgesinde bulunan 2 tane kalsiyum atomunun (Ca 1ve Ca 2) hidrolitikaktivitesi için gerekli olduğu gösterilmiştir. PON1‟in yapısındaki 3 sisteinden biri olanserbest sistein, oksidasyona karşı LDL‟yi korumada PON1 aktivitesi için esansiyeldir (43).PON1 enzimi membranın dış yüzeyinde lokalize olup, membrandan salınımı için bir alıcıgereklidir. En uygun alıcı lipit kompleksi olup, PON1 için bunun HDL olduğudüşünülmektedir. HDL ile hücre membranının etkileşimi sırasında HDL‟ye reseptör aracılıtransfer edilmektedir (Şekil 2.10). PON1 lipitlere karşı antioksidan role sahip olup, HDLiçinde etki göstermektedir. HDL, serumda okside lipitlerin primer taşıyıcısıdır. PON1‟inantioksidan etkisi için HDL ve okside lipitler arasında etkileşim gereklidir.19

.ġekil 2.10. PON1‟in hücreden HDL aracılı salınımı (42)PON2 ve PON3‟ün oksidatif strese karşı koruyucu olduğu gösterilmiştir. Buna karşınPON2 serumda bulunmadığı için hücresel düzeyde etki göstermektedir. Oksidatif stresvarlığında serum PON1 ve PON3 inaktive olurken, makrofaj PON2 gen ekspresyon veaktivitesinde artış olduğu gösterilmiştir. Bunun oksidatif strese karşı uyum sağlayıcı birmekanizma olduğu düşünülmektedir (42,44).2.2.6. Hepatotoksisite ve Oksidatif StresKaraciğer birçok ilacın ve ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu ve metabolizmasında çokönemli rol oynamaktadır. Biyolojik toksinler ve medikal ajanlar, hepatik metabolizmalarısırasında ROS üretiminde artışa yol açmakta ve buna ikincil protein, lipit,karbonhidratlarda hasar oluşturarak hepatik hücre biyokimyasal işlevlerinibozabilmektedir. Bu nedenle anikterik subklinik bozukluktan şiddetli nekroinflamatuarhepatite kadar uzanan hepatotoksisiteye neden olmaktadır. Ortaya çıkan hepatotoksisiteninderecesi ksenobiyotiklere maruz kalınan süreye, doza ve antioksidan mekanizmalara bağlıolarak değişmektedir.Suda çözünen ksenobiyotikler değişikliğe uğramadan safra ve idrar yolu ile hızlauzaklaştırılırken, yağda çözünebilenler ise hidrofilik özellik kazanmak üzerebiyotransformasyona uğramaktadır. Bu biyotransformasyonda özellikle hepatikmetabolizma önemli role sahiptir. Biyotransformasyon faz I ve faz II olmak üzere ikişekilde gerçekleşmektedir. Faz I‟ de bileşikler enzimatik oksidasyon, redüksiyon vehidrolize uğramakta ve oluşan biyolojik metabolitler idrar yolu ile uzaklaştırılmaktadır. Bu20

metabolik süreçte CYP450 enzim ailesinin dahil olduğu mikrozomal karma fonksiyonluoksidaz sistemi önemlidir (Şekil 2.11). Bu sırada oluşan oldukça reaktif olan toksik araürünler, DNA, lipit ve proteinlerle etkileşebilmektedir. Faz II biyotransformasyonu ileksenobiyotiklerin hidrofilitesi arttırılmaktadır. Enzimatik glukuronidasyon, sülfasyon,asetilasyon, metilasyon ve GSH konjugasyonu ile suda çözünebilen, daha az toksikmetabolitler oluşmaktadır. Ksenobiyotiklere toksik dozda maruziyet, hepatik GSH derişimive diğer karaciğer antioksidan düzeylerinde azalmaya neden olabilmektedir.ġekil 2.11. Hepatik CYP450 sistemi ve detoksifikasyonAPAP toksik dozlarda alındığında toksik hepatik nekroza neden olabilmektedir. Nekrozabağlı olarak serum transaminazlarında 50-500 kat artış gözlenmektedir. APAPmetabolizması sırasında kararsız ve oldukça toksik olan NAPQI metaboliti oluşmakta vehızla GSH ile konjugasyona uğrayarak inaktive edilmektedir. Aşırı NAPQI oluşumu GSHda tükenmeye neden olmakta ve makromoleküllerle etkileşerek hasar oluşturabilmektedir(45).Feng-Lin Yen ve ark‟ları sıçanlar üzerinde yaptıkları bir çalışmada APAP uygulamasınınAST, ALT, ALP aktivitesinde belirgin artışa, SOD, GPx ve katalaz aktivitelerinde iseazalmaya neden olduğunu göstermişlerdir. Bir başka çalışmada ise farelere yüksek dozAPAP uygulaması sentrilobüler hepatik nekrozla sonuçlanmış ve serumaminotransferazlarında anlamlı artışa neden olmuştur. Bu artışın hepatik GSH ve Cu,Zn-SOD aktivitesinda azalmayla ilişkili olduğunu gözlemlemişlerdir (46,47).2.2.7. Nefrotoksisite ve Oksidatif StresOksidatif stres akut böbrek yetmezliği, obstrüktif nefropati, glomerüler hasar ve kronikböbrek yetmezliğine kadar değişebilen renal hasarın patogenezinde önemli roloynamaktadır. Oksidatif stres nedeniyle tubül ve glomerüllerin yapısında ve fonksiyonunda21

değişiklikler meydana gelebilmektedir. Özellikle glomerüller diğer nefron segmentlerinegöre oksidatif hasara karşı daha fazla duyarlılığa sahiptir (48).Okside LDL ve nativ formunun oksidatif stres aracılı glomerüler hasarda rol oynadığıyapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Okside LDL endotelial ve mezenşimal hücredeapopitozu aktive etmekte buna karşın bu etki antioksidanlarla önlenebilmektedir. OksideLDL maruziyetinin mezenşimal hücrede DNA sentezi ve hücre proliferasyonunda artışaneden olduğu gösterilmiştir. Katalaz, SOD, GPx gibi antioksidanlar LDL‟nin bu etkisiniinhibe edebilmektedir. Oksidatif stres nedeniyle sitokinler, kemokinler gibi medyatörlerinsalınımı ROS oluşumunda ve glomerüler hasarda artışa neden olmaktadır. Bu medyatörlernedeniyle glomerül mezenşimal endotel hücresinde ve proksimal tubül hücresindeinflamasyon oluşabilmektedir. Nükleer faktör B (NF- B), proinflamatuar genekspresyonunun en önemli düzenleyicilerinden biridir. Mezenşimal hücrede ROS artışı ileNF- B aktivasyonu uyarılabilmektedir.Glomerül geçirgenliğinde bozukluk nedeniyle okside LDL, geçiş metalleri, hemoglobin vemyoglobin geçişi artmaktadır. Okside LDL prooksidan bir ortam sağlayarak hemoksijenazenzimini aktive edebilmektedir. Myoglobinüri sırasında tubül hücresinde H 2 O 2 artışı veGSH düzeyinde dramatik bir azalma gözlemlenmiştir. Renal korteks intersitisyal boşluktamakrofaj birikimi tubüler hasar gelişiminde patojenik rol oynamaktadır. Proksimal tubülerepitelyal hücrelerde, anatomik pozisyonları ve kemotaktik sitokinler, kemokinler, diğerinflamatuar medyatör salınım yetenekleri nedeniyle intersitisyal makrofaj infiltrasyonuoluştuğu düşünülmektedir. ROS oluşumu tubül epitel hücresinde bu medyatörlerin genekspresyonunu indükleyebilmekte ve bu lökosit birikimiyle sonuçlanmaktadır. Yapılan birçalışmada renal tubüler hücresinde monosit kemoatraktant protein 1(MCP-1), makrofajinflamatuar protein 1(MIP-1) gibi kemokin ekspresyonunun monosit, makrofaj ve Tlenfosit içeren infiltrant oluşumundan önce meydana geldiği gösterilmiştir.Tubüler epitel hücresinde oluşan inflamatuar yanıtın en önemli düzenleyicisi NF- B olupçeşitli antioksidanlarla inhibe edilebilmektedir. TGF- (tumor growth factor),tubulointersitisyal boşluktaki fibroz ve ekspansiyonda önemli rol oynamakta olup, Shi veark. polifenoller ile TGF- ekspresyonunun inhibe edilebildiğini göstermişlerdir. TNFrenaltubüler hücresinden sekrete edilmekte ve renal intersitisyumda inflamatuar hücrelerinbirikiminde rol oynamaktadır (48).22

2.3. KatekinlerKatekinler, flavanoidlerin alt grubu olan flavanol ailesinin üyesi polifenolik bileşiklerdir.Flavanoidler bitkisel kaynaklı bileşikler olup, birçok yiyecekte bulunmaktadır. Çay,dünyada sudan sonra en sık tüketilen içecek olup, katekinler, tiyaflavinler, tiyorubiginlergibi polifenoller açısından oldukça zengindir. Dünyada çay tüketiminin % 20‟si yeşil çayolup, yeşil çayın polifenol içeriğinin büyük kısmını katekinler oluşturmaktadır.Günümüzde birçok klinik ve deneysel çalışmalarda yeşil çayın antiaterojenik,antikarsinojenik, antioksidatif etkilere neden olduğu, bu etkilerin polifenol içeriğindenkaynaklandığı ileri sürülmektedir (49, 50, 51). Buna karşın, katekinlerin prooksidan etkiside bulunmakta olup, toksik veya koruyucu etki göstermesinde uygulanan dozun veuygulama yolunun belirleyici olduğu ileri sürülmektedir (12, 13).2.3.1. Kimyasal ÖzellikleriYeşil çay içeriğinin % 70‟ini katekinler, % 20‟sini polimerik flavonoidler, %10‟unu iseminor flavanoller (kuarsetin, miresetin) oluşturmaktadır. Yeşil çayda bulunan en önemlidört katekin grubu, epikatekin (EC), epikatekin gallat (ECG), epigallokatekin (EGC) veepigallokatekin-3-gallat (EGCG)‟dır. Ayrıca eser miktarda olmak üzere, katekin (C) vegallokatekin (GC) bulunmaktadır (Şekil 2.12). EGCG, yeşil çaydaki en önemli katekinolup, katekin içeriğinin % 50-80‟nini oluşturmaktadır.Katekinler, A halkasında meta-5,7-dihidroksil ve B halkasında di veya tri-hidroksilgruplarıyla karakterizedir. EC, B halkasında 3‟ ve 4‟ karbonlarında orto-hidroksil, EGC iseB halkasında tri-hidroksil grubu içermektedir. ECG‟nin B halkasında, di-hidroksil grubu veC halkası 3. karbonuna bağlı gallat grubu bulunmaktadır. EGCG ise B halkasında trihidroksilve C halkasında gallat grubu içermektedir. EGCG ve ECG‟deki gallat halkasıantioksidan aktivitelerini arttırmaktadır (7, 8, 51).23

ġekil 2.12. Çay katekinlerinin yapısı (8)2.3.2. Emilim ve Doku DağılımıKatekinlerin esas emilimi ince barsak düzeyinde gerçekleşmektedir. Normal emilim,tüketimden 4 saat sonra başlamaktadır ve 14-16 saat sonra plazmada görülmektedir.Yapılan bir çalışmada 28 gün boyunca sıçanların içme sularına % 0,6 yeşil çay özütüeklenerek katekinlerin doku dağılımı incelenmiştir. EGC ve EC böbrek, ösafagus, kalınbarsak, akciğer, prostat dokusunda yüksek derişimde, karaciğer ve tiroid dokusunda dahadüşük derişimde bulunmuştur. EGCG ise ösafagus ve kalın barsakta diğer dokulara göredaha yüksek derişimde bulunmuştur. Bu durum EGCG‟nin sistemik biyoyararlanımınındaha düşük düzeyde olduğunu göstermektedir. Aynı çalışma farelerde de yapılmış olup,EGCG‟nin en yüksek derişiminin akciğer dokusunda bulunduğu görülmüştür (7).Çay flavanollerinin sınırlı biyoyararlanımları, moleküler ağırlığa ve etkin molekülerbüyüklüğe bağlıdır. Flavanollerin moleküler büyüklüğünü, hidrojen bağı yaparak büyükbir hidrasyon kabuğu oluşturan hidroksil grupları belirlemektedir (52).2.3.3. MetabolizmasıYeşil çay polifenolleri başlıca metilasyon, glukuronidasyon, sülfasyon ve halka-füzyonreaksiyonları ile metabolize edilmektedir.EGCG ve EGC, katekol-O-metiltransferaz (COMT) enzimi ile metilasyona uğramaktadır.Metilasyon sonucunda EGC‟den 4'-O-metil EGC, EGCG‟den ise 4'-O-metil EGCG ve 4'-4''-O-metil EGCG oluşmaktadır. Yapılan çalışmalarda sıçan karaciğer sitozolünün COMT24

aktivitesinin fare ve insan karaciğer sitozollerindeki aktiviteden daha yüksek olduğugösterilmiştir. EGCG‟nin düşük derişimlerdeki başlıca metilasyon ürünlerini dimetillenmişformu oluştururken, yüksek derişimlerde monometillenmiş formu oluşturmaktadır.EGCG-4''-O-glukronid, insan, fare ve sıçan mikrozomlarında oluşan başlıca metabolitdir.İnsanlarda glukuronidasyon sırasında en fazla aktiviteyi UGT1A1, 1A8 ve 1A9 enzimlerigöstermektedir. UGT1A8, intestinal spesifik isoform olup en yüksek katalitik aktiviteyesahiptir. EGC-3'-O-glukronid fare, insan ve sıçan karaciğer mikrozomlarında oluşanmetabolitdir. EGC‟nin glukronidasyonunda karaciğer mikrozomlarının etkinliği intestinalmikrozomlarından daha yüksek bulunmuştur.EC, insan, sıçan ve fare sitozolünde sülfasyona uğramakta ve en etkin sülfasyon insankaraciğerinde gerçekleşmektedir. İnsan karaciğer sitozolünde sülfotransferaz 1A1 ve 1A3işlev göstermekte olup en yüksek aktivite sülfotransferaz 1A1‟de gösterilmiştir. EGCG dezaman- ve doz-bağımlı insan, fare ve sıçan karaciğer sitozollerinde sülfasyonauğramaktadır. Burada da en yüksek aktiviteye sıçanlarda rastlanmıştır (Tablo 2.1) (53).Tablo 2.1. Katekinlerin metabolizması (7)Katekin Sistem Metabolik yol MetabolitECSıçan karaciğer sitozolİnsan karaciğer ve jejunal sitozolO- metilasyonO- sülfasyonO-metil-ECEC-O-sülfatECGSıçan karaciğer sitozolİnsan plasental sitozol4”-O-metilasyonO-metilasyon4”-O-metil ECGO- metil ECGEGCKaraciğer mikrozomu(insan, sıçan, fare)4‟-O-metilasyon3‟- O-glukronidasyon4‟-O- metil EGCEGC- 3‟-O-glukronidEGCGKaraciğer mikrozomu(insan, sıçan, fare)4”-O-metilasyon3‟- O-glukronidasyon4”-O-glukronidasyon7-O-metilglukronidasyon4”-O-metilEGCGEGCG -3‟-O-glukronidEGCG -4”-O-glukronidEGCG -7- glukronidSıçan karaciğer sitozolO -metilasyonO-metil EGCGTükrük (insan)Ester hidrolizEGC + Gallik asit25

EGCG‟nin toksik dozlarda EGCG-2''-sistein ve EGCG-2'-sistein olmak üzere iki bileşikoluşturduğu gösterilmiştir. EGCG‟nin kinon veya semikinona okside olduğu ve sisteininsülfidril grubuyla etkileşime girerek bu metabolitleri oluşturduğu düşünülmektedir(51,53).Emilmeyen epikatekinler ve onun konjuge metabolitleri kolonda bakteriler tarafındanyıkılmaktadır. Li ve ark. oral kafeinsizleştirilmiş yeşil çay tüketimi sonrası insan plazmave idrarında çay katekinlerinin belirli halka füzyon ürünlerini tanımlamışlardır. Bubileşikler; 5-(3',4',5'-trihidroksilfenil)-γ-valerolakton (M4), 5-(3',4'-dihidroksilfenil)-γvalerolakton(M6), 5-(3',5'-dihidroksilfenil)-γ-valerolakton (M6„) olup kolondakimikrobiyal aktivite sonucunda oluşmaktadırlar (Şekil 2.13). Aynı zamanda insan fekalmikroflorasında EC, EGC ve ECG‟nin anaerobik fermentasyonunun M4, M6, M6„oluşumuyla sonuçlandığı da gösterilmiştir (51).Aktif “effluks” veya faz III metabolizması birçok bileşiğin sınırlı biyoyararlanımı vehücresel birikimi ile ilişkilidir. Çoklu ilaç direnci ile ilişkili proteinler (MRP), ATPbağımlı “effluks” taşıyıcılardır. Birçok dokudan ve insanlarda çok sayıda kanserhücresinden sentezlenmektedirler. MRP1, hücrelerin bazolateral kenarında lokalize olupbileşikleri hücre içinden intersitisyal boşluğa taşımaktadır. MRP2, ince barsak, böbrek vekaraciğer hücresi apikal yüzeyinde bulunmakta ve bileşiklerin kan dolaşımından lümen,idrar ve safraya geçişini sağlamaktadır. MRP‟ler EGCG‟nin biyoyararlanımında etkinrole sahiptir. EGCG, portal dolaşımdan karaciğere girerek hepatosit kanalikulermembranında lokalize MRP 2 ile hücre dışına taşınır. Enterosit ve hepatosit bazolateralkenarında lokalize MRP 1 hücre içinden substratlarını intestinal boşluğa pompalar. MRP1‟in EGCG‟nin biyoyararlanımını arttırdığı düşünülmektedir. Yapılan çalışmalardaEGCG‟ nin MRP 2 ile taşınımının daha etkin olduğu ve bu yüzden EGCGbiyoyaralanımını azalttığı gösterilmiştir. MRP 1 ve 2‟nin etkinliği doku dağılımlarınabağlı olarak değişmektedir (53).EGC ve EC safra ve idrar yolu ile, EGCG ise safra yolu ile atılmaktadır. EGCG‟ninkolondaki bakterilerce metabolize edilerek oluşan daha küçük metabolitlerinin emildiğive daha sonra idrarla atıldığı düşünülmektedir (7).Yapılan in vitro çalışmalarda çay katekinlerinin uğradığı biyoransformasyonun farelerdeinsanlarla benzer özellik gösterdiği bulunmuştur (53).26

ġekil 2.13. Katekinlerin metabolizması (7)2.3.4. Katekinlerin Antioksidan EtkileriYeşil çayın polifenol içeriğinin serbest radikalleri temizleme, metal iyonlarının şelasyonuve fosfolipit tabakada, LDL‟de, eritrositlerde, epidermal mikrozomlarda, sinaptozomlardalipit peroksidasyonuna karşı antioksidan özellikleri olduğu bilinmektedir (54, 55).Katekinlerin metal iyonları ile şelasyon yapma özelliği bulunmaktadır. Bu özellikFenton, Haber-Weiss gibi reaksiyonların neden olduğu serbest radikal oluşumunuengelleyebilmektedir. Bakır ile indüklenen lipoprotein oksidasyonunun yeşil çay özütüile inhibe edildiği gösterilmiştir (51).27

Katekinler oksidasyon sonrası dimerik ürünler oluşturmakta ve bu ürünler süperoksitradikali süpürücü ve demir şelasyonunu arttırıcı etki göstermektedirler.EGCG‟nin, yapılan hücre kültürü çalışmalarında redoks duyarlı transkripsiyonfaktörlerini (NF- B, AP1 gibi) inhibe ettiği gösterilmiştir (7, 8).Katekinler doğrudan antioksidan etki göstermekle birlikte dolaylı olarak da organizmadaendojen antioksidanları arttırarak oksidatif hasarı azaltabilmektedir. Sıçanlarda, yeşil çayuygulamasının GPx, GR, SOD ve katalaz gibi antioksidan enzim aktivitelerinde artışayol açtığı gösterilmiştir. Aynı zamanda katekinler, -tokoferol ve -karoten düzeylerinide etkilemektedir. Klinik bir çalışmada 42 gün boyunca yeşil çay tüketiminin kişilerinendojen plazma antioksidan aktivitesinde artışa, plazma peroksitlerinde ve oksidatifhasarda azalmaya yol açtığı bulunmuştur (7, 8).Ksantin oksidaz enzimi pürin katabolizmasında işlev göstererek ürik asit ve ROSoluşumuna neden olmaktadır. EGCG‟nin ksantin oksidazı inhibe ederek ROS oluşumunuönlediği bildirilmiştir (8).Katekinlerin antioksidan etkileri özellikle de radikal süpürücü etkisi her katekininkimyasal yapısı ile ilişkilidir. EGCG, EGC, EC ve ECG‟nin radikal süpürücüetkinliklerinin karşılaştırıldığı birçok çalışma yapılmıştır. Sonuç olarak en etkin radikalsüpürücü katekinlerin EGCG ve ECG olduğu bulunmuştur. Her ikiside C halkası 3.pozisyonunda gallat grubuna sahip olup, bu nedenle daha güçlü antioksidan etkileresahiptirler. EGCG, ECG‟ye göre daha etkin bulunmuştur. Bunun nedeninin ise Bhalkasında 5. Pozisyonda bir hidroksil grubu bulundurması olduğu kabul edilmektedir(8).Yeşil çayın koruyucu etkilerinin yanı sıra toksik etkileri de bulunmaktadır. Bu etkininderecesi yeşil çay polifenollerinin tipine ve/veya derişimine bağlı olarak değişimgöstermektedir. Toksisitesinde ana etki, in vivo deneysel çalışmalarda yüksek dozlardakaraciğer üzerinde gösterilmiştir (56, 57). Sitotoksik etkiler, hücre redoks durumunabağlı olarak, özellikle yüksek derişimde EGCG varlığında, prooksidan etkiye ikincilolarak, mitokondrial membran potansiyelinin bozulması sonucu mitokondrial hasarınortaya çıkması ile sonuçlanmaktadır. Bu toksik etki, EGCG ≥ propilgallat > ECG > gallikasit, EGC ≥ EC şeklinde ortaya çıkmaktadır. Birçok toksik çay polifenolleri gallik asit28

içermektedir. Ayrıca yeşil çay, tümör hücrelerinde kaspaz 3 geninin delesyonuna veyayabanıl tip kaspaz 3 geninin ekspresyonuna neden olabilmektedir. Bu durum artmış yeşilçay polifenol derişimi ile ilişkilendirilmiştir (58)29

3.GEREÇ VE YÖNTEMBu çalışma Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları kullanım kurallarınauygun olarak Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Etik Kurulu‟nun 2008/ AP-765‟nolu kararıve desteğiyle gerçekleştirilmiştir.3.1. KimyasallarXanthine Oxidase 25 ünite Sigma X1875Xanthine 1 gr Sigma X4002Nitroblue Tetrazolium 50 mg Sigma N6876Etanol 2,5 L Merck 100971Na 2 CO 3 500 gr Sigma S7795EDTA 1 kg Sigma E5134BSA 50 gr Sigma A2153CuCl 2 100 gr Sigma C6917L- Glutathione reduced 5 gr Sigma G6529Glutathione reductase 100 ünite Sigma G3664Sodium azide 25 gr Sigma S8032Cumene 100 ml Aldrich 513293SOD 1500 ünite Sigma S8160Phenyl acetate 5 gr Aldrich 108723Acetaminophen 100 gr Sigma A7085Polyphenon 60 25 gr Sigma P1204EGCG 50 gr Sigma E4143K 2 HPO 4 500 gr Sigma P8281Coomasie Brillant Blue 25 gr Sigma B07702-thiobarbituric acid 25 gr Sigma T5500TCA 1 kg Merck 10081030

HCl 2,5 L Merck 100314KCl 500 gr Sigma P45041,1,3,3-tetraethoxypropane 25 ml Sigma T9889H 2 SO 4 2,5 L Merck 100713Trisma base 1 kg Sigma T1503meta-phosphoric acid 100 gr Sigma M6288NaCl 1 kg Sigma S7653Na 2 HPO 4 1 kg Sigma S7907Sodium citrate 1 kg Sigma S46412-Nitrobenzoic acid 5 gr Sigma D81303.2. Deney Hayvanları ve GruplarÇalışmada, ağırlıkları 35-48 g arasında değişen 80 adet erkek Swiss Albino farekullanıldı. Hayvanların bakım ve uygulamalarında National Academy of Sciencetarafından hazırlanan ve National Instute of Health tarafından yayınlanan “Guide for theCare and Use of Laboratory Animals” kurallarına uyulmaya özen gösterildi (59). Deneyhayvanları 12 saat aydınlık, 12 saat karanlıkta bırakıldı ve beslenmeleri standart diyet vesu (ad libitum) ile sağlandı. Uygulanacak APAP, EGCG ve Polifenon 60 dozlarınıbelirlemek için ön çalışmalar yapıldı. Ön çalışmada AST, ALT, BUN ve kreatinindüzeylerine bakılarak uygun dozlar seçildi.APAP 1000, 800 ve 600 mg/kg dozunda i.p. yolla uygulandığında hepatik toksisiteye vemortaliteye neden oldu. LD 50 dozu 550 mg/kg olarak belirlendi. EGCG ve Polifenon 60,25 ve 50 mg/kg olmak üzere 7 gün boyunca i.p. uygulandı. Serum parametreleri dikkatealınarak 25 mg/kg dozunun uygulanmasına karar verildi. Ön çalışma ile uygun dozlarseçildikten sonra deney hayvanları 6 gruba ayrıldı.31

1. Kontrol grubu: salin uygulanan grup (KONT) (n=7)2. Grup I: 550 mg /kg APAP (i.p., tek doz ) (n=7)3. Grup 2: 25 mg/ kg EGCG (i.p., 7 gün) (n=7)4. Grup 3: 25 mg/kg polifenon 60 (i.p., 7 gün) (n=8)5. Grup 4: 25 mg/kg EGCG (i.p., 7 gün) + 550 mg/kg APAP (EGCG sonrası 8.gün, i.p., tek doz ) (n=8)6. Grup 5: 25 mg/kg polifenon 60 (i.p., 7 gün) + 550 mg/kg APAP (polifenon 60 nsonrası 8. gün, i.p., tek doz) (n=7)APAP salin içinde (8 ml/kg) taze olarak hazırlandı ve uygulama bir gece açlık sonrası,sabah i.p. tek doz olarak gerçekleştirildi. EGCG ve Polifenon 60 çözeltileri salin içinde(8ml/kg) taze olarak hazırlanarak her sabah aynı saatde i.p. uygulandı.Son uygulamadan 24 saat sonra anestezi altında (50 mg/kg ketamin; 7 mg/kg ksilazin)bütün gruplarda intrakardiak kan alımı ve sakrifikasyon işlemi sonrası, karaciğer veböbrekler izole edildi. İzole edilen karaciğer ve böbrek dokuları ve 3000g‟de 15 dksantrifügasyon sonrası elde edilen serum örnekleri analize kadar – 86 ◦ C de, histopatolojikinceleme için karaciğer sol lobundan ve böbrekden alınan dokular gluteraldehit içinde fikseedilip saklandı.3.3. Serum Biyokimyasal Parametrelerinin ÖlçümüSerum aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT) aktiviteleri UVyöntem ile kan-üre nitrojen (BUN) kinetik uv yöntem ve kreatinin derişimleri Jaffé kinetikyöntemi ile Roche diagnostik reaktifleri kullanılarak Roche Hitachi modüler PP sisteminde(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) analiz edilmiştir.3.4. Doku MDA ve GSH DeriĢimlerinin SaptanmasıDoku örnekleri 0,15 M potasyum klorür (KCl) içinde cam-cam homojenizatörkullanılarak (1/10, w/v) homojenize edildi.Doku örneklerinde MDA derişimi Buege ve Aust‟un yöntemi ile saptandı (60). YöntemMDA‟nın tiyobarbitürik asit ile yaptığı kompleksin kolorimetrik olarak ölçümü32

prensibine dayanmaktadır. Homojenat örneklerinin 0,5 ml „si 1 ml ayıraç (13 mM TBA,% 15 TCA, 0,67 M HCl) eklenerek 15 dk. kaynar su banyosunda inkübe edildi. Tepkimesonrası elde edilen örnekler soğutulduktan sonra, 1500 g‟de santrifüj sonrası elde edilensüpernatantların absorbansı 535 nm‟de örnek körüne karşı Shimadzu-1601 UVspektrofotometrisinde ölçüldü. Örnek körü olarak 0,5 ml KCl ve 1 ml ayıraç içerençözelti hazırlandı. MDA derişimleri molar ekstinksiyon katsayısı (1,56 x 10 5 M -1 cm -1 )kullanılarak hesaplandı ve doku MDA derişimleri nmol/g doku olarak ifade edildi.Doku GSH derişimleri Ellman‟ın doku sülfidril grup analizi yöntemi ile gerçekleştirildi(61). Öncelikle homojenat örnekleri 0,17 M metafosforik asit, 53 mM etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) ve 5 M NaCl içeren ayıraç ile deproteinize edildi. Deproteinizasyoniçin 1,5 ml KCl, 0,5 ml homojenat ve 3 ml ayıraç içeren tüplerin +4 Cº‟de, 1500 g‟de 10dk santrifüj işlemi gerçekleştirildi. İşlem sonrası elde edilen süpernatantın, 6 mgditiyobisnitrobenzoik asitin (DTNB) % 1‟lik (w/v) sitrat içinde çözülmesi ile hazırlananEllman belirteci ile olüşturduğu renkli kompleksin absorbansları 412 nm‟de köre karşısaptandı (Shimadzu-1601). Derişimleri 0-300 g/ml arasında olan GSH standartlarıkullanılarak elde edilen standart eğriden örnek derişimleri hesaplandı (Şekil 3.1).Sonuçlar nmol/ g olarak ifade edildi.ġekil 3.1. GSH standart eğrisi33

3.5. Doku SOD Aktivitelerinin SaptanmasıKaraciğer ve böbrek dokusunda SOD aktivite tayini Sun ve ark‟larının yöntemi modifiyeedilerek gerçekleştirildi (62). Bu yöntemde ksantin ve ksantin oksidaz kullanılarakoluşturulan O -. 2 , renkli formazan oluşturmak üzere nitroblue tetrazolyum (NBT) bileşiğiile reaksiyona girmektedir.Doku örnekleri 0,1 M pH 7,4 fosfat tamponu ile hazırlanan % 1,17 KCl içinde cam-camhomojenizatör kullanılarak homojenize edildi (1/10, w/v). Homojenat örnekleri 15,000g‟de 30 dk +4ºC‟de santrifüjlenerek süpernatant elde edildi. Elde edilen süpernatantfosfat tamponu ile karaciğer dokusu için 1/ 10, böbrek dokusu için 1/5 seyreltilerekenzim kaynağı olarak kullanıldı.Ksantin oksidaz çözeltisi, son derişimi 167 U/L olacak şekilde soğuk 0,1 M pH 7,4 fosfattamponu ile taze olarak hazırlandı.SOD çalışma reaktifi; 0,3 mM ksantin, 0,6 mM EDTA, 150 M NBT, 400 mM Na 2 CO 3çözeltisi ve 1g/l sığır albumini içerecek şekilde hazırlandı.SOD standartları: 10 g/ ml derişimde hazırlanan stok SOD Standart çözeltisinden 90,70, 50, 30, 15, 10 ng/ml‟lik standartlar taze olarak hazırlandı.Her tübe 2,45 ml SOD çalışma reaktifi, 0,5 ml standart veya enzim kaynağı (örnek körüiçin 0,5 ml su) eklendikten sonra tüpler 25ºC su banyosuna kondu. Tüplere son hacim 3ml olacak şekilde 50 l ksantin oksidaz eklendi. Her tüp 20 dakika inkübe edildiktensonra reaksiyon 1ml 0,8 mM CuCl 2 eklenerek durduruldu. Formazan oluşumu 560 nm‟de(Shimadzu-1601) saptandı. Bu şartlar altında örnek körünün absorbansı 0,139 olarakölçüldü ve aşağıdaki eşitlik kullanılarak % inhibisyonlar hesaplandı.% inhibisyon =(Akör – A örnek )A körX 100Doku örneklerinin SOD aktivitesi hesaplamaları standart derişimlerine karşı %inhibisyonların gösterildiği standart eğriden hesaplanmıştır (Şekil 3.2). Bir ünite SOD,34

NBT indirgeme oranını %50 inhibe eden protein miktarı olarak kabul edilerek spesifikaktivite U/mg protein olarak ifade edildi.ġekil 3.2. SOD standart eğrisi3.6. Doku GPx Aktivitelerinin SaptanmasıDoku GPx aktivitesi Paglia ve Valentine‟in uv yöntemine göre ölçülmüştür (63). Buyöntemin prensibi GSH‟ın kümen hidroperoksit ile GPx enzimi varlığındakioksidasyonuna dayanmaktadır. Okside glutatyon (GSSG) daha sonra hızla redükte formaglutatyon redüktaz enzimi aracılığı ile dönüşmekte, NADPH ise NADP + ‟ye okside olmaktave absorbans azalması 340 nm‟de izlenmektedir. GPx aktiviteleri A/dk‟nın karaciğer veböbrek için uygun faktörler ile çarpılması sonucu hesaplanmaktadır. Sonuçlar ÜniteGPx/mg protein olarak ifade edilmiştir.Doku örnekleri 0,15 M pH 7,4 KCl içinde cam-cam homojenizatör kullanılarakhomojenize edildi (1/5, w/v). Homojenat örnekleri 10,000 g‟de 15 dk +4‟C‟desantrifüjlenerek süpernatant elde edildi. Elde edilen süpernatant KCl tamponu ile 1/ 20,seyreltilerek enzim kaynağı olarak kullanıldı.GPx çalışma reaktifi: 1mM EDTA, 1mM NaN 3 içeren 50mM pH 7 fosfat tamponu içinde0,2 mM NADPH ve 1mM GSH olacak şekilde her çalışmada taze hazırlandı.Son hacim 1 ml olacak şekilde 895 l GPx reaktifi 50 l enzim kaynağı, 5 l (0,5 U/mL)glutatyon redüktaz, 50 l kümen hidroperoksit (1,5 mM) eklendi ve absorbans azalması35

340 nm‟de 5 dk. spektrofotometrik olarak kaydedildi (Shimadzu-1601). Sonuçlar U/mgprotein olarak ifade edildi.3.7. Doku ve Serum PON Aktivitelerinin SaptanmasıDoku ve Serum PON aktivitesi Jerzy Beltwoski‟nin yöntemine göre çalışıldı (64).Yöntemde substrat olarak fenilasetat kullanılmaktadır ve PON aktivitesi fenilasetatınhidroliz edilme hızının ölçülmesiyle tanımlanmaktadır.Doku örnekleri 2mM kalsiyum klorür (CaCl 2 ) içeren 50 mM pH 8.0 Tris-HCltamponunda cam-cam homojenizatör kullanılarak (1/10, w/v) homojenize edildi.Homojenat örnekleri 15,000 g‟de 10 dk. +4‟C‟de santrifüjlenerek süpernatant eldeedilerek enzim kaynağı olarak kullanıldı.PON çalışma reaktifinin (2 mM CaCl 2 , 2 mM fenilasetat içeren 50mM pH 8.0 Tris-HCltamponu) 3 ml‟sine 10 l enzim kaynağı (böbrek dokusu için 30 l) eklenerek reaksiyonbaşlatıldı ve absorbans 270 nm‟de 2 dk. spektrofotometrik olarak kaydedildi (Shimadzu-1601). PON aktivitesi molar ekstinksiyon katsayısı (E 270 = 1310 M/ cm -1 ) kullanılarakhesaplandı. Bir ünite PON, 1 mol fenilasetatı hidroliz edebilen protein miktarı olarakkabul edilerek spesifik aktivite mU/mg protein olarak ifade edildi.Serum PON aktivitesi ise PON çalışma reaktifinin 3 ml‟sine 10 l serum örneğieklenmesi sonrası absorbansın 270 nm‟de 1 dk. spektrofotometrik olarak kaydedilmesiyleçalışıldı (Shimadzu-1601). Serum PON aktivitesi E 270 = 1310 M/cm- 1 ile hesaplandı vesonuçlar mU/ml olarak ifade edildi.3.8. Doku Total Protein AnaliziDoku homejenatlarında total protein analizi Bradford yöntemine göre gerçekleştirildi(65). Bu yöntemde, uygun seyreltmelerle hazırlanan doku homejenatlarının 100 l‟si ve900 l reaktif ile karıştırılarak hemen 595 nm‟de köre karşı absorbansları ölçüldü(Shimadzu-1601). Reaktif, 10 mg Coomassie Brillant Blue G-250‟nin, 5 ml %95etanolde çözülmesi sonrası elde edilen çözeltiye % 85 (w/v) fosforik asit eklenip (10 ml)son hacmin suyla 100 ml‟e tamamlanmasıyla hazırlandı. Protein stok standardından (100g/ml BSA) uygun seyreltmeler ile 1-10 g/ml‟lik çalışma standartları hazırlandı. Bustandartlar kullanılarak standart eğrisi elde edildi (Şekil 2.3). Doku protein derişimleri36

BSA (Bovine serum albumini) standart eğrisi kullanılarak hesaplandı ve sonuçlar mg/mlolarak ifade edildi.ġekil 3.3. BSA standart eğrisi3.9. Histopatolojik AnalizTüm dokular fosfat tamponlu % 2,5 gluteraldehit içinde 2-3 saat fikse edildikten sonrafosfat tamponlu % 1 osmium tetroksit ile postfiksasyon ve dereceli alkol serisi (%25, %50,%75, %95, absolü alkol) ile dehidratasyon yapılmıştır. Propilen oksitten geçirildiktensonra, örnekler Araldehit CY 212, DDSA(2-dodocenil süksinik anhidrit)BDMA(benzildimetilamin) ve dibütilpitalat içine gömülmüştür. 48 saat, 56ºC inkübatördepolimerize edilmiştir. Yarı ince kesitler alınarak toluidin mavisi ile boyanmış ve ışıkmikroskopunda incelenmiştir. Alınan ultra ince kesitler uranil asetat ve kurşun sitrat ileboyanmış ve LEO 906E EM transmisyon model elektron mikroskopunda incelenerek dijitalolarak görüntülenmiştir.3.10. Ġstatistiksel AnalizlerVeriler SPSS 13.0 paket programı ile değerlendirildi. Parametrik veriler için tek yönlüvaryans analizi (ANOVA) sonrası post-hoc Tukey’s testleri, nonparametrik veriler içinKruskal-Wallis ve Bonferronni-Dunn testi kullanıldı. Veriler ortalama (ort) ± standarthata ve homojen dağılım göstermeyen parametreler için ortanca (minimum-maksimum)olarak belirtildi. Anlamlılık düzeyi p < 0,05 olarak kabul edildi.37

4.BULGULAR4.1. APAP ve Katekin Uygulamasının Serum Parametreleri Üzerine Etkisi4.1.1. AST, ALT, BUN ve Kreatinin Üzerine EtkisiAPAP, EGCG ve polifenon 60 uygulamalarının serum AST, ALT, BUN ve kreatininüzerine etkileri Tablo 4.1‟de verilmektedir. APAP uygulanan grupta (Grup 1) AST veALT aktiviteleri tüm gruplara göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (p< 0,001).EGCG +APAP (Grup 4) ve Polifenon + APAP (Grup 5) uygulanan gruplarda ise kontrolgrubuna göre anlamlı bir değişiklik bulunmamıştır. BUN ve kreatinin düzeylerindegruplar arasında anlamlı bir değişiklik olmadığı gözlenmiştir.Tablo 4.1. Serum biyokimyasal parametreleri(Veriler ortanca (minimum-maksimum) olarak verilmiştir. *** p< 0,001 (kontrol, Grup 2, 3, 4 ve 5 ilekarşılaştırıldığında)KontrolGrup 1Grup 2Grup 3Grup 4Grup 5(n=7)(n=7)(n=7)(n=8)(n=8)(n=8)AST( U/L)109(78 - 320)19418***(10550 - 28070)129(64 - 267)112(89 - 337)157(93 - 305)131(80 - 368)ALT( U/L)61(28 - 80)19787***(12140 - 23980)54(28 - 135)39(31 - 68)56(52 - 152)49(32 - 650)BUN( mg/dl)27(20 - 33)48(21 - 93)23(31 - 11)31(20 - 44)26(21 - 37)25(21 - 34)Kreatinin( mg/dl)0,13(0,02 - 0,24)0,16(0,10 - 0,30)0,11(0,01 - 0,13)0,13(0,01 - 0,18)0,14(0,09 - 0,19)0,14(0,09 - 0,20)4.1.2. PON Enzim Aktivitesi Üzerine EtkisiAPAP, EGCG ve polifenon 60 uygulamalarının serum PON aktivitesi üzerine etkileriŞekil 4.1 ve Tablo 4.2‟de verilmektedir. APAP uygulaması, Grup 1 serum PONaktivitesinde kontrol grubu, Grup 2, 3, 4 ve 5‟e göre; EGCG uygulaması ise Grup 2 ve4‟te kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalmaya neden olmuştur (p

Tablo 4.2. Serum PON aktiviteleri.(Veriler ortanca (minimum-maksimum) olarak verilmiştir.***p< 0,001 (kontrol, Grup 2, 3, 4 ve 5 ilekarşılaştırıldığunda, **p

Tablo 4.3. Doku MDA, GSH derişimleri ile SOD, GPx ve PON aktiviteleri.Veriler ort ± standart hata ve ortanca (minimum-maksimum) olarak verilmiştir*** p

4.2.2. GSH DeriĢimleriAPAP, EGCG ve polifenon 60 uygulamalarının karaciğer doku GSH derişimleri üzerineetkileri şekil 4.3‟de verilmiştir. APAP uygulaması kontrol grubu ve diğer tüm gruplaragöre GSH derişimlerini anlamlı olarak azaltmıştır (p< 0,001). Diğer gruplarda kontrolgrubuna göre anlamlı bir değişiklik bulunmamıştır.******p

† p

4.2.5. Doku PON enzim aktivitesi üzerine etkileriAPAP, EGCG ve polifenon 60 uygulamalarının karaciğer doku PON enzimi üzerineetkileri şekil 4.6‟da verilmiştir. APAP uygulanan gruplarda tüm gruplara göre PON enzimspesifik aktivitesinde anlamlı azalmaya neden olmuştur (p

Tablo 4.4. Böbrek dokusu MDA ve GSH derişimleri.(Veriler ortanca (minimum-maksimum) olarak verilmiştir.)Kontrol Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 Grup 5MDA(nmol/g)43,86(20,35 - 94,50)48,64(42,56 - 61,88)49,24(41,22 - 96,22)45,91(33,12 - 75,72)47,79(21,75 - 78,2)41,13(26,94 - 49,17)GSH(nmol/g)5,75(3,61 - 9,82)4,79(3,06 - 6,02)4,33(3,75 - 5,85)4,06(2,77 - 5,81)4,21(3,94 - 4,86)4,01(3,38 - 5,88)4.3.2. Doku SOD, GPx ve PON enzim aktiviteleri üzerine etkileriBöbrek dokusu SOD, GPx ve PON aktiviteleri tablo 4.5‟de gösterilmiştir. APAP, EGCGve polifenon 60 uygulamalarının böbrek SOD aktiviteleri üzerine etkileri Şekil 4.7‟deverilmiştir. EGCG ve polifenon uygulanan gruplarda SOD spesifik aktivitesi kontrolgrubu, APAP, EGCG + APAP ve Polifenon + APAP gruplarına göre anlamlı olarakazaltmıştır. EGCG + APAP ve Polifenon + APAP uygulanan grupların SOD spesifikaktivitelerinin ise kontrol grubuna göre anlamlı bir değişime neden olmadığıbulunmuştur.APAP, EGCG ve polifenon 60 uygulamalarının gruplar arasında GPx ve PON enzimaktivitelerinde anlamlı bir değişikliğe rastlanmadı.Tablo 4.5. Böbrek dokusu SOD, GPx ve PON aktiviteleri.(Veriler ort ± standart hata ve ortanca (minimum-maksimum) olarak verilmiştir.**p

** p

ġekil 4.8. Fare karaciğer kesiti histopatolojisi (toluidin mavisi ile boyanmıştır; X 40). (A) Kontrolkesiti; (B) GRP 1 kesiti; (C) GRP 4 kesiti; (D) GRP 5 kesiti; VC: vena centralisKontrol grubu EM kesitinde büyük büyütmede iki hücre arasında sinüs kapilerlerigörülmekte olup, mitokondri ve diğer organellerin normal yapılarını koruduklarıizlenmektedir (Şekil 4.9). APAP grubunda, sinüzoidlerin eritrositlerle dolu olduklarıkomşu alandaki hepatositlerin sitoplazmalarında çok sayıda lipit damlacığının varlığıdikkati çekmektedir. Ayrıca mitokondrilerde kristalizis artışı ve peroksizom benzeri cisimartışı (mitokondrial dejenerasyon??) görülmektedir (Şekil 4.10). EGCG + APAP grubundahepatosit sitoplazmasında yaygın granüler litik görünümlü alanların varlığı belirgin olup,mitokondriyonların bir bölümü ve granüllü endoplazma retikulumu sisternaları bu alanlarınarasında yer yer normal yapılarıyla ayırt edilmektedir (Şekil 4.11). Polifenol + APAPgrubuna ait kesitte hepatosit hücresi izlenmektedir. Hücrede normal yapıda mitokondri veendoplazmik retikulum izlenmekle birlikte sitoplazmanın diğer alanlarında litik görünümlüdüzensiz alanların varlığı dikkat çekmektedir (Şekil 4.12).46

ġekil 4.9. Fare karaciğeri transmisyon elektron mikroskobu analizi. Kontrol grup kesiti (x3597)47

ġekil 4.10. Fare karaciğeri transmisyon elektron mikroskobu analizi. (GRP 1 kesiti; x1670)48

ġekil 4.11 Fare karaciğeri transmisyon elektron mikroskobu analizi. (GRP 4; X4646)49

ġekil 4.12 Fare karaciğeri transmisyon elektron mikroskobu analizi (GRP 5; X4646)Böbrek dokusuna ait ışık mikroskobu bulguları Şekil 4.13‟de verilmiştir. APAP grubundaözellikle proksimal epitel hücrelerinin bazılarında mikrovakuoller izlenmektedir. GRP 4‟tegerek glomerüler gerek peritübüler kapillerlerde belirgin staz ve bazı tubül epitelhücrelerinin apikal bölümlerinde daha belirgin olarak şişme mevcuttur. GRP 5‟te iseinterstisyel alanda küçük bir arteriyol kesiti ve damar dışına çıkmış eritrosit topluluğugörülmektedir.50

Şekil 4.13. Fare böbrek kesiti histopatolojisi (toluidin mavisi; X40). Kontrol, GRP 1, GRP 4 veGRP 5 kesitleri.G: Glomerül, TK: Toplama kanalı, PT: Proksimal tübül, DT: Distal tübül.EGCG grubuna ait böbrek ince kesiti EM bulgularında (Şekil 4.14) glomerülerkapillerlerin staz nedeniyle dilate oldukları bazılarının eritrositle dolu iken diğerlerindetrombosit kümelerinin lümeni doldurduğu görülmektedir. Glomerül bazal membranı vepodosit ayakçıkları normal yapılarını korumuştur. Glomerül içinde ileri derece şişmişsitoplazmik hücre uzantılarının varlığı belirgin olup, bazı endotel hücrelerinde de şişmegörülmektedir. Proksimal tubül epitel hücrelerindeki mitokondriyonlarda da % 50‟ye varanoranlarda şişme, düzleşme ve lizis mevcuttur. Polifenon uygulanan grupta ise tubülepitelinde peroksizom benzeri cisimler ve mitokondride düzleşme ile lizis artışı dikkatçekmektedir. Distal tubülde ise mitokondriler daha normal görülmekle birlikte epitelsitoplazmasında ileri derecede şişme izlenmektedir (Şekil 4.15).51

ġekil 4.14. Fare böbreği transmisyon elektron mikroskobu analizi. GRP 2 (X1670)52

ġekil 4.15. Fare böbreği transmisyon elektron mikroskobu analizi. GRP 3 (X1670)53

TARTIġMAAPAP, özellikle çocuklarda yaygın kullanılan analjezik ve antipiretik bir ilaçtır. Terapötikdozlarda oldukça etkin ve yararlı olmakla birlikte toksik dozlarda kullanımının, insanlar vedeney hayvanlarında fatal seyirli hepatik ve renal nekroza yol açabildiği yapılançalışmalarda gösterilmiştir (66).APAP toksisitesinin başlangıç basamağında CYP450 metabolizması ile oluşan reaktif araürün NAPQI yer almaktadır. Terapötik doz APAP alımı sonrası oluşan NAPQI, GSH ilekonjuge edilerek hızla uzaklaştırılmaktadır. Toksik dozlarda, NAPQI oluşum hızı GSHdetoksifikasyon kapasitesini geçmekte ve çeşitli hücre proteinlerine kovalanbağlanabilmektedir. Sonuç olarak geri dönüşümsüz karaciğer hasarı ve nekrozuna nedenolmaktadır. APAP ile uyarılan nefrotoksisite olgularında ise görülen tubuler hücre kaybıhem akut hem de kronik renal yetmezliğin karakteristik özelliğini oluşturmaktadır (66,47).Karaciğer APAP toksisitesi için en önemli hedef organdır. Toksik dozlarda APAPsentrilobüler hepatik nekroz oluşturmakta ve hatta fulminan karaciğer yetmezliğine yolaçabilmektedir. Yapılan çalışmalarda APAP uygulamasının doz bağımlı olaraktransaminaz düzeylerinde 50-500 kat artışa neden olduğu gösterilmiştir. Çalışmamızda 550mg/kg (i.p., tek doz) APAP uygulaması serum transaminaz düzeylerinde kontrol grubunagöre anlamlı bir artışa (ort. 200 kat) neden olmuştur. Bu sonuç uyguladığımız dozunkaraciğer hasarı oluşturduğunu desteklemektedir. AST hepatosit sitoplazma vemitokondrisinde, ALT ise hepatik parankimal hücrelerin sitozolünde bulunmaktadır. ALTkaraciğer fonksiyonlarını göstermede AST‟ye göre daha spesifiktir (67).Çalışmamızdaki bulgularla benzer şekilde, Carla Meotti ve ark 600 mg/kg paranteral (p.e.),tek doz APAP uyguladıkları farelerin serum transaminaz aktivitelerinde kontrol grubunagöre ortalama 100 kat artış olduğunu göstermişlerdir (68). Fareler üzerinde yapılan ikibenzer çalışmada farklı doz ve sürelerde APAP uygulaması serum transaminazdüzeylerinde anlamlı artışa neden olmuştur (69,70).APAP verilen grupta histolojik inceleme sonucunda hepatositlerin normal yapıözelliklerini büyük oranda yitirdikleri gösterilmiştir. Kesitlerde, sinüzoidlerin eritrositlerledolu olduğu, hepatositlerin sitoplazmalarında çok sayıda lipit damlacığının varlığı veorganel yapısının ileri derecede bozulduğu dikkat çekmektedir. Hem serum transaminaz54

aktivitesinde artış hem de histopatolojik bulgular, deneysel olarak kullanılan APAPdozunun karaciğer hasarı için uygun bir doz olduğunu desteklemektedir.APAP hepatotoksisitesinin başlıca nedeni toksik metaboliti NAPQI olup, hücre içi GSHtüketimini doz-bağımlı olarak artırmaktadır. APAP aracılı hepatotoksisitemekanizmalarından birinin oksidatif stres olduğu düşünülmektedir. APAP uygulamasısonrası ROS oluşumunda meydana gelen artış in vivo ve in vitro çalışmalarda gösterilmiştir(71). Toksik dozlarda APAP uygulaması doku lipit peroksidasyonu, enzim inaktivasyonu,hücresel enzimatik ve non-enzimatik antioksidan sistem ve GSH düzeyinde değişimin dedahil olduğu oksidatif hasara neden olmaktadır (72).ROS oluşumu lipit peroksidasyonu zincir reaksiyonunu indüklemekedir. Özellikle hücremembranı yapısındaki PUFA‟lar ile ROS etkileşerek lipit peroksidasyonunu başlatmaktave hatta hücre ölümüne neden olabilmektedir. MDA lipit peroksidasyonu ürünü olup,oksidatif stres varlığı için iyi bir biyokimyasal belirteçdir. Lipit peroksidasyonu ile APAParacılı doku hasarının ilişkili olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (72).Bu çalışmada APAP uygulaması karaciğer dokusunda MDA düzeyinde kontrol grubunagöre anlamlı artışa neden olmuştur. Yapılan çalışmalarda toksik doz APAP uygulamasısonucu MDA değerlerinde kontrole göre % 40-120 kat artış olabileceği gösterilmiştir (71).Mladenoviç ve ark. APAP uygulamasından (300 mg/kg) 6 saat sonra farelerin doku veserum MDA derişimlerinde anlamlı bir artış olduğunu göstermişlerdir (68). Yapar ve ark.ise APAP enjeksiyonunu takiben 4, 8 ve 24 saat sonra MDA düzeylerinde kontrol grubunagöre anlamlı artış bulmuşlardır (2). Ancak 8 ve 24 saat sonraki MDA düzeylerinin 4 saatsonra ölçülene göre göreceli olarak azaldığını, buna rağmen kontrole göre yine de yüksekolduğunu bildirmişlerdir. Daha önce farklı dozlarla yapılan iki çalışmada, bizimbulgularımızla çelişen sonuçlara ulaşılmış ve APAP uygulamasının lipit peroksidasyonuüzerinde anlamlı bir değişime neden olmadığı belirtilmiştir (69,70). Benzer şekildeMirochnitchenko ve ark. APAP uygulamasından 4 saat sonra lipit peroksidasyonundaanlamlı bir artışın meydana geldiğini, ancak 8 saat içinde normal düzeylere döndüğünübildirmişlerdir. MDA sonuçları arasındaki bu farklılığın çalışmalarda kullanılan farelerinfarklı türlerden olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir (68). APAP toksisitedüzeylerinin deney hayvanı cins ve türüne göre değişebildiğini destekleyen yayınlarmevcuttur.55

Lipit peroksidasyonunun, NAPQI‟nın neden olduğu GSH tüketimi ve oksidatif streseikincil olarak gelişerek tersinmez membran hasarı sonucu hücre ölümüne neden olabildiğidüşünülmektedir (2).GSH, ROS ve elektrofilik ksenobiyotiklere karşı hücre içi savunmasının ana kaynağınıoluşturmaktadır. Ksenobiyotiklere yüksek derecede maruziyet hepatik GSH derişiminiazaltmaktadır. Ksenobiyotikler ve metabolitlerinin GSH ile konjugasyonunu GSH-Stransferaz(GST) enzimi katalizlemekte olup, karaciğerin GST bakımından zengin olduğubilinmektedir. Oluşan toksik olmayan konjugatlar safrayla atılmakta ve parçalanıp NACkonjugatı şeklinde asetillenerek idrar yolu ile uzaklaştırılmaktadır (5). GSH, proteinlerinyapısındaki tiyol ve diğer nükleofilik grupların APAP‟ın toksik metabolitindenkorunmasında esansiyeldir. Bu nedenle APAP kaynaklı karaciğer hasarının anahtarbelirleyicisi hücre içi GSH düzeyidir (70).APAP‟ın toksik metaboliti olan NAPQI, GSH ile detoksifiye edilmekte ve APAP-GSHkonjugatı oluşmaktadır. Toksik dozlarda APAP, GSH depolarının hızla azalmasına veortamdaki NAPQI‟in hücresel proteinlere kovalan bağlanmasına neden olmaktadır (73).NAPQI‟nın kovalan bağlanması ve hem sitozolik hem de mitokondrial GSH tüketimihücre homeostazı kaybına neden olarak karaciğer hasarına yol açabilmektedir (74). Bunedenle APAP toksisitesinin belirleyicisi olması açısından, oluşan NAPQI miktarı ve bumetabolitin detoksifikasyonu için gereken hepatik GSH‟ın yeterli olup olmamasının önemtaşıdığı düşünülmektedir (73).Bu çalışmada; APAP uygulaması, karaciğer GSH derişimini tüm gruplara göre anlamlıolarak azaltmıştır. Şener ve ark.‟nın yaptıkları çalışmada 900 mg/kg (i.p.) APAPuygulaması, hepatik GSH derişiminde kontrol grubuna göre anlamlı azalmaya nedenolmuştur. Farklı doz ve sürelerle APAP uygulaması yapılan iki çalışmada da, benzerşekilde GSH derişiminde anlamlı bir azalma olduğu gösterilmiştir (1, 2, 66). Meotti ve ark.APAP uygulamasından 4 saat sonra total hepatik GSH derişiminde anlamlı bir azalmagözlemlenirken, 24 saat sonunda ise anlamlı bir değişim olmadığını bildirmişlerdir. Başkabir çalışmanın sonucunda ise, APAP ‟ın hepatik GSH‟ı anlamlı olarak azalttığı, bunakarşın 8 saat sonrasında GSH‟ın normal düzeylere geri döndüğü bildirilmiştir (68).Farelere 300 mg/kg APAP uygulanan bir çalışmada 6, 24 ve 48 saat sonunda sülfidril grupderişimine bakılmıştır. Uygulama sonrası sülfidril gruplarında gözlenen azalmanın 6 saat56

sonra artmaya başlayarak 24 saat sonunda pik yaptığı ve 48 saatin sonunda yeniden düşüşegeçtiği gösterilmiştir. GSH‟nun hepatositteki sülfidril gruplarının ana kaynağı olup,gözlenen artışın hepatositin adaptif yanıtı ile ilişkili olabileceği ve sonraki dönemdekidüşüşün ise ROS detoksifikasyonundan kaynaklanabileceği bildirilmiştir. Ancak dahayüksek doz APAP uygulanan çalışmalarda bu artışın gözlemlenmediği de rapor edilmiştir(47). Çalışmamızda uygulanan APAP dozu bu çalışmalara göre daha yüksek olup, 24 saatsonunda GSH derişiminin kontrol değerlerine göre anlamlı düşük olması da bu bulgularıdesteklemektedir.NAPQI, ROS‟un yanı sıra nitrik oksit ve peroksinitrit gibi reaktif nitrojen türleri (RNS)oluşumunu da artırmaktadır. Artan ROS ve RNS; DNA, proteinler ve fosfolipidler gibibiyolojik moleküllerle etkileşime girerek lipit peroksidasyonu ve tirozin nitrasyonunuuyarırken antioksidan enzim (SOD, GPx, katalaz gibi) aktivitelerinde de azalmaya nedenolmakta ve bu durum oksidatif stres ile sonuçlanmaktadır (75). GPx, peroksitlerindetoksifikasyonunda önemli rol oynayan bir enzim olarak peroksitlere karşı yüksek ilgisinedeniyle katalazdan daha etkin rol oynamaktadır. Meotti ve ark., APAP uygulamasınınGPx aktivitesinde anlamlı azalmaya neden olduğunu göstermişlerdir. Daha düşük GPxaktiviteleri peroksit uzaklaştırılmasında azalma nedeniyle H 2 O 2 derişiminde artışa nedenolmakta ve daha şiddetli bir karaciğer hasarı meydana getirebilmektedir (68). APAPtoksisitesinde hepatik GSH derişimi ve GPx aktiviteleri anlamlı olarak azalmaktadır. GSHyeterliliği GPx aktivitesi için önemli olup, GSH derişiminde meydana gelen bir artış GPxaktivitesini de artırabilmektedir (2). Çalışmamızda APAP uygulaması GSH derişimindeolduğu gibi hepatik GPx aktivitesinde de anlamlı bir azalmaya neden olmuştur.SOD, süperoksit radikaline karşı en önemli enzimatik antioksidan mekanizmalardanbiridir. APAP toksisitesi nedeniyle oluşan hepatik nekrozu önlediği yapılan çalışmalardabildirilmiştir (2). Bu çalışmada APAP uygulanan grupta SOD aktivitesinde GPxaktivitesinin tersine anlamlı bir değişiklik bulunmamıştır.Ajith ve ark., sıçanlarda APAP uygulaması sonrasında SOD, katalaz, GPx, GSTaktivitelerinde anlamlı bir azalma olduğunu bildirmişlerdir (1). Farelerde de farklı dozAPAP uygulaması sonucunda hepatik SOD, GPx ve katalaz aktivitesinde azalma meydanageldiği gösterilmiştir. Jadwiga ve ark. Yaptıkları çalışmada, yüksek doz APAPuygulamasının hepatik katalaz, GPx ve GST aktivitelerini anlamlı olarak azaltırken, SOD57

ve GR aktivitelerinde bir değişime neden olmadığını göstermişlerdir (76). Sonuç olarak,SOD‟un APAP ile oluşan oksidatif stresin asıl hedefi olmayabileceğini bildirmişlerdir.PON1‟in esteraz ve laktonaz aktivitesinin yanında ksenobiyotik toksisitesine karşıkoruyucu etkisi bulunmaktadır. PON1 ve 3, HDL‟ye bağlı olarak dolaşımda bulunurken,PON2 hücre içi yerleşimli bir enzimdir. Yapılan çalışmalarda kronik böbrek yetmezliği,kronik karaciğer yetmezliği ve kardiyovasküler hastalıklar gibi oksidatif stresin roloynadığı hastalıklarda dolaşımdaki PON1 aktivitesinde değişim olduğu gösterilmiştir (77).Aviram ve ark. yaptıkları çalışmada PON1‟in hem HDL hem de LDL‟yi lipitperoksidasyonuna karşı koruduğunu göstermişlerdir. PON1‟in antiaterojenik rolü ileoksidatif stresi azalttığı gösterilmiştir (42). PON1‟in oksidatif stres sırasında oksidefosfolipitleri lakton formuna dönüştürerek hidroliz etmek yetisi ile lipolaktonazaktivitesine sahip olabileceği düşünülmektedir (78).Son dönemde yapılan çalışmalarda PON1 aktivitesinin hepatik hasarın bir göstergesiolabileceği bildirilmiştir. Karaciğer hasarı sırasında hepatik PON1 gen ekspresyonunda vebuna ikincil olarak sentez ve salınımında azalma gösterilmiştir (67). Bu çalışmada, APAPuygulaması, serum ve karaciğer PON aktivitesinde kontrol grubuna göre anlamlı birazalmaya neden olmuştur. Ferre ve ark., sıçanlarda CCl 4 ile oluşturdukları siroz modelinde,hepatik PON1 aktivitesinde ve GSH derişiminde azalma, lipit peroksidasyonunda artışoluştuğunu gösterek bunun lipit peroksidasyonu ve karaciğer hasarındaki artışla ilişkilierken biyokimyasal bir bulgu olabileceğini ileri sürmüşlerdir (79). Ksenobiyotikkatabolizması başlıca karaciğer mikrozomlarında gerçekleşmekte olup, bu sırada serbestradikal türlerinde artışa neden olmaktadır. Rodrigo ve ark., PON1 sentezinin hepatositlerinsentrilobüler bölgesinde gerçekleştiğini göstermiştir (77). Bu sonuç çalışmamızdaki PONaktivitesindeki bulguları desteklemektedir. Atamer ve ark. yaptıkları çalışmadahepatosteatoz hastalarının PON1 aktivitesi ile NO düzeyinde anlamlı azalma, lipitperoksidasyonunda ise anlamlı artış bulmuşlardır. Ayrıca PON1 aktivitesi ile MDA ve NOdüzeyleri arasında korelasyon olduğunu göstermişlerdir (80).Flavanol ailesinin üyesi olan katekinler yeşil çayın başlıca polifenolik içeriğinioluşturmaktadır. Çok sayıda deneysel ve epidemiyolojik çalışma katekinlerin özellikleoksidatif stres aracılı hastalıklara karşı koruyucu etkisi olabileceğini göstermiştir (81).Katekinler, ROS ve RNS süpürücü etkileri, metal şelasyonu, prooksidan enzim inhibisyonu58

ve antioksidan enzim indüksiyonu yaparak hem doğrudan hem de dolaylı olarakantioksidan davranış göstermektedirler.EGCG yeşil çayda en fazla bulunan ve in vitro çalışmalarda en güçlü antioksidan etkiyesahip olduğu gösterilen katekindir (82). Bu çalışmada APAP toksisitesine karşı saf EGCGyanında bir kafeinsiz yeşil çay özütü olan Polifenon 60 kullanılmıştır. Chen ve ark.,sıçanlara saf EGCG ve kafeinsiz yeşil çay (DGT) vererek emilimlerini, doku dağılımlarınıve eliminasyonlarını araştırmışlardır. Sonuçta EGCG‟nin saf olarak ve DGT içindeverildiğinde farklı farmakokinetik davranış gösterdiğini bildirmişlerdir (10). SwissWebster farelerle yapılan bir deneysel çalışmada, EGCG‟nin 50 mg/kg (i.p., günde tekdoz) dozunda uygulanmasının şiddetli hepatik nekroza ve buna bağlı % 67 mortaliteyeneden olduğu gösterilmiştir (8). Başka bir çalışmada ise, saf yeşil çay özütünün iskemireperfüzyonhasarına karşı karaciğer koruyucu etkisi gösterilmiştir. Fareler üzerindeyapılan bir çalışmada CCl 4 ile oluşturulan karaciğer hasarında görülen histolojik vebiyokimyasal değişikliklerin EGCG ön uygulaması sonucunda azaldığı bildirilmiştir (85).Bu sonuçlara göre; katekinlerin verilme yolu ve uygulama dozunun, hepatotoksik veyahepatoprotektif etki göstermelerinde belirleyici rol oynayabilmektedir (8).İnsan sağlığı için yeşil çay tüketiminin yararlı/zararlı etkileri özütteki etken maddelerinderişimi ile ilişkili olup, özütlerdeki derişimi farklılık göstermektedir. İnsan sağlığı üzerineolası etkilerinin belirlenmesinde epidemiyolojik çalışmalar dikkate alınmıştır. Sağlıklıyetişkin bireylerde kalp-damar sağlığı için günde 3-4 fincan yeşil çay tüketimininin,koroner arter hastalığı risk faktörlerini azaltabileceği ileri sürülmektedir. Buna karşınkanser, diş ve kemik sağlığı açısından verilerin yeterli olmadığı bildirilmiştir (7). Yeşil çayiçeren preparatlar ticari olarak satılmakta ve günümüzde yaygın olarak kilo vermeamacıyla kullanılmaktadır. Preparatlar içeriğindeki katekin (EGCG olarak) ve kafeinderişimleri standardize edilmiştir. Buna karşın bazı preparatlarda standardizasyon olmadığıbelirlenmiş ve bunları kullanan 10 bireyde karaciğer hasarının olduğu bildirilmiştir (83,84).Bu çalışmamızın öncesinde EGCG ve polifenon 60 iki farklı dozda (25 ve 50 mg/kg)uygulanarak, 50 mg/kg verildiğinde transaminaz düzeylerini artırdığı gösterilmiştir. Bunedenle çalışmada 25 mg/kg uygulanmasına karar verilmiştir.59

Bu çalışmada, EGCG ve polifenon 60 uygulanan tüm grupların transaminaz düzeyleriAPAP uygulanan gruba göre anlamlı olarak düşük bulunmuştur. Histopatolojik incelemedeise APAP grubunda gözlenen organel hasarının bu gruplarda oluşmadığı izlenmiştir.Serum transaminaz düzeylerindeki anlamlı azalma ve histolojik bulgular EGCG vepolifenon 60‟ın APAP toksisitesine karşı koruyucu olabileceğini desteklemektedir.APAP toksisitesinde önemli rol oynayan metabolitin, CYP2E1 aracılı oluşan NAPQIolduğu düşünülmektedir. İnsan hepatik hücre kültürü çalışmasında EGCG‟nin CYP2E1aracılı oksidatif stres ve toksisiteye karşı koruyucu etki gösterebileceğini bildirmişlerdir.Bu koruyucu etkiyi ROS ve lipit peroksidasyonunun azaltarak, hücre içi GSH derişiminiartırarak yaptığı düşünülmektedir (81).Yeşil çayda bulunan polifenollerin biyolojik sistemlerde lipit peroksidasyonuna karşı birantioksidan gibi etkili olduğu ve EGCG‟nin doz bağımlı olarak MDA oluşumunu azalttığıgösterilmiştir (86).Katiya ve ark. yaptıkları çalışmada EGCG‟nin peroksi radikali ile etkileşerek lipitperoksidasyonunu baskıladığını göstermişlerdir. Yu-Chun ve ark. ise, MDA oluşumunuönlemede B halkasında orto-dihidroksilfenil bulunan EC ve ECG‟nin EGCG‟den dahaaktif olduğunu göstermişlerdir. Orto-dihidroksifenil, daha stabil olan orto-hidroksilfenoksilradikaline okside olmakta ve sonuçta da bu radikal son ürün olan orto-kinon‟uoluşturmaktadır (83). Devika ve ark. sıçanlarda miyokard infarktüsüne bağlı hasara karşıEGCG‟nin 3 farklı dozda (10, 20 ve 30mg/kg, 21 gün) gösterdiği etkiyi incelemişlerdir.Her üç dozun lipit peroksidasyon ürünlerini anlamlı düzeyde azalttığını ancak 30 mg/kguygulamasının daha etkili olduğunu göstermişlerdir (87).Bu çalışmalardan farklı olarak çalışmamızda; EGCG ve polifenon 60 uygulanan tümgruplarda hepatik doku MDA derişimleri kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmışdüzeyde bulunurken, APAP ile ön uygulanmaları sonucunda, saf APAP uygulanangruptaki MDA derişimine göre anlamlı bir azalma gözlenmiştir. Ayrıca, saf EGCG vepolifenon 60 uygulanan grupların MDA derişimleri arasında da bir fark bulunamamıştır.Bununla birlikte, bulgularımız EGCG ve polifenon 60 uygulanan tüm gruplarda hepatikdoku GSH derişiminin APAP uygulanan gruba göre anlamlı yüksek olduğunu ortaya60

koymuştur. Ayrıca, EGCG ve polifenon 60 uygulaması GPx enzim aktivitesini hem APAPhem de kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttırmıştırSıçanlara 21 gün süre ile EGCG uygulamasının GSH bağımlı antioksidan enzimleri aktiveederek oksidatif stres ile uyarılan hasara karşı koruyucu etki gösterdiği bildirilmiştir (87).Oksidatif stres ile indüklenebilen genlerin çoğunun promoter bölgesinde “antioxidantresponsive element” (AREs) bulunduğu bilinmektedir. Son dönemlerde yapılançalışmalarda diyetle alınan polifenollerin, ARE yolu ile antioksidan transkripsiyonsistemini uyarabileceği ve yeşil çay özütlerinin ARE aktivasyonu yaparak Faz IIenzimlerinin genlerinin ekspresyonunu artırdığı gösterilmiştir. Bu etkiyi “mitogenactivated protein kinase” (MAPK) sinyal yolunu kullanarak yaptıkları düşünülmektedir.EGCG‟nin 3 MAPK sinyal yolunu da doz ve süre bağımlı biçimde aktive ettiğibildirilmiştir (88) Başka bir çalışmada ise kurşun uygulaması sonrası EGCGuygulanmasının karaciğer GSH derişimini ve GR aktivitesini anlamlı olarak azalttığıbulunmuştur. Hücre içi tiyol dengesi üzerinde katekinlerin etkisinin farklı olmasınınkimyasal yapıları ve gen ekspresyonunu düzenlemelerindeki farklılıkla ilişkili olabileceğidüşünülmektedir (88). Antioksidan enzim aktiviteleri üzerine polifenollerin etkilerininhücre tipi ve patolojik durumun farklı olduğu durumlarda değişebileceği de bildirilmiştir.Bu çalışmada, EGCG ve polifenon 60 tek başına ve APAP ile birlikte uygulandığındaserum ve hepatik PON aktivitelerinde APAP uygulanan gruba göre anlamlı artışa nedenolmuştur. Bununla birlikte EGCG uygulanan gruplarda serum PON aktivitesinde kontrolgrubu ile karşılaştırıldığında anlamlı bir azalma gözlenmiştir. Daha önce yapılançalışmalarda polifenollerin PON 1 gen ekspresyon düzeyini düzenleyici etki gösterdiğibildirilmiştir (89). Hamelet ve ark., hiperhomosisteinemi oluşturdukları farelerindiyetlerine bir ay boyunca katekin eklemelerinin hepatik PON1 gen ekspresyonunda artışaneden olduğunu bildirmişlerdir (89). Başka bir çalışmada ise, sıçanların diyetlerine 4 hafta“quarcetin” eklenmesi sonucunda PON1 hepatik ekspresyonunda % 35, serum ve hepatikPON1 aktivitelerinde ise sırasiyle % 29 ve % 57 artış olduğu gösterilmiştir (90).Çalışmamızda EGCG ve polifenon 60 uygulanan tüm gruplarda SOD enzim aktivitelerikontrol ve APAP grubuna göre anlamlı olarak düşük bulunmuştur.Yeşil çay polifenol içeriğinin esas olarak serbest radikalleri temizleme, lipitperoksidasyonunu önleme yolu ile antioksidan etki göstermesinin yanı sıra, in vitro ve in61

vivo çalışmalarda kendi prooksidan etkilerine bağlı olarak hücrede sitotoksik etkileroluşturabileceği de gösterilmiştir. Antioksidan etkiden esas olarak sorumlu olanEGCG‟nin, doz bağımlı biçimde sitotoksik etkilerden de sorumlu olduğu ortayakonmuştur. EGCG‟yi propil gallat ve ECG izlemektedir (56, 57). Elbling ve ark., insanHL60 hücre kültürü kullanılarak yeşil çay özütü ve EGCG uygulaması sonucu artmışderişimde spontan H 2 O 2 oluşumunu göstermişlerdir. Ancak toksik etkilerin yalnızca bunabağlı olmadığını, EGCG‟nin oksidatif gücünün daha yüksek olduğunu ve mikromolarderişimlerde ortaya çıkabileceğini, fizyolojik şartlarda nanomolar derişimlerde EGCG‟ninise hücre sinyal ileti sistemleri ile ilişkili bazal H 2 O 2 oluşumundan sorumlu olduğunu ilerisürmüşlerdir (91). Ayrıca sıçan hepatosit kültürü çalışmalarında, yüksek derişimlerde yeşilçay özütünün özellikle EGCG bileşenine bağlı olarak akut toksik etkilere yol açtığı dagösterilmiştir (91, 92, 93). Hou ve ark.‟nın çalışmasında in vitro EGCG‟nin otooksidasyonsonucu H 2 O 2 ‟nin yanı sıra artmış miktarlarda O -. 2 anyonu oluşumuna yol açtığı veprooksidan etkisinden de bu otooksidasyonun sorumlu olduğu gösterilmiştir (91). Ancak,EGCG başta olmak üzere çay katekinlerinin prooksidan etkileri ile ilişkili in vivoçalışmaların yeterli olmayışı, bu etkinin mekanizmasında belirsizliklere yol açmaktadır. Buçalışmada, EGCG ve Polifenon 60 uygulanan tüm gruplarda karaciğer lipit peroksidasyonukontrol grubuna göre anlamlı bir artış gösterirken, SOD aktivitesi ise anlamlı bir azalmagöstermiştir. Katekin uygulanan her iki grupta hepatik MDA derişimleri APAP uygulanangruba göre anlamlı bir azalma gösterdiyse de, kontrol değerlerine göre anlamlı yüksekbulunmuştur. SOD aktivite azalması ile değerlendirildiğinde, bu durum olasılıklakatekinlerin uygulanan doz ve sürede esas olarak EGCG‟ye bağlı olmak üzere prooksidanetki gösterdiklerini düşündürmektedir. Olasılıkla, EGCG‟nin otooksidasyonu ile artansüperoksit anyonlarının SOD aracılı dismutasyonu sonucu SOD aktivitesinde azalmagözlenmiştir. Ayrıca bu otooksidasyon sonucu artan H 2 O 2 „nin de Cu, Zn SOD aktivitesiüzerinde baskılayıcı etkiye yol açmış olabileceği düşünülmektedir. Öte yandan; deneyselmodelimizde karaciğer histopatolojik değerlendirme bulguları, APAP uygulamasına görekatekin verilen gruplarda belirgin düzelme göstermekle birlikte, EGCG+APAP grubundahepatosit sitoplazmasında yaygın granüler litik görünümlü alanların, Polifenol +APAPgrubuna ait kesitte ise sitoplazmada litik görünümlü düzensiz alanların varlığına dikkatçekmektedir. Bununla birlikte, gerek EGCG gerek Polifenon 60 uygulaması hepatikhücrelerde APAP aracılı GSH tükenmesini anlamlı bir düzeyde artırmış, hücrede GSHdüzeyinin yeniden kontrol düzeylerinde korunmasına neden olmuştur. Benzer biçimde GPx62

aktivitesini de GSH artışına ikincil olarak ve olasılıkla enzim indüksiyonu yolu ile safkatekin uygulanan gruplarda da kontrol düzeylerinin üzerinde artırmıştır. GSH ve GPxaktivitesi bağlamında gözlenen antioksidan etkiye karşın, olasılıkla SOD aktivitesininbelirgin olarak azalması ve bu durumun saf katekin ve polifenon 60 uygulamaları ile deoluşması sonucu hepatik hücrede ROS oluşumunda artışa ve lipit peroksidasyonuna yolaçmıştır. Bu durumun EGCG ve Polifenon gruplarında farklılık göstermemesi, olasılıklaoluşan etkiden esas olarak EGCG‟nin sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca,katekinlerin bu doz ve sürede uygulanmasının Cu, Zn SOD enziminin bilinmeyen birmekanizma ile “down”regülasyonuna ve/veya enzim “turnover”ında değişikliğe yolaçmış olabileceği de düşünülebilir. Artan lipit peroksidasyonunun SOD‟un baskılanmasınaikincil olarak mı oluştuğu, ya da EGCG‟nin uygulanan dozdaki otooksidasyonu sonucuartan süperoksit derişimine karşı hepatik SOD aktivitesinin yetersiz mi kaldığı konusunaileri çalışmalarla açıklık getirilmesi gerekmektedir.APAP‟ın insanlarda ve deney hayvanlarında hepatik nekroz ve böbrek yetmezliği yaptığıgösterilmiştir. APAP aracılı böbrek toksisite mekanizmasında CYP450 yolu, prostoglandinsentaz ve N-deasetilaz enzimlerinin rol oynadığı düşünülmektedir (94). Hoivik ve ark.APAP‟ın toksik elektrofil bir ürüne dönüşümünün APAP‟ın neden olduğunefrotoksisitenin merkezini oluşturabileceğini bildirmişlerdir (95). Stern ve ark. ise APAPile uyarılan renal hasarda APAP-GSH konjugatlarının veya metabolitinin roloynayabileceğini ve farelerde GSH konjugatlarının transportunun veya metabolizmasınınbozulmasının APAP aracılı toksisiteye karşı böbrekleri koruduğunu göstermişlerdir.APAP-Cys konjugatının -glutamil döngüsünün bir ürünü olduğu ve hepatik değil renalGSH derişimini azalttığı bildirilmiştir (95).Bu çalışmada, APAP uygulaması sonrası serum BUN ve kreatinin derişimlerinde diğergruplarla anlamlı bir farklılık bulunmamıştır. Ayrıca histopatolojik incelemede APAPuygulanan grup ile kontrol grubunda benzer bulgular izlenmiş olup, böbrek MDA ve GSHderişimlerinde, GPx ve PON aktivitelerinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı birfarklılık saptanmamıştır. Bu bulgular, uygulanan APAP‟ın deneysel modelimizde birböbrek hasarına neden olmadığını göstermektedir.Yapılan bir çalışmada sıçanlara tek doz 1000 mg/kg (i.p.) APAP uygulamasının, böbrekMDA derişiminde artışa, GSH derişiminde, GPx, SOD ve katalaz aktivitelerinde ise63

anlamlı olarak azalmaya neden olduğunu ve bu sonuçların APAP‟ın neden olduğu renalhasara işaret ettiği bildirilmiştir (94). Roomi ve ark. da farelere tek doz 600 mg/kg APAPuyguladıkları çalışmada, serum BUN ve kreatinin derişimlerinde belirgin bir artış vehistopatolojik olarak glomerüler hasar oluştuğunu göstermişlerdir (96). Chen ve ark.sıçanlara 500 mg/kg APAP uygulamasının, serum BUN ve kreatinin derişimlerinde birfarklılık yaratmadığını buna karşın, serum transaminaz düzeyleri ile karaciğer dokusundalipit peroksidasyon ürün oluşumunda anlamlı artışa ve GSH derişiminde ise azalmayaneden olduğunu bildirmişlerdir (85).Bu çalışmada, EGCG ve polifenon 60 uygulamaları da BUN, kreatinin, MDA, GSHderişimlerinde,G Px ve PON aktivitelerinde anlamlı değişikliklere neden olmamıştır.Ancak karaciğerde olduğu gibi saf EGCG ve polifenon uygulanan gruplarda, böbrek SODaktivitesi kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalırken, karaciğerden farklı olarak APAPile birlikte katekin ve polifenon 60 ön uygulamaları, saf katekin ve polifenon 60 uygulanangruplara göre SOD aktivitesinin anlamlı olarak artmasına ve kontrol değerlerineulaşmasına neden olmuştur.Saf katekin uygulanan grupların histopatolojik bulguları biyokimyasal verilerimizidesteklemektedir. Saf EGCG uygulanan grupta glomerül içinde ileri derece şişmişsitoplazmik hücre uzantılarının varlığı belirgin olup bazı endotel hücrelerinde de şişmegörülmekte ve proksimal tübül epitel hücrelerindeki mitokondrilerde % 50‟ye varanoranlarda şişme ve düzleşme izlenmektedir. Saf Polifenon 60 uygulanan grupta ise tubulepitelinde peroksizom benzeri cisimler ve kristalizis artışının yanında distal tubulde demitokondriler daha normal görülmekle birlikte epitel sitoplazmasında ileri derecede şişmeizlenmektedir.Cu, Zn SOD enziminin glomerül mezenşimal hücrelerinde yapısal olarak ifadelendiği vesitokinler ve büyüme faktörlerinin de enzimin kontrolünde işlevi olmadığı bilinmektedir(97). Ancak bulgularımız saf EGCG ve polifenon uygulaması ile böbrek SOD spesifikaktivitesinde belirgin azalma olduğunu ve bu durumun APAP uygulamasından bağımsızbiçimde gerçekleştiğini göstermektedir. Böbrekte karaciğerin tersine katekin uygulamasılipit peroksidasyonuna yol açmamış ve GPx aktivitesinde de artışa neden olmamıştır. Tekbaşına SOD enziminde gözlenen bu “down” regülasyon mekanizmasındaki belirsizliğinaçıklığa kavuşturulması için farklı katekin dozu ve farklı sürelerde uygulamalara64

gereksinim olduğu düşünülmektedir. EGCG ve polifenon uygulamaları ile SOD enzim“turnover”ında olası değişikliğin de göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Öteyandan saf katekin uygulamasının özellikle EGCG uygulanan grupta proksimal tübül epitelhücrelerindeki mitokondrilerde şişme ve düzleşme ve lizise yol açması, bu dozda safkatekin veya yeşil çay özütü uygulamasının renal sitotoksik etkilere yol açtığınıdüşündürmektedir. Ancak bu durumun olasılıkla ROS artışı aracılı olmadığı düşünülebilir.Yeşil çay, tümör hücrelerinde kaspaz 3 geninin delesyonunu veya yabanıl tip kaspaz 3geninin ekspresyonunu sağlamaktadır (58, 98). Hücrede apopitozun uyarılmasındaki bumekanizmada kaspaz 3 artmış aktivitesi SOD enzim aktivitesi ile ters ilişkigöstermektedir. Bu durum da deneysel modelimizdeki olasılıkla apopitoza giden renaltubüler hücrelerdeki SOD baskılanmasının nedeni olarak düşünülebilir. Galati ve ark.‟nınçalışmasında hepatosit hücre kültüründe EGCG ve gallik asitin, GSH konjugatıoluşturdukları gösterilmiştir (57). Bu çalışmada, böbrek dokusunda karaciğerden farklıbiçimde, APAP ile birlikte EGCG veya polifenon uygulanan her iki grupta SODaktivitelerinin kontrol değerlerine ulaşmış olması, APAP ile bu çalışmada uygulanankatekinlerin olasılıkla böbrekte metabolizma düzeyinde etkileşime girebildiklerinidüşündürmektedir. Böbrekte APAP-Cys konjugatı oluşumunun, olasılıkla EGCG-GSHkonjugasyonu ile yarışmalı bir biçimde gerçekleşmesi sonucu APAP ile birlikte katekinuygulanan gruplarda özellikle EGCG aracılı azalan SOD aktivitesinin anlamlı olarakyükselmesi ve kontrol değerlerine ulaşmasının nedeni olarak düşünülebilir. Ancakböbrekte yeşil çay özütü ve/veya EGCG aracılı Cu, Zn SOD kontrolüne açıklık getirmekiçin SOD mRNA ekspresyonu ve SOD “turnover”ını araştırmaya yönelik ileriçalışmaların gerekliliği düşünülmektedir.65

SONUÇEn sık kullanılan analjezik ve antipiretik ajanlardan biri olan APAP bu çalışmada farelerdesubletal dozda (550 mg/kg) uygulanmıştır. APAP‟ın olası hepatotoksik ve /veyanefrotoksik etkilerinin oksidatif stres bağlamında incelenmiş ve çay katekinlerinden EGCG(25 mg/kg) ve yeşil çay özütü polifenon 60 (25 mg/kg)‟ın uygulama öncesi 7 (yedi) günsüre ile verilmesinin koruyucu işlevi araştırılmıştır. Bulgularımız;1. APAP uygulamasının karaciğer hasarına neden olduğunu ancak böbrek üzerinde toksikbir etki yaratmadığını göstermektedir. Bu durum APAP toksisitesinin doz bağımlıorganospesifik doku hasarı oluşturduğunu düşündürmektedir.2. Uygulama sonrasında serum transaminaz düzeylerinin artışı ve histopatolojik olarakakut hepatik hasar ile uyumlu sonuçlar karaciğer hasarını desteklemektedir.3. Karaciğerde artmış lipit peroksidasyonu, azalmış GSH düzeyleri ile azalmış GPx vePON1 aktiviteleri APAP ile uyarılan hepatotoksisitenin oksidatif stres aracılı geliştiğinigöstermektedir.4. EGCG ve polifenon uygulamaları karaciğerde GSH düzeylerinin yeniden sağlanmasınave GPx aktivitesi ile PON1 aktivitesinde artışa yol açarken, hepatik lipitperoksidasyonunda artış ile birlikte Cu, Zn SOD aktivitesinde belirgin azalmaya yolaçmıştır. Deney şartlarında uygulanan doz ve sürede katekinlerin özellikle EGCGbağlamında karaciğerde prooksidan etkiye yol açabileceği düşünülmektedir.5. Böbrek dokusunda APAP uygulaması BUN, kreatinin derişimleri, histopatolojikdeğerlendirme ve oksidatif stres belirteçleri bağlamında herhangi bir değişikliğe yolaçmamaktadır.6. Saf EGCG ve polifenon uygulamaları proksimal tubuler hasar ile birlikte böbrek Cu ZnSOD aktivitelerinde anlamlı düşüşe neden olmaktadır. Hiçbir uygulama böbrekte lipitperoksidasyonu veya GSH değişimine neden olmamıştır.7. Karaciğer ve böbrekte EGCG ve polifenon 60 etkileri arasında bir fark gözlenmemiştir.8. APAP ile uyarılan hepatotoksisite modelinde katekinlerin deney şartlarımızdauygulanan doz ve sürede GSH derişimini, GPx ve PON aktivitelerinin kontroldüzeylerinde olmasına rağmen olası prooksidan etkileri nedeni ile koruyucu işleviolmadığı düşünülmekte EGCG ve polifenon aracılı gerçekleşen karaciğer ve böbrekdokusundaki sitozolik SOD baskılanmasının mekanizmasına ileri çalışmalarla açıklıkgetirilmesi gerekmektedir.66

9. Yeşil çay özütü ve EGCG prooksidan etkilerini gösteren in vivo çalışmaların sınırlıolması nedeni ile sağlıklı koşulda koruyucu olarak ve/veya ilaç toksisitelerinin de yeraldığı patolojik durumlarda katekinlerin aşırı kullanımının farklı süre, doz ve verilişyollarının karşılaştırıldığı ileriye dönük mekanistik çalışmalarla irdelenmesiönerilmektedir.67

KAYNAKLAR1. Ajith TA, Hema U, Aswathy MS. Zingiber officinale Roscoe prevents acetaminopheninducedacute hepatotoxicity by enhancing hepatic antioxidant status. Food andChemical Toxicology: 45 (11): 2267 - 2272, 2007.2. Yapar K, Kart A, Karapehlivan M, Atakişi O, Tunca R, Erginsoy S, Citil M.Hepatoprotective effect of l-carnitine against acute acetaminophen toxicity in mice.Experimental and Toxicologic Pathology : 59 (2): 121 – 128 , 2007.3. Bromer MQ, Black M. Acetaminophen hepatotoxicity. Clinics in Liver Disease: 7,351-367, 2003.4. Maryadele JO. Merck Index an encyclopedia of chemicals, drugs and biologicals.Fourteenth edition, NJ, USA, MERCK & CO, INC, 20065. Vaquero J, Belanger M, James L, Herrero R, Desjardins P, Cote J, Blei A, ButterworthR. Mild hypothermia attenuates liver injury and improves survival in mice withacetaminophen toxicity. Gastroenterology: 132, 372-383, 2007.6. Li C, Liu J, Saavedra JE, Keefer LK, Waalkes MP. The nitric oxide donor, V-PYRRO/NO, protects against acetaminophen-induced nephrotoxicity in mice.Toxicology : 189, 173-180, 2003.7. Higdon JV, Frei B. Tea catechins and polyphenols: health effects, metabolism andantioxidant functions. Critical Reviews in Food Science and Nutrition: 43 (1), 89-143,2003.8. Sutherland BA, Rahman RM, Appleton I. Mechanisms of action of green teacatechins, with a focus on ischemia-induced neurodegeneration. J.NutritionalBiochemistry: 17, 291-306, 2006.9. Rahman I, Biswas S,.Kirkham P. Regulatin of inflamation and redox signaling bydietary polyphenols. Biochemical Pharmacology; 72: 1439-1452, 2006.10. Laishun C, Mao-Jung L, He L, Chung SY. Absorption, distribution and elimination oftea polyphenols in rats. Drug Metabolism and Disposition: 25 (9), 1045-1050, 1997.11. Abraham P, Suqumar E. Increased glutathione levels and activity of PON1 (phenylacetate esterase) in the liver of rats after a single dose of cyclophosphamide: a defensemechanism. Experimental and Toxicologic Pathology: 59, 301-306, 2008.12. Ryan P, Hynes MJ. The kinetics and mechanisms of the complex formation andantioxidant behavior of polyphenols EGCg and ECG with iron (III). Journal ofInorganic Biochemistry: 101, 585-593, 2007.13. Kumaran VS, Arulmathi K, Srividhya R, Kalaiselvi P. Repletion of antioxidant statusby EGCG and retardation of oxidative damage induced macromolecular anomalies inaged rats. Experimental Gerontology: 43 (3): 176 – 183, 2007.14. Slattery J.T, Levy G. Acetaminophen kinetics in acutely poisoned patients. Clin.Pharmac. Therap. ; 25: 184-195, 1979.68

15. Prescott LF. Kinetics and metabolism of paracetamol and phenacetin.Br.J.Clin.Pharmac.: 10, 291-298, 1980.16. Forrest JA, Clements JA, Prescott LF. Clinical pharmacokinetics of paracetamol.Clin.Pharmacokinet.: 7 (2), 93-107, 1982.17. Forrest JA, Adrianssens P, Finlayson ND, Prescott LF. Paracetamol metabolism inchronic liver disease. Eur.J.Clin.Pharmacol.: 15 (6), 427-431, 1979.18. Van Lingen RA, Deinum JT, Quak JME, Kuizenga AJ, Van Dam JG, Anand KJS,Tibboel D, Okken A. Pharmacokinetics and metabolism of rectally administeredparacetamol in preterm neonates. Arch.Dis.Child Fetal Neonetal: 80; 59-63, 1999.19. Graham G, Hicks M. Pharmacokinetics and metabolism of paracetamol, Aspirin andrelated drugs ; 181-215 (Rainsford K.D. ed), London, Taylor & Francis, 2004.20. Jos GM, Bessems and Nico PE, Vermeulen. Paracetamol (Acetaminophen)-inducedtoxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protectiveapproaches. Critical Reviews in Toxicology: 31 (1), 55-138, 2001.21. Fayz S, Cherry WF, Dawson JR, Mulder GJ, Pang KS. Inhibition of acetaminophensulfation by 2,6-dichloro-4-nitrophenol in the perfused rat liver preparation. Lack of acompensatory increase of glucuronidation. Nitrophenols: The American Society forPharmacology and Experimental Therapeutics: 12 (3), 323-329, 1984.22. Mitchell MC, Hamilton R, Wacker L, Branch RA. Zonal distribution of paracetamolglucuronidation in the isolated perfused rat liver. Xenobiotica: 19 (4), 389-400, 1989.23. Manyike PT, Kharasch ED, Kalhorn TF, Slattery JT. Contribution of CYP2E1 andCYP3A to acetaminophen reactive metabolite formation. Clin.Pharmacol.Ther.: 67(3), 275-282, 2000.24. Nicholls AW, Caddick S, Wilson ID, Farrant RD, Lindon JC, Nicholson J. Highresolution NMR spectroscopic studies on the metabolism and futile deacetylation of4-hydroxyacetanilide (paracetamol) in the rat. Biochemical pharmacology:49, 8: 1155-1164,199525. Mugford CA, Tarloff JB. The contribution of oxidation and deacetylation toacetaminophen nephrotoxicity in female Sprague-Dawley rats. Toxicology Letters: 93,15-22, 1997.26. James LP, Mayeux PR, Hinson JA. Acetaminophen-induced hepatotoxicity. TheAmerican Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics: 31 (12),1499-1506, 2003.27. Hu JJ, Lee MJ, Vapiwala M, Reuhl K, Thomas PE, Yang CS. Sex-related differencesin mouse renal metabolism and toxicity of acetaminophen. Toxicol Appl Pharmacol.;122 (1):16-26, 1993.28. Stern ST, Bruno MK, Henning GE, Horton RA, Roberts JC, Cohen SD. Contributionof acetaminophen-cysteine to acetaminophen nephrotoxicity in CD-1 mice: I.Enhancement of acetaminophen nephrotoxicity by acetaminophen-cysteine.Toxicology and Applied Pharmacology: 202, 151-159, 2005.69

29. Stern ST, Bruno MK, Horton RA, Hill DW, Roberts JC, Cohen SD. Contribution ofacetaminophen-cysteine to acetaminophen nephrotoxicity II. Possible involvement ofγ-glutamyl cycle. Toxicology and Applied Pharmacology: 202, 160-171, 2005.30. Valko M, Rhodes CJ, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Free radicals, metals andantioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions: 160,1-40, 2006.31. Yu BP, Chung HY. Adaptive mechanisms to oxidative stress during aging.Mechanisms of Ageing and Development: 127, 436-443, 2006.32. Negre-Salvayre A, Coatireux C, Ingueneau C, Salvayre R. Advanced lipidperoxidation end products in oxidative damage to proteins. Potential role in diseasesand therapeutic prospects for the inhibitors. British Journal of Pharmacology: 153,6-20, 2008.33. Delrio D, Stewart AJ, Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde astoxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutiriton, Metabolism &Cardiovascular Diseases: 15, 316-328, 2005.34. Catala A. Lipid peroxidation of membrane phospholipids generates hydroxy-alkenalsand oxidized phospholipids active in physiological and/or pathological conditions.Chemistry and Physics of Lipids: 157, 1-11, 2009.35. Lu SC. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine: 30,42-59, 2009.36. Yuan L, Kaplowitz N. Glutathione in liver diseases and hepatotoxicity. MolecularAspects of Medicine: 30, 29-41, 2009.37. Johnson F, Giulivi C. Superoxide dismutases and their impact upon human health.Molecular Aspects of Medicine: 26, 340-352, 2005.38. Mates JM, Gomez CP, De Castro IN. Antioxidant enzymes and human diseases.Clinical Biochemistry: 32 (8), 595-603, 1999.39. Herbette S, Drevet PR, Drevet JR. Seleno-independent glutathione peroxidases. Morethan simple antioxidant scavengers. The FEBS Journal: 274, 2163-2180, 2007.40. Draganov DI, La Du BN. Pharmacogenetics of paraoxonases: a brief review. Naunyn-Schmiedeberg‟s Arch.Pharmacol.: 369, 78-88, 2004.41. Costa LG, Vitalone A, Cole TB, Furlong CE. Modulation of paraoxonase (PON1)activity. Biochemical Pharmacology: 69, 541-550, 2005.42. Aviram M, Rosenblat M. Paraoxonases 1, 2 and 3, oxidative stress and macrophagefoam cell formation during atherosclerosis development. Free Radical Biology &Medicine: 37 (9), 1304-1316, 2004.43. Harel M, Aharoni A, Gaidukov L, Brumshtein B, Khersonsky O, Meged R, Dvir H,Ravelli RBG, McCarthy A, Toker L, Silman I, Sussman JL, Tawfik DS. Structure andevolution of serum paraoxonase family of detoxifying and anti-atheroscleroticenzymes. Nature Structural & Molecular Biology: 11 (5), 412-419, 2004.70

44. James RW, Deakin SP. The importance of high-density lipoproteins for paraoxonase-1secretion, stability and activity. Free Radical Biology & Medicine: 37 (12), 1986-1994, 2004.45. Stehbens W, Oxidative stress, toxic hepatitis and antioxidants with particular emphasison zinc. Experimental and Molecular Pathology: 75, 265-276, 2003.46. Yen FL, Wu TH, Lin LT, Lin CC. Hepatoprotective and antioxidant effects of cuscutachinensis against acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats. Journal ofEthnopharmacology: 111, 123-128, 2007.47. Mladenovic D, Radosavljevic T, Ninkovic M, Vucevic D, Vukicevic RJ, Todorovic V.Liver antioxidant capacity in the early phase of acute paracetamol-induced liver injuryin mice. Food and Chemical Toxicology: 47, 866-870, 2009.48. Rodrigo R, Bosco C. Oxidative stress and protective effects of polyphenols:Comparative studies in human and rodent kidney. A review. ComparativeBiochemistry and Physiology, Part C: 142, 317-327, 2006.49. Feng WY. Metabolism of green tea catechins: An overview. Current DrugMetabolism: 7, 755-809, 2006.50. Frei B, Higdon JV. Antioxidant activity of tea polyphenols in vivo: Evidence fromanimal studies. The Journal Of Nutrition: Proceeding of the Third InternationalScientific Syposium on Tea and Human Health: Role of Flavonoids in Diet, 2003.51. Yang CS, Lambert JD, Sang S. Antioxidative and anti-carcinogenic activities of teapolyphenols. Arch Toxicol: 83, 11-21, 2009.52. Henning SM, Niu Y, Liu Y, Lee NH, Hara Y, Thames GD, Minutti RR, Carpenter CL,Wang H, Heber D. Bioavailability and antioxidant effect of epigallocatechin gallateadministered in purified form versus as green tea extract in healthy individuals.Journal of Nutritional Biochemistry: 16, 610-616, 2005.53. Lambert JD, Sang S, Yang CS. Biotransformation of green tea polyphenols and thebiological activities of those metabolites. Molecular Pharmaceutics: 4 (6), 819-825,200754. Zhou B, Wu LM, Yang L, Liu ZL. Evidence for α-tocopherol regeneration reaction ofgreen tea polyphenols in SDS micelles. Free Radical Biology & Medicine: 38, 78-84,2005.55. Riemersma RA, Rice-Evans CA, Tyrrell RM, Clifford MN, Lean MEJ. Tea flavonoidsand cardiovascular health. QJMed: 94, 277-282, 2001.56. Galati G, Lin A, Sultan A, O‟brien PJ. Cellular and in vivo hepatotoxicity caused bygreen tea pheolic acids and catechins. Free Radical Biology & Medicine: 40, 570-580,2006.57. Galati G, O‟brien PJ. Potential toxicity of flavonoids and other dietary phenolics:Significance for their chemopreventive and anticancer properties. Free RadicalBiology & Medicine: 37 (3), 280-303, 2004.71

58. Bun S, Bun H, Guedon D, Roiser C, Oliver E. Effect of green tea extracts on liverfunction in wistar rats. Food and Chemical Toxicology: 44, 1108-1113, 2006.59. World Medical Association Declaration of Helsinki (2000) 52 nd WMA GeneralAssembly, Edinburgh Scotland.60. Buege JA, Aus AD. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology:302-310, 1978.61. Ellmann GL. Tissue sulphydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophysics: 82,50-77, 1959.62. Sun Y, Oberley LW, Li Y. A simple method for clinical assay of superoxidedismutase. Clinical Chemistry: 34 (3), 497-500, 1988.63. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterizationof erythrocyte glutathione peroxidase. Journal Lab.Clin.Med.: 70 (1), 158-169, 1967.64. Beltowski J, Wojcicka G, Jamroz A. Effect of 3-hydroxy-3methylglutarylcoenzyme areductase inhibitors (statins) on tissue paraoxonase 1 and plasma platelet activatingacetylhydrolase activities. J.Cardiovasc.Pharmacol.: 43 (1), 121-127, 2004.65. Bradford MM. QA rapid and sensitive method for the quantification of microgramquantities of protein utilizing the principal of protein-dye binding. AnalyticalChemistry: 72 (1-2), 248-254, 1976.66. Ayantika G, Porones CS. Anti-oxidative effect of a protein from cajanus indicus Lagainst acetaminophen-induced hepato-nephrotoxicity. Journal of Biochemistry andMolecular Biology: 40 (6), 1038-1049, 2007.67. Ozer J, Ratner M, Shaw M, Bailey W, Schomaker S. The current state of serumbiomarkers of hepatotoxicity. Toxicology: 245, 194-205, 2008.68. Meotti FC, Rosa JM, Bracardo PS, Balz D, Waltrick AP, Bagio A, Golulart EC, DafreAL, Rodrigues AL, Santos RS. Protective effect of crude extract from wedeliapaludosa on the hepatotoxicity induced by paracetamol in mice. J.of Pharmacy andPharmacology: 58, 137-142, 2006.69. Iwalokun BA, Efedede BU, Alabi-Sofunde JA, Oduala T, Magbagbeola OA,Akinwande AI. Hepatoprotective and antioxidant activities of vernonia amygdalina onacetaminophen-induced hepatic damage in mice. J.of Medicinal Food: 9 (4), 524-530,2006.70. Şener G, Omurtag G, Sehirli Ö, Tozan A, Yüksel M, Ercan F, Gedik N. Protectiveeffects of ginkgo biloba against acetaminophen induced toxicity in mice. Molecularand Cellular Biochemistry: 283, 39-45, 2006.71. Lai JT, Fang HL, Hsieh WT, Cun W. Protective effects of a fermented substance fromsaccharomyces cerevisice on liver injury in mice caused by acetaminophen. Bioxci.Biotechniol Biochem.: 72 (10), 2514-2520, 2008.72. Işık B, Bayrak R, Akçayı A, Söğüt S. Erdostine against acetaminophen induced renaltoxicity. Molecular and Cellular Biochemistry: 287, 185-191, 2006.72

73. Chen YH, Lin FY, Liu PL, Huang YT, Chiu JH, Chang YC, Man KM, Hong CY, HoYY, Lai MT. Antioxidative and hepatoprotective effects of magnanol onacetominophen-induced liver damage in rats. Arch.Pharm.Res.:32 (2), 221-228, 2009.74. Nirala SK, Bhadauria M. Propolis reverses acetaminophen induced acute hepatorenalalterations. Biochemical and histopathological approach. Arch.Pharm.Res.: 31 (4),451-461, 2008.75. Oz HS, McClain CJ, Nagasawa HT, Ray MB, Villiers WJ, Chen TS. Diverseantioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J.Biochem.MolecularToxicology: 18 (6), 361-368, 2004.76. Liebert JJ, Matlawska I, Bylka W, Murias M. Protective effect of aquilegia vulgaris(L) on APAP-induced oxidative stress in rats. J.of Ethnopharmacology: 97, 351-358,2005.77. Camps J, marsillach J, Joven J. Measurement of serum paraoxonase-1 activity in theevaluation of liver function. World J.Gasroenterol: 15 (16), 1929-1933, 2009.78. Rosenberg O, Shineri M, Aviram M, Hayek T. Paraoxonase 1 (PON 1) attenuatesdiabetes development in mice through its antioxidative properties. Free RadicalBiology & Medicine: 44, 1951-1959, 2008.79. Marsillach J, Camps J, Ferre N, Beltia R, Rull A, Mackness M, Joven J. Paraoxonase 1is related to inflammation, fibrosis and PPAR delta in experimental liver disease.BMC Gastroenteology: 9 (3), 1-13, 2009.80. Atamer A, Bilici A, Yenice N, Selek S, İlhan N, Atamer Y. The importance ofparaoxonase 1 activity nitric oxide and lipid peroxidation in hepatosteatosis. J.ofInternational Medical Research: 36, 771-776, 2008.81. Jose M, Lopes J, Cederbaum AJ. Green tea polyphenol epigallocathechin-3-gallatprotects hep G2 cells against CYP2E1-dependent toxicity. Free Radical Biology &Medicine: 36 (3), 359-370, 2004.82. Coimbra S, Castro E, Pereira PR, Rebelo I, Rocha S, Silva A. The effect of green teain oxidative stress. Clinical Nutrition: 25, 790-796, 2006.83. Romain G. Fulminant hepatitis during self-medication with hydroalcoholic extract ofgreen tea. European journal of gastroenterology & hepatology; 17 (10): 1135-1137;2005.84. Bonkovsky H.L. Hepatotoxicity associated with supplements containing Chinesegreen tea (Camellia sinensis). Annals of ınternal medicine; 144 (1): 68-69; 2006.85. Chen JH, Tipe GL, Liong EC, So HSH, Leung KM, Tom WM, Fung PCW, Nanji AA.Green tea polyphenols prevent toxin-induced hepatotoxicity in mice bydown-regulating inducible nitric oxide-derived prooxidants. Am.J.Clin.Nutr.: 80, 742-751, 2004.86. Cai YJ, Ma LP, Hou LF, Zhou B, Yang L, Liu ZL. Antioxidant effects of green teapolyphenols on free radical initiated peroxidation of rat liver microsomes. Chemistryand Physics of Lipids: 120, 109-117, 2009.73

87. Devika PT, Stanley P, Maincer P. Protective effect of (-) epigallocathechin-gallate(EGCG) on lipid peroxide metabolism in isoproterenol induced myocardial infarctionin male wistar rats: A histopathological study. Biomedicine & Pharmacotherapy:62(10), 1-8, 2008.88. Masella R, Di-benedetto R, Vari R, Filesi C, Giovannini C. Novel mechanisms ofnatural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione andglutathione-related enzymes. J.of Nutritional Biochemistry: 16, 577-586, 2005.89. Hamelet JM, Demuth K, Dairou J, Ledris A, Paul JL, Dupret JM, Delabar JM, LimaFR, Janel N. Effect of catechin on homocycteine metabolism inhyperhomocysteinemic mice. Biochemical and Biophysical ResearchCommunications: 355, 221-227, 2007.90. Gong M, Gorige M, Varatharajalu R, Marmillot P, Gottipatti C, Leckey LC, LaksmanRM. Quercetin up-regulates paraoxonase 1 gene expression with concomitantprotection against LDL oxidation. Biochemical and Biophysical ResearchCommunications: 379, 1001-1004, 2009.91. Elbling L, Weiss R, Teufelhofer O, Uhl M, Knasmueller S, Schulte-Herman R, BergerW, Micksche M. Green tea extract and (-)-epigallocatechin-3-gallate, the major teacatechin, exert oxidant but lack antioxidant activities. Faseb journal 28, 1-26, 2005.92. Schmidt M, Schmitz H, Baumgart A, Guedon D, Netsch MI, Kreuter M, Schmidlin C,Schrenk D. Toxicity of green tea and their constituents in rat hepatocytes in primaryculture. Food and Chemical Toxicology 43, 307-314, 2005.93. Hou Z, Sang S, You Hui, Lee M-J, Hong J, Chin K-V, Yang C. Mechanism of actionof (-)- epigallocatechin-3-gallate: Auto-oxidation-dependent inactivation of epidermalgrowth factor receptor and direct effects on growth inhibition in human esophagealcancer KYSE 150 cells. Cancer research 65: (17), 2005.94. İlbey YÖ, Özbek E, Çekmen M, Sonay A, Özcan L, Otunçtemur A, Şimşek A, MeteF. Melatonin prevents acetaminophen-induced nephrotoxicity in rats.Int.Urol.Nephrol.: 41(3), 695-702,2009.95. Doi K, Ishida K. Diabetes and hypertriglyceridemia modify the mode ofacetaminophen-induced hepatotoxicity and nephro toxicity in rats and mice. TheJournal of Toxicological Science: 34 (1), 1-11, 2009.96. A nutrient mixture prevents acetaminophen hepatic and renal toxicity in ICR mice.Hum.Exp.Toxicol.: 27, 223-230, 2008.97. Leach M, Frank S, Olbrich A, Pfeilschifter J, Thiemermann C. Decline in theexpression of copper/zinc superoxide anion radical scavenger, tempol, on injury.British Journal of Pharmacology, 125, 817-825, 1998.98. Miyamoto Y, Sano M, Haylor J, El-Nahas M. (-)-epigallocatechin 3-o-gallate (egcg)-induced apoptosis in normal rat kidney interstitial fibroblast (NRK-49F) cells. TheJournal of Toxicological Sciences: 33, 367-370, 2008.74