Bestimmung von Lactose/Galactose in Schokolade

Bestimmung von
Lactose/Galactose in
Schokolade
Lebensmittelanalytisches Praktikum für
Ernährungswissenschaftler
SS 2010
Christine Klinglmayr (christine.klinglmayr@univie.ac.at)

Aufgabenstellung:
Enzymatische Bestimmung von freiem
Galactose- sowie Lactosegehalt [g/100g] in
einer Schokolade
Prinzip:
Die Menge an gebildetem NADH ist der
Galactose - bzw. der Lactosemenge äquivalent.

Lactosespaltung

Galactosespaltung

Absorptionsspektrum
NADH hat ein 2. Absorptionsmaximum bei 340 nm

Gehalte:
In Schokolade kann
neben der Lactose auch
freie Galactose vorliegen
In der Extraktionslösung werden beide Galactosewerte bestimmt und
aus der Differenz der Lactosegehalt berechnet.

Durchführung
Probenaufarbeitung: pro 2er Gruppe
• Einwaage von 2g Schokolade
• Transfer in 100 ml Messkolben
• + 70 ml dest. H2O • Erhitzen im Wasserbad (70°C, 15 min)
• Abkühlen auf RT

Durchführung
• Auffüllen auf 100 ml
• Kühlschrank (20 min)
• Filtrieren
• 25 ml Aliquot auf 100 ml auffüllen
(Verdünnung 1:4)
• Filtrieren
• Enzymtest

Pipettierschema: Enzymkit von Megazyme
Bestehend aus 6 Flaschen:
• Flasche 2: Tris / Hcl-Puffer, 2 M, pH 6,8 mit EDTA
• Flasche 3: NAD +
• Flasche 4: β-Galactosidase - Suspension
• Flasche 5: β – Galactose - Dehydrogenase (Gal-DH)
• Flasche 6: D – Galactose - Standardlösung,
c = 400 mg/L

Jedes Paar hat 3 Küvetten:
• Lactose – Probe
• D – Galactose – Probe
• D – Galactose – Standard – Lösung
(= Testlösung)
Die Leerwerte werden von 2 Paaren gemessen, alle
anderen übernehmen diese.
Messung:
Die Absorption des Coenzyms NADH wird bei 340 nm
gemessen

Berechnung der Extinktionsdifferenz:
1. E 2 –E 1 = ΔE
Bei Leerwerten und Probe wir der 1. Extinktionswert vom 2.
abgezogen
2. ΔED-Gal = (E2 –E1 ) Gal-Probe -(E2 –E1 ) Gal-Leerwert
ΔELac + Gal = (E2 –E1 ) Lac-Probe -(E2 –E1 ) Lac-Leerwert
Die Extinktionsdifferenz vom Leerwert wird von der
Extinktionsdifferenz der korrespondierenden Probe abgezogen
3. Berechnung von E Lactose :
ΔELactose = ΔELactose u. Galactose - ΔEGalactose

Berechnung der Konzentrationen: auf 2 Wege
1. Berechnungsart: durch Lambert-Beer
ΔE = ε x c x d
c = ΔE / (c x d) [mol/L]
c (Küvette) = ΔE / (c x d) x M [g/L]
c = ΔE / (c x d) x M x V Küvette / V Probelösung [g/L]
ε … Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm = 6300
[L x mol -1 x cm -1 ]
d… Schichtdicke
M… Molekulargewicht der gesuchten Substanz [g/mol]
(Lactose = 342,3; Galactose = 180,16)
V Küvette = 2,72 ml
V Probelösung = 0,2 ml

2. Berechnungsart: durch Testlösung
ΔE Testlösung
ΔE Galactose von Lactose
E 1 = ε x c 1 x d ... Probelösung (Gal von Lac)
E 2 = ε x c 2 x d ... Testlösung (Gal)
E 1 / E 2 = c 1 / c 2
c 1 = E 1 / E 2 x c 2 in [g/L]
c Lac = c Gal von Lac x MG (Lac) / MG (Gal) in [g/L]

Umrechnen auf g in 100g:
[g/L] x 4 : 10 : 2 x 100
– Verdünnungsfaktor
– Menge der eingesetzten Lösung (nicht 1 L sonder
100 ml)
– Einwaage
– Pro 100g
Test auf Richtigkeit: mit Testlösung:
ΔE = ε x c x d
c = ΔE / (c x d)