BAġKENT ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ Biyokimya Anabilim ...

340 nm‟de 5 dk. spektrofotometrik olarak kaydedildi (Shimadzu-1601). Sonuçlar U/mgprotein olarak ifade edildi.3.7. Doku ve Serum PON Aktivitelerinin SaptanmasıDoku ve Serum PON aktivitesi Jerzy Beltwoski‟nin yöntemine göre çalışıldı (64).Yöntemde substrat olarak fenilasetat kullanılmaktadır ve PON aktivitesi fenilasetatınhidroliz edilme hızının ölçülmesiyle tanımlanmaktadır.Doku örnekleri 2mM kalsiyum klorür (CaCl 2 ) içeren 50 mM pH 8.0 Tris-HCltamponunda cam-cam homojenizatör kullanılarak (1/10, w/v) homojenize edildi.Homojenat örnekleri 15,000 g‟de 10 dk. +4‟C‟de santrifüjlenerek süpernatant eldeedilerek enzim kaynağı olarak kullanıldı.PON çalışma reaktifinin (2 mM CaCl 2 , 2 mM fenilasetat içeren 50mM pH 8.0 Tris-HCltamponu) 3 ml‟sine 10 l enzim kaynağı (böbrek dokusu için 30 l) eklenerek reaksiyonbaşlatıldı ve absorbans 270 nm‟de 2 dk. spektrofotometrik olarak kaydedildi (Shimadzu-1601). PON aktivitesi molar ekstinksiyon katsayısı (E 270 = 1310 M/ cm -1 ) kullanılarakhesaplandı. Bir ünite PON, 1 mol fenilasetatı hidroliz edebilen protein miktarı olarakkabul edilerek spesifik aktivite mU/mg protein olarak ifade edildi.Serum PON aktivitesi ise PON çalışma reaktifinin 3 ml‟sine 10 l serum örneğieklenmesi sonrası absorbansın 270 nm‟de 1 dk. spektrofotometrik olarak kaydedilmesiyleçalışıldı (Shimadzu-1601). Serum PON aktivitesi E 270 = 1310 M/cm- 1 ile hesaplandı vesonuçlar mU/ml olarak ifade edildi.3.8. Doku Total Protein AnaliziDoku homejenatlarında total protein analizi Bradford yöntemine göre gerçekleştirildi(65). Bu yöntemde, uygun seyreltmelerle hazırlanan doku homejenatlarının 100 l‟si ve900 l reaktif ile karıştırılarak hemen 595 nm‟de köre karşı absorbansları ölçüldü(Shimadzu-1601). Reaktif, 10 mg Coomassie Brillant Blue G-250‟nin, 5 ml %95etanolde çözülmesi sonrası elde edilen çözeltiye % 85 (w/v) fosforik asit eklenip (10 ml)son hacmin suyla 100 ml‟e tamamlanmasıyla hazırlandı. Protein stok standardından (100g/ml BSA) uygun seyreltmeler ile 1-10 g/ml‟lik çalışma standartları hazırlandı. Bustandartlar kullanılarak standart eğrisi elde edildi (Şekil 2.3). Doku protein derişimleri36