Download - Fakultät 06 - Hochschule München

Validierungsplan eines
Chromatographie-Datensystems
Diplomarbeit
von
Markus Keller
Hochschule München
Fakultät Feinwerk- und Mikrotechnik, Physikalische Technik
Studiengang Mechatronik/Feinwerktechnik (Diplom)
Studienrichtung Produktion & Automatisierung
Erstprüfer: Prof. Dr. Otto Parzhuber
Zweitprüfer: Prof. Dr. Richard Schulz
Betreuer: Dipl.-Ing. Ludwig Jaufmann, Firma Goebel
Tag der Einreichung: 15.09.2008

Sperrvermerk:
Die vorliegende Diplomarbeit beinhaltet interne vertrauliche Informationen der
Firma Goebel.
Die Weitergabe des Inhaltes der Arbeit und eventuell beiliegender Zeichnungen und
Daten im Gesamten oder in Teilen ist grundsätzlich untersagt. Es dürfen keinerlei
Kopien oder Abschriften - auch in digitaler Form - gefertigt werden.
Ausnahmen bedürfen der schriftlichen Genehmigung der Firma Goebel.

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS........................................................................................1
ABBILDUNGSVERZEICHNIS...............................................................................4
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS............................................................................. 6
VORWORT.............................................................................................................7
1 ABSTRAKT....................................................................................................... 8
1.1 deutsch....................................................................................................... 8
1.2 english........................................................................................................ 8
2 EINLEITUNG..................................................................................................... 9
2.1 Motivation................................................................................................... 9
2.2 Die HPLC....................................................................................................11
2.2.1 Grundlagen der HPLC.........................................................................11
2.2.2 Trennverfahren der Substanzen..........................................................13
2.2.3 Arbeitsweise einer HPLC-Anlage........................................................ 15
2.3 Erläuterung der Gliederung........................................................................ 17
3 AUFGABEN EINES CHROMATOGRAPHIE-DATENSYSTEMS..................... 18
3.1 Steuerung der Anlage................................................................................ 18
3.2 Datenaufnahme und Rohdatenspeicherung.............................................. 19
3.3 Auswertung................................................................................................ 20
3.3.1 Bestimmung der Peak-Flächen.......................................................... 20
3.3.2 Manuelle Integration........................................................................... 21
3.3.3 Erstellen von Kalibrierungskurven...................................................... 22
3.3.4 Mengenbestimmung aus Kalibrierfunktionen..................................... 22
3.4 Reporting................................................................................................... 23
3.4.1 Flexibler Reportgenerator................................................................... 23
3.4.2 Druck / Export..................................................................................... 24
3.5 Qualitative Information durch Spektrenvergleich....................................... 25
3.5.1 Darstellung des 3D - Datenfeldes........................................................25
3.5.2 Extraktion von Spektren und Chromatogramen aus 3D..................... 26
3.5.3 Spektren-Bibliothekensuche............................................................... 27
3.5.4 Peak-Reinheits-Berechnung............................................................... 29
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4 DETAILLIERTE FUNKTIONSBESCHREIBUNG.............................................. 30
4.1 Geminyx Main Menü...................................................................................30
4.2 Data............................................................................................................ 30
4.2.1 Sample Editor...................................................................................... 31
4.2.2 Calibration........................................................................................... 32
4.2.3 Methods.............................................................................................. 33
4.2.3.1 General........................................................................................ 33
4.2.3.2 Chart Layout................................................................................ 34
4.2.3.3 Integration.................................................................................... 36
4.2.3.4 Print..............................................................................................45
4.2.3.5 Calibration.................................................................................... 45
4.2.3.6 Results......................................................................................... 46
4.2.4 Data..................................................................................................... 47
4.3 Configuration.............................................................................................. 51
4.3.1 Edit Variables...................................................................................... 51
4.3.2 Option................................................................................................. 54
4.3.2.1 General........................................................................................ 54
4.3.2.2 Company...................................................................................... 54
4.3.2.3 Charts...........................................................................................55
4.3.2.4 Integration defaults.......................................................................55
4.3.2.5 Spectra defaults........................................................................... 62
4.3.3 Print Templates....................................................................................62
4.3.3.1 Template Groups..........................................................................62
4.3.3.2 Templates.....................................................................................63
5 TEST ZUR PRÜFUNG...................................................................................... 64
5.1 Test der Funktion „ Sample Editor“............................................................. 64
5.2 Test der Funktion „Integration“....................................................................65
5.3 Test der Funktion „Data“............................................................................. 77
5.3.1 Lineare Kalibrierung ohne Offset, externer Standard........................ 77
5.3.2 Lineare Kalibrierung mit Offset, externer Standard........................... 78
5.3.3 Lineare Kalibrierung ohne Offset, interner Standard......................... 79
5.3.4 Lineare Kalibrierung mit Offset, interner Standard............................ 80
5.3.5 Lineare Kalibrierung ohne Offset, interner Standard gewichtet.........81
5.3.6 Lineare Kalibrierung mit Offset, interner Standard gewichtet............ 82
5.3.7 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, externer Standard...............83
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.8 Quadratische Kalibrierung mit Offset, externer Standard..................84
5.3.9 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, interner Standard................85
5.3.10 Quadratische Kalibrierung mit Offset, interner Standard...................86
5.3.11 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, interner Standard gew. ...... 87
5.3.12 Quadratische Kalibrierung mit Offset, interner Standard gewichtet...88
5.4 Test der Funktion „Configuration“................................................................89
5.4.1 Test der Funktion „Edit Variables“........................................................89
5.4.2 Test der Funktion „Option“...................................................................91
6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK........................................................ 92
ÜBERSICHT CD-ROM.......................................................................................... 94
LITERATURVERZEICHNIS...................................................................................95
ERKLÄRUNG ZUR DIPLOMARBEIT....................................................................96
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1: Komplette HPLC-Anlage der Firma Goebel.......................... 11
Abbildung 2: Typischer Aufbau einer HPLC-Anlage................................... 12
Abbildung 3: Trennsäule............................................................................. 13
Abbildung 4: Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage........................... 15
Abbildung 5: Chromatogram....................................................................... 16
Abbildung 6: Modularer Aufbau...................................................................19
Abbildung 7: Chromatogram mit Peak-Grenzen......................................... 20
Abbildung 8: Kalibrierungskurve am Beispiel Ethyl Ester........................... 22
Abbildung 9: Kalibrierungskurve mit Mengenbestimmung......................... 22
Abbildung 10: Integriertes Chromatogram mit Reportgenerator................... 23
Abbildung 11: „Template“ - Konfigurator........................................................24
Abbildung 12: 3D - Datenfeld........................................................................25
Abbildung 13: Extraktion aus dem 3D - Datenfeld........................................ 26
Abbildung 14: Spektrenvergleich über Bibliothekensuche............................27
Abbildung 15: „Peak-Purity“ - Berechnung....................................................29
Abbildung 16: Geminyx III Hauptmenü......................................................... 30
Abbildung 17: „Sample“ - Editor.................................................................... 31
Abbildung 18: „Calibration Table“.................................................................. 32
Abbildung 19: Method Table „General“ - Funktion........................................ 33
Abbildung 20: Method Table „Chart Layout“ - Funktion................................ 34
Abbildung 21: „Chart Parameter“ - Editor..................................................... 34
Abbildung 22: „Spectra Parameter“ - Editor.................................................. 35
Abbildung 23: Method Table „Integration“ - Funktion.................................... 36
Abbildung 24: Basislinie mit Drift.................................................................. 37
Abbildung 25: „Peak Identification“ - Funktion.............................................. 39
Abbildung 26: Chromatogram ohne „Inhibit Integration“............................... 42
Abbildung 27: Chromatogram mit „Inhibit Integration“.................................. 43
Abbildung 28: Peak mit detektiertem Rider-Peak......................................... 44
Abbildung 29: „Result Layout“.......................................................................46
Abbildung 30: Unterfunktion „Data“...............................................................47
Abbildung 31: Kalibrierungskurve................................................................. 48
Abbildung 32: „Edit Variables“ - Funktion......................................................51
Abbildung 33: „Sum“ - Funktion.................................................................... 52
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Abbildung 34: „Integration defaults“ - Funktion............................................. 55
Abbildung 35: Peak mit Rider-Peaks............................................................ 56
Abbildung 36: „Rider Threshold“ - Funktion.................................................. 56
Abbildung 37: „Rider Ratio“ - Funktion..........................................................57
Abbildung 38: „Negative Peak Detection“ - Funktion.................................... 58
Abbildung 39: „Lock Baseline“ = 0................................................................ 59
Abbildung 40: „Lock Baseline“ = 1................................................................ 60
Abbildung 41: „Lock Baseline“ = 2................................................................ 60
Abbildung 42: „Lock Baseline“ = 3................................................................ 61
Abbildung 43: Beispiel „Template“ - Vorlage................................................. 63
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
EDQM Europäische Direktion für die Qualität von Medikamenten
HPLC High Performance Liquid Chromatography
( Hochauflösende Flüssigkeits-Chromatographie )
DAD Dioden Array Detector
RT Retentionszeit
IS Interner Standard
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
VORWORT
Die hier vorgestellte Diplomarbeit ist bei der Firma Goebel in Au in der Hallertau erstellt
worden.
Der Bereich Instrumentelle Analytik umfasst den Vertrieb, die Installation und den
Service für Komplettlösungen der HPLC sowie der Photometrie.
Durch meine Diplomarbeit bekam ich einen guten Einblick in die Entwicklung und
Validierung von Datensystemen. Auch im Bereich Instrumentelle Analytik konnte ich
mein Hintergrundwissen sehr stark verbessern.
Ein ganz besonderer Dank geht an dieser Stelle an Herrn Thomas Weißbach, der mir
ermöglicht hat, diese interessante Diplomarbeit zu schreiben.
Des Weiteren möchte ich mich bei meinem Betreuer Herrn Ludwig Jaufmann bedanken,
der mir eine gute Vorgehensweise für die Diplomarbeit aufgezeigt und mir trotzdem viel
Freiheit bei der Ausarbeitung gelassen hat.
Auch die Herren Klaus Lux, Jürgen Deya und Andreas Dieges standen mir stets mit Rat
und Tat zur Seite.
Ein weiteres Dankeschön gebührt meinem Betreuer an der Hochschule München, Herrn
Prof. Dr. Otto Parzhuber für seine Unterstützung.
Generell herrscht innerhalb der Firma Goebel in Au ein angenehmes und sehr
kollegiales Betriebsklima, was sich auf die Erstellung meiner Diplomarbeit sehr hilfreich
und motivierend ausgewirkt hat.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
1. Abstrakt
1.1 deutsch
Diese Arbeit „Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems“ beschäftigt
sich zunächst mit den Grundlagen der HPLC ( High Performance Liquid
Chromatography ), in dessen Bereich die zu validierende Software verwendet wird.
Ein strukturierter Validierungsplan gewährleistet, dass alle wichtigen Funktionen des
Chromatographie-Datensystems gründlich überprüft werden. Dies ist wichtig, um zu
garantieren, dass ein qualitativ hochwertiges Produkt zeitnah auf den Markt gebracht
werden kann. Anschließend wird das Datensystem selbst genauer beschrieben, welche
Aufgaben es bewältigen muss und welche Funktionalitäten gefordert werden.
Den Hauptteil dieser Diplomarbeit bildet aber der erarbeitete Validierungsplan selber.
Der Validierungsplan enthält eine komplette Auflistung aller Funktionen. Darüber
hinaus werden Funktionen der Wichtigkeit nach beurteilt. Die Prüfung aller Funktionen
ist im Validierungsplan abgedeckt und muss nachweisbar sein.
Durch diesen Plan soll die Qualität des Produktes bereits während der Entwicklung
abgesichert werden.
1.2 english
This assignment „Validation Plan of a Chromatography-Data System“ is about the
basics of the HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ), where the Software
is used for.
A structured validation plan ensures that all important functions of the chromatography
data system software are well checked. This is important because it guarantees to
release a quality product in time to the market. Further the data system will be
discribed, which problems it has to handle and what kind of functions it must have.
The mainpart of this degree dissertation is the validation plan. The validation plan
contains a complete list of all functions and all functions will be assessed because of
their priority. This validation plan is including the tests for all functions and it has to be
verifiable. Because of this plan the quality of the product has to be confirmed already
during the development time.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
2. Einleitung
2.1 Motivation
Alle Arzneimittel, die in Europa hergestellt oder verkauft werden, unterliegen strengen
Regeln über Zusammensetzung, Herstellungsverfahren und Qualität - von der
einfachen Tablette, die mit einem Glas Wasser geschluckt wird, bis hin zu komplexen
Behandlungen. Unter der Schirmherrschaft des Europarates nimmt in Europa und
weltweit die Europäische Direktion für die Qualität von Medikamenten ( EDQM ) einen
Großteil dieser Aufgaben wahr.
[ COE ]
Da Software zunehmend zu einem integralen Bestandteil von Produkten und Systemen
wird und in Kenntnisnahme der zunehmenden Wichtigkeit von Software, insbesondere
im Bereich der Medizinprodukte, sind in den letzten Jahren eine ganze Reihe von
spezifischen normativen Anforderungen entstanden.
Die Risikobeherrschung durch einen sicherheits- und qualitätsorientierten
Softwareentwicklungsprozess gewinnt daher immer mehr an Bedeutung. Die
entwicklungsbegleitende Unterstützung des normkonformen Entwurfs und der Wartung
von Software, soll die Entwicklung von Anfang an zu einem zertifizierungsfähigem
Produkt lenken.
Durch die Validierung einer Software wird laut der europäischen Normung ( EN 60601-
1-4 und EN 62304 ) ein Dokumentationsverfahren zum Erbringen, Aufzeichnen und
Interpretieren von Ergebnissen verstanden, die zeigen, dass ein Verfahren dauerhaft
die vorgegebenen Spezifikationen erzeugen kann.
[ UNI ]
Um eine zeitgemäße, konkurrenzfähige und vor allem für den Kunden intuitiv zu
bedienende Softwaremöglichkeit bieten zu können, wird bei der Firma Goebel ein
komplett neu aufgesetztes Datensystem ( Geminyx III ) zur Steuerung und Auswertung
von HPLC-Anwendungen in Zusammenarbeit mit einem externen Softwarehaus
entwickelt.
In diesem Zusammenhang wurde von der Firma Goebel eine Verfahrensanweisung zur
Regelung der Softwareentwicklung und Pflege mit externen Software-Häusern erstellt.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Diese Regelungen umfassen im allgemeinen das Verhältnis mit externen Software-
Häusern zur Entwicklung und Validierung neuer Software, aber auch zur Pflege, zur
Funktionserweiterung und zum Debugging existierender Software.
Dadurch soll gewährleistet werden, dass die Software-Entwicklung exakt nach den
Vorgaben des Lastenhefts der Kunden und dem daraus resultierenden Pflichtenheftes
des Software-Hauses erfolgt. Des weiteren müssen die definierten Qualitätsziele
unbedingt eingehalten werden und der Zeit- und Kostenrahmen für die Projekte darf
nicht gesprengt werden. Auch Änderungen zur Fehlerbeseitigung und zur
Funktionserweiterung müssen kontrolliert durchgeführt werden, sodass der hohe
Qualitätsstandard, auch während der Lebenszeit einer Software, aufrecht erhalten bzw.
sogar noch weiter gesteigert werden kann.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
2.2 Die HPLC
2.2.1 Grundlagen der HPLC
Abbildung 1: Komplette HPLC-Anlage der Firma Goebel
Die HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ) hat sich im vergangenen
Jahrzehnt zu einer leistungsfähigen Trenn- und Analysentechnik entwickelt, deren
Anwendungsbereich von der Analytik von anorganischen und organischen Ionen,
neutralen organischen Stoffen, Metallchelaten bis zu den Polymeren reicht. Diese
Anwendungsbreite und ihre Verwendung als Multikomponentenanalysentechnik haben
sie zu einem unentbehrlichen Werkzeug in der Umweltanalytik, pharmazeutischen
Industrie, Lebensmittelchemie, Biochemie u.a. werden lassen.
Die moderne HPLC ergänzt die stoffbedingt eingeschränkten Möglichkeiten der
unzweifelhaft höchst leistungsfähigen Kapillargaschromatographie.
Flüssigkeitschromatographisch sind schwerflüchtige, flüssige und thermolabile Proben
auch mit komplexer Zusammensetzung analysierbar. Voraussetzung ist eine
ausreichende Löslichkeit des Analyten im Laufmittel. [ HPLC 1 ]
Bei der HPLC handelt es sich um ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem
die zu untersuchende Substanz, zusammen mit einem Laufmittel , der mobilen Phase,
( auch "Elutionsmittel" oder "Eluent" genannt ) durch eine so genannte Trennsäule,
welche die stationäre Phase enthält, gepumpt wird. Eine Trennsäule in einem HPLC-
Gerät ist zwischen 1,8 und 30 cm lang und hat zumeist einen Innendurchmesser von 2-
6 mm, im Falle von analytischen HPLC-Systemen. Gelegentlich wird eine so genannte
Vorsäule aus wirtschaftlichen Gründen vorgeschaltet; dabei handelt es sich um eine
kurze Säule, die Verunreinigungen von der Hauptsäule abhalten soll.
Der auf die wesentlichen Elemente reduzierte Aufbau einer typischen HPLC-Apparatur
kann der unten stehenden Abbildung 2 entnommen werden.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Legende der Buchstaben:
A = Eluentenreservoirs
Abbildung 2: Typischer Aufbau einer HPLC-Anlage
B = Elektromagnetische Mischventile mit Doppelhubkolbenpumpe
C = Überdruckventil
D = Druckkompensationsschleife um Pumpimpulse der Pumpe zu egalisieren
E = Mischkammer
F = Einspritzventil
G = Trennsäule
H = HPLC-Einheit
I = Detektor-Einheit ( z.B. UV-Spektrometer )
J = Computer-Interface
K = PC
L = Drucker zur Ausgabe der Ergebnisse
[ HPLC 2 ]
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
2.2.2 Trennverfahren der Substanzen
Die HPLC ist, wie oben schon erwähnt, ein Verfahren der Säulen-Flüssigkeits-
Chromatographie. Sie stellt ein Trennverfahren dar, bei dem die Probenflüssigkeit
mittels einer flüssigen Phase ( Eluent ) unter hohem Druck über die stationäre Phase
( Trennsäule ) transportiert wird.
Je nach Art der Wechselwirkung zwischen stationärer Phase, mobiler Phase und Probe
unterscheidet man in der Flüssigkeitschromatographie folgende Trennmechanismen:
Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch-, Ausschluss- und
Affinitätschromatographie.
Bei der HPLC finden hauptsächlich die Verfahren der Adsorptions- und
Verteilungschromatographie Anwendung.
Bei der Adsorptionschromatographie werden
die Probenmoleküle durch Dipol-Dipol-
Wechselwirkungen reversibel an die stationäre
Phase gebunden. Die Verweildauer der
Substanzen an der stationären Phase ist
aufgrund der unterschiedlich starken
Wechselwirkung mit der Oberfläche der
stationären Phase unterschiedlich lang. So
werden die Probesubstanzen voneinander
getrennt.
Bei der Verteilungschromatographie nutzt
man die unterschiedliche Löslichkeit der zu
trennenden Substanzen in den beiden Phasen
aus. In der Normalphasenverteilungs-
Abbildung 3: Trennsäule Chromatographie ist die stationäre Phase polarer
als die mobile Phase. In der Reversed-Phase ( RP-Umkehrphase )-Chromatographie
ist die mobile Phase polarer als die stationäre Phase. Die stationäre Phase kann an ein
Trägermaterial chemisch gebunden werden, oder das Trägermaterial wird einfach mit
der stationären Phase belegt. Die Reversed-Phase-Chromatographie wird vorwiegend
bei unpolaren oder wenig polaren Substanzen angewendet.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
In der HPLC unterscheidet man zwei Arbeitsweisen:
1. isokratisch:
Dabei bleibt die Zusammensetzung des Eluenten und die Fließmittelstärke während
des Trennvorganges konstant.
2. Gradientenelution:
Der Eluent wird während des Trennvorgangs variabel zusammengesetzt und die
Fließmittelstärke erhöht.
Wie man oben in Abbildung 3 erkennen kann, wandern die einzelnen Substanzen
eines Stoffgemisches unterschiedlich schnell durch die Trennsäule und somit durch
den gesamten Kreislauf. Dabei kann es dazu kommen, dass der gesamte
Analysevorgang viel zu lange dauert oder die einzelnen Peaks zu sehr abflachen. Es
entsteht das Problem, die Peak-Grenzen für die softwareinterne Flächenintegration
nicht mehr genau definieren zu können, wodurch die einwandfreie
Konzentrationsbestimmung einer Teil-Substanz nicht mehr gewährleistet ist.
Um diesem Problem Abhilfe zu schaffen, verwendet man die Gradientenelution.
Hierbei verwendet man zwei oder mehrere mobile Phasen( = Eluenten ). Zunächst
wird nur ein Eluent eingesetzt, bis die ersten Substanzen durch die Säule diffundiert
sind. Dann erst wird die zweite mobile Phase allmählich beigemischt und erreicht so,
dass auch die letzten Substanzen zügig und mit einem halbwegs schlanken Peak aus
der Säule kommen.
Wenn hingegen, bei einfacheren Aufgaben, nur ein Eluent ausreicht, spricht man von
einer isokratischen Trennung.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
2.2.3 Arbeitsweise einer HPLC-Anlage
Abbildung 4: Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage
Ein HPLC-Aufbau besteht aus 4 Hauptteilen:
Pumpe, Einspritzsystem ( Autosampler ), Trennsäule und Detektor mit
Auswertesystem.
Die HPLC verwendet Trennpartikel mit Korngrößen von 3 bis 10 µm ; sie erreicht damit
hohe Trennstufenzahlen, erfordert aber gleichzeitig die Überwindung eines relativ
hohen Gegendrucks beim Transport der mobilen Phase durch die dünne Trennsäule
( 2 - 6 mm Durchmesser ). Alle Teile müssen möglichst totvolumenfrei miteinander
verbunden werden und druckstabil sein ( bis ca. 300 bar ).
Bei der Probenaufgabe wird die Probe zunächst drucklos in eine Probenschleife
injiziert, die sich in einem 4-Wege-Ventil befindet ( Autosampler ). Durch Umschalten
wird der Elutionsmittelstrom dann durch die Probenschleife geführt, wodurch die Probe
in die Säule gelangt. Die analytische Trennsäule, meist aus Edelstahl, sollte
thermostatisierbar sein. Zur Detektion werden UV/VIS-, Fluoreszens-Spektrometer,
RI-amperometrische und Leitfähigkeits-Detektoren mit Durchflusszellen verwendet.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Die Darstellung des Ergebnisses der Stofftrennung erfolgt in Form eines
Chromatograms, einer Elutionskurve. Sie stellt die Abhängigkeit der Menge
( Konzentration ) der eluierten Substanzen von der Zeit dar. Die einzelnen Stoffe
haben unterschiedliche Retentionszeiten. [ HPLC 3 ]
Abbildung 5: Chromatogram
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
2.3 Erläuterung der Gliederung
In Kapitel 2 werden die Grundlagen der HPLC erklärt. Dabei wird zunächst
beschrieben, was man sich unter HPLC vorzustellen hat und wie es sich über die
letzten Jahrzehnte entwickelt hat. Des weiteren werden die chemischen Hintergründe,
der hier angewendeten Analyse, angesprochen, um die Arbeitsweise dieser Anlagen
und somit auch der zu validierenden Software zu verstehen.
Kapitel 3 beschäftigt sich mit den grundlegenden Aufgaben eines Chromatographie-
Datensystems. Angefangen mit der Steuerung einer solchen Anlage, über die
Aufnahme der Daten und deren Auswertung, bis hin zu qualitativen Aussagen, die
getroffen werden können.
Die detaillierte Funktionsbeschreibung der Software erfolgt in Kapitel 4. Es werden
hier alle möglichen Funktionen der Software vorgestellt und deren Funktionen erklärt.
Dies ist wichtig, um später die Testprozeduren verstehen zu können.
Den Kern der Arbeit stellt Kapitel 5 dar, in dem die Testabläufe vorgestellt werden. Da
der Test der kompletten Software zu umfangreich wäre, werden hier nur die wichtigsten
Teile des Datensystems behandelt.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
3 AUFGABEN EINES CHROMATOGRAPHIE-DATENSYSTEMS
3.1 Steuerung der Anlage
Wie oben schon kurz erwähnt, wird von der Firma Goebel ein neues Datensystem
entwickelt, die Geminyx III.
Ein großer Aufgabenbereich der Software ist es, die in dem System eingebundenen
Komponenten, wie Pumpen, Detektoren etc., steuern zu können. Geminyx III kann
zwei komplette Chromatographie-Anlagen gleichzeitig steuern.
Jede der beiden Anlagen kann folgende Komponenten beinhalten:
● Ein bis drei Pumpen ( für isokratische Applikationen oder Gradientenelution )
● Einen automatischen Probengeber ( Autosampler )
● Einen Ofen
● Verschiedene Detektoren
● 8 Relais Anschlüsse
● Einen Dioden Array Detektor ( DAD )
Um all diese Komponenten, flexibel nach Benutzeranforderungen, zu einem System
zusammenstellen zu können, kann man mit Hilfe eines Konfigurationsprogramms die
unterschiedlichsten Varianten ermöglichen. Hierbei werden die benötigten
Gerätschaften ausgewählt und nach Kundenwunsch vorkonfiguriert.
In Abbildung 6 sieht man ein Beispiel eines kundenspezifischen, so genannten
modularen Aufbaus eines Systems.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Abbildung 6: Modularer Aufbau
Man kann dieses System manuell steuern indem man, für jede Komponente einzeln,
die Werte definiert. Dies wird häufig nur bei Sonder- und Probeläufen verwendet.
Oder man kann ein Steuerprogramm, das so genannte Programm File, erstellen,
wobei eine automatische Abarbeitung erfolgt. Der Vorteil eines Programm Files ist, es
bei gleichen Applikationen immer wieder aufrufen zu können und nicht ständig aufs
neue manuelle Eingaben machen zu müssen.
3.2 Datenaufnahme und Rohdatenspeicherung
Dies gilt auch bei der Datenaufnahme. Man kann einen Lauf entweder manuell starten
oder über das oben erwähnte Programm File. Bei beiden Möglichkeiten kann man die
Datenaufnahme über eine Online-Maske in Echtzeit verfolgen. Aufgenommen werden
die Daten einerseits mittels eines A/D-Konverters, von Detektoren mit analogem
Signalausgang oder digital von einem DAD. Wenn man mehrere verschiedene
Programm Files oder immer das gleiche Programm-File verwenden möchte, kann man
dies über eine so genannte Sequenz automatisieren. Dies bietet die Möglichkeit,
einfach und bequem, auch langwierige Applikationen selbstständig automatisch
ablaufen zu lassen, ohne immer aufs Neue, Werte und Parameter einstellen zu
müssen. Wie genau die Rohdatenspeicherung funktioniert und gesteuert wird, wird in
Kapitel 4.2 Data näher erläutert.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
3.3 Auswertung
3.3.1 Bestimmung der Peak-Flächen
Ein sehr grundlegender Bestandteil der Software ist die genaue Erkennung von Peak-
Grenzen, bzw. die Bestimmung der Peak-Flächen. Durch die Peak-Fläche können
Aussagen über die Konzentration der einzelnen Substanzen eines Stoffgemisches
getroffen werden.
Abbildung 7: Chromatogram mit Peak-Grenzen
Bei der Berechnung der Peak-Fläche gilt:
Conc ~ ∫ Abs dFlow
mit: Conc = Konzentration einer Substanz im Stoffgemisch
Abs = Absorption ( Lichtabsorbtionen )
dFlow = Ableitung nach dem Fluss
Da aber der Eluentenfluss durch das HPLC-System immer konstant sein muss, wird
die Absorption nach der Zeit abgeleitet:
Conc ~ ∫ Abs dt
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Diese Berechnungen laufen normalerweise über die Peak-Fläche. Alternativ dazu gibt
es noch die Möglichkeit die Höhenauswertung zu wählen. Hier besteht der Unterschied
darin, dass die Konzentration nicht über die Fläche, sondern über die Höhe eines
Peaks bestimmt wird.
Die Höhenauswertung bietet bei manuellen Messungen die Möglichkeit, schneller und
mit weniger Aufwand, auch bei schlecht getrennten Peaks, eine Konzentrations-
berechnung durchzuführen. Da aber, durch leistungsfähigere Computer, der geringere
Rechenaufwand der Peaks-Höhenmessung nicht mehr so sehr ins Gewicht fällt, stellt
sich nicht die Frage welche Methode besser oder schlechter ist. Man muss abwägen,
welche von beiden Methoden man bei welchen Voraussetzungen verwendet. Dabei
spielen viele Faktoren, wie das Rauschen oder die Peak-Asymmetrie, eine
entscheidende Rolle.
3.3.2 Manuelle Integration
Man kann aber auch, durch Veränderung der Parameter, Einfluss auf die Peak-
Erkennung nehmen. Beispiele hierfür sind, die manuelle Verschiebung von Peak-
Grenzen, Anpassung der Basislinie oder die graphische Definition von
Aufsetzer-Peaks.
Was dies im Einzelnen bedeutet, sowie die genaue Funktionalität der Peak-Erkennung,
wird in Kapitel 4.2.3.3 Integration genauer erläutert.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
3.3.3 Erstellen von Kalibrierungskurven
Anhand der gewonnenen Rohdaten mehrerer Läufe können Kalibrierungskurven der
Einzelnen Peaks ( Substanzen ) erstellt werden. Bei der graphischen Darstellung der
Kalibrierungskurve sollten, neben dem Graphen selber, auch sämtliche
Kalibrierungspunkte sichtbar sein. Ausgehend von der eingespritzten Substanzmenge
und der daraus resultierenden Peak-Fläche, wird von der Software die
Kalibrierungskurve errechnet.
Abbildung 8: Kalibrierungskurve am Beispiel Ethyl Ester
3.3.4 Mengenbestimmung aus Kalibrierfunktionen
Auf der Y-Achse wird die Response des Systems aufgetragen, was der Peak-Fläche
entspricht. Auf der X-Achse die eingespritzte Substanzmenge.
Ausgehend von der ermittelten Peak-Fläche, kann man nun die Kalibrierkurve
verwenden, um die eingespritzte Menge Wirksubstanz unbekannter Proben zu
bestimmen.
Abbildung 9: Kalibrierungskurve mit Mengenbestimmung
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
3.4 Reporting
3.4.1 Flexibler Reportgenerator
Das Reporting ist ein wichtiger Bestandteil der Software, um die aufgezeichneten
Daten für den Endanwender verständlich und nach seinen Bedürfnissen angemessen
darstellen zu können.
Dies umzusetzen, gewährleistet der flexible Reportgenerator. Hier können, die aus
dem Chromatogram berechneten Resultate, wie Substanzname, Menge usw.,
kundenspezifisch zusammengesetzt und in beliebiger Reihenfolge angeordnet werden.
Abbildung 10: Integriertes Chromatogram mit Reportgenerator
In Abbildung 10 sieht man, zum Einen das Chromatogram oben mit den berechneten
Peaks und zum Anderen darunter die Berechnungsresultate wie Menge ( Amount ),
Retentionszeit, Peakhöhe, Peakfläche und relative Fläche der einzelnen
Komponenten.
Diese Resultate werden vorher aus einer Liste ausgewählt und beliebig angeordnet.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
3.4.2 Druck / Export
Für Ausdrucke können so genannte „Templates“ erstellt werden. Dies sind
Dokumentvorlagen, die während der Berechnung, automatisch mit dem tatsächlichen
Inhalt der Probe gefüllt werden. Es ermöglicht dem Anwender, sich sein Dokument mit
den für ihn wichtigsten Daten, zu erstellen. Auch der äußere Rahmen lässt sich sehr
kundenspezifisch realisieren.
Abbildung 11: „Template“ - Konfigurator
Abbildung 11 zeigt eine solche Schablone. In diesem Beispiel wird ein Dokument, mit
Firmenanschrift und Logo im Kopf, Sequenz- und Methodenname, Chromatogram und
den Daten der berechneten Peaks, erstellt.
Neben dem üblichen Ausdruck, kann das erstellte Dokument auch in verschiedene
Formate, wie PDF-Files oder Excel-Tabellen bis hin zu HTML-Files, exportiert und
somit in den einzelnen Programmen weiterbearbeitet werden.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
3.5 Qualitative Information durch Spektrenvergleich
3.5.1 Darstellung des 3D - Datenfeldes
Mit Einführung des DAD´s und unter Verwendung von leistungsfähigeren Computern
wurde es möglich, Analysen von Stoffgemischen auch über das komplette Licht-
Spektrum, Wellenlänge für Wellenlänge abzutasten. Das bedeutet zum Beispiel, im
UV-Bereich von 195 nm bis 380 nm werden 186 Datenpunkte aufgezeichnet, wodurch
sich eine sehr hohe Auflösung ergibt. Dies ermöglicht es, zwei sich sehr stark ähnelnde
Substanzen einwandfrei voneinander unterscheiden zu können, was früher mit
konventionellen Methoden ( Detektor mit einer Wellenlänge ) nicht festzustellen war.
Mit konventionellen Detektoren konnte die Identität nur anhand der Retentionszeit, also
der Bindung der Komponente an die stationäre Phase der Trennsäule, bestimmt
werden.
Abbildung 12: 3D - Datenfeld
Ein solches 3D - Datenfeld ist in Abbildung 12 dargestellt. Die nach rechts verlaufende
X-Achse zeigt die Retentionszeit an, die nach oben gerichtete Y-Achse die Stoffmenge
und die nach hinten verlaufende Y-Achse bei welcher Wellenlänge gemessen wurde.
Bei näherer Betrachtung dieses Spektrums, hinsichtlich der für diese Auflösung
benötigten Datenpunkte, wird klar, welche hohen Rechnerleistungen benötigt werden.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
3.5.2 Extraktion von Spektren und Chromatogramen aus 3D
Aus dem in Abbildung 12 aufgezeichneten 3D - Datenfeld kann man nun ein Spektrum
zu jedem Zeitpunkt, sowie ein Chromatogram bei beliebiger Wellenlänge, erstellen
lassen. Dadurch hat man alle relevanten Daten einer Analyse kompakt und auf einem
Blick zusammengestellt. Man kann über das Spektrum, mithilfe einer so genannten
Bibliothekensuche, genau die Substanz bestimmen ( siehe Kapitel 3.5.3 Spektren-
Bibliothekensuche ). Aus dem Chromatogram kann man die einzelnen Komponenten
eines Stoffgemisches und deren Konzentration auslesen ( siehe Kapitel 2.2.3
Arbeitsweise einer HPLC-Anlage ).
Abbildung 13: Extraktion aus dem 3D - Datenfeld
In Abbildung 13 sieht man oben links die Draufsicht des Datenfeldes aus Abbildung 12.
Hier kann man auswählen bei welcher Retentionszeit und bei welcher Wellenlänge
man das Spektrum, sowie das Chromatogram extrahieren will.
In diesem Beispiel wird ein Spektrum bei der Retentionszeit 2,4 Minuten und ein
Chromatogram bei 245 nm gewählt.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
3.5.3 Spektren-Bibliothekensuche
Wie in Kapitel 3.5.2 Extraktion von Spektren und Chromatogramen aus 3D schon
kurz erwähnt, kann man mit der Software Substanzen über eine Spektrenbibliothek
genau bestimmen. Diese Bibliotheken werden durch wissenschaftliche Institute für
diesen bestimmten Zweck angelegt. Die hier verwendete Spektrenbibliothek wurde an
der Charité in Berlin entwickelt und von der Firma Goebel für die neue Software
zugekauft.
Alternativ kann der Benutzer durch die Analyse von Reinsubstanzen, unter den hier
benutzten applikativen Bedingungen, eine Spektrenbibliothek selbst erstellen.
Man kann anhand dieser Bibliotheken vordefinierte Spektren mit den Eigens
gemessenen vergleichen um festzustellen, um welche Substanzen es sich dabei
handelt.
Abbildung 14: Spektrenvergleich über Bibliothekensuche
In Abbildung 14 oben, wird zunächst das gesamte Chromatogram mit vier Substanzen
dargestellt. Unten sieht man die Spektren der gemessenen Substanzen, sowie die
darübergelegten Referenzproben des Instituts.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Daraus kann man ersehen, inwieweit die Proben übereinstimmen, oder ob
Verunreinigungen in die Proben gelangt sind. Im obigen Beispiel handelt es sich um
exakt die gleichen Substanzen. Eventuelle kleinere Abweichungen können natürlich
möglich sein. Sie basieren einerseits auf eventuell differenzierende Messaufbauten des
Instituts und des Kunden oder werden durch vergleichen des Rauschsignals ( siehe
Spektrum 1 und 2 ) hervorgerufen. Bei Spektrum 3 erkennt man visuell 100 prozentige
Übereinstimmung und bei Spektrum 4, bis auf das Rauschsignal im hinteren Teil,
besteht ebenfalls annähernde Simularität.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
3.5.4 Peak-Reinheits-Berechnung
Eine wichtige Grundvoraussetzung für das korrekte Ergebnis der Bibliothekensuche ist
es, dass der gesuchte Peak nur aus einer einzigen und nicht aus mehreren
verschiedenen Substanzen besteht. Wichtig bei der Peak-Reinheitsberechnung ist vor
allem, dass sich das UV Spektrum nicht ändert. Andernfalls kann bei Peaks, mit genau
der selben Retentionszeit, die einwandfreie Unterscheidung nicht gewährleistet
werden.
Abbildung 15: „Peak-Purity“ - Berechnung
In Abbildung 15 sieht man eine solche „Peak-Purity“ - ( Reinheits - ) Berechnung. Das
obere Schaubild zeigt vier Substanzen bei 240 nm. Die Reinheit ist hier farblich
unterschieden worden. Grün ist noch im Toleranzfeld für eine reine Probe, wobei blau
und rot Abstufungen bis hin zur verunreinigten Probe sind.
Das untere Diagramm veranschaulicht dies auch nochmal auf eine andere Art und
Weise. Hier entspricht der Wert 1000 ( ± der angegebenen Toleranz unter „Edit
Spectra Chart Parameter“ ) einer reinen Probe.
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4 DETAILLIERTE FUNKTIONSBESCHREIBUNG
4.1 Geminyx Main Menü
Das Hauptmenü der Geminyx III bietet eine komplette Übersicht über die
Hauptfunktionen „Data“ und „Configuration“ der einzelnen Sequenzen, die
Chromatograme der einzelnen Proben und deren Datenauswertung. Ebenso enthält
das Hauptmenü die Funktion „Import“, um Daten aus der Vorgängerversion
Geminyx II zu importieren.
4.2 Data
Abbildung 16: Geminyx III Hauptmenü
Die erste Hauptfunktion „Data“ ist in die folgenden vier wesentlichen Unterfunktionen
unterteilt:
● Sample Editor
● Calibration
● Methods
● Data
In diesen Unterfunktionen steuert man hauptsächlich die Verarbeitung und
Berechnung, sowie die Darstellung der aufgezeichneten Daten der Analysen.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.2.1 Sample Editor
Für jede einzelne Probe können hier Parameterwerte angegeben werden, die für den
Analyselauf wichtig sind.
Test zur Prüfung: Kapitel 5.1 Test der Funktion „Sample Editor"
Sample Name
Abbildung 17: „Sample“ - Editor
Der „Sample Name“ wird für Identifizierungszwecke genutzt.
Sample Position
Hier wird die Position der Probe im Autosampler angegeben. Diese wird automatisch
an den Autosampler übertragen. Somit wird sichergestellt, dass auch die gewünschte
Probe verwendet wird.
Weight
Dieser Parameter stellt einen Korrekturfaktor für die Mengenberechnung, falls
unterschiedliche Einwaagen der Probe benutzt werden.
Dilution
Der „Dilution“-Faktor ist ein Korrekturfaktor, der für die Mengenberechnung verwendet
wird, falls die Probe vor der Injektion verdünnt wird.
Calibration / Integration
Unter dieser Funktion wird festgelegt, ob mit dieser Probe kalibriert werden soll, oder
ob eine Flächenberechnung durchgeführt wird.
Calibration Level
Falls die Probe kalibriert werden soll, wird hier angegeben, in welchem Kalibrierungs-
Level die Probe verwendet wird.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Internal Standard Weight
Dies ist ein weiterer Korrekturfaktor für die Mengenberechnung, falls ein unkonstanter
Interner Standard verwendet wird.
4.2.2 Calibration
In dieser Funktion kann man mittels eines „Calibration Table“ Kalibrierungsgruppen
bearbeiten, die vorher in den entsprechenden Methoden erstellt worden sind.
Neben der Wahl des Druckreports ( Report ) können hier auch Angaben zur
Mengeneinheit ( Amount Dim ) und zur Art der Mengenberechnung ( Response )
gemacht werden. Hierbei kann man sich zwischen Flächen-, Höhen-, oder keiner
Kalkulation entscheiden.
Abbildung 18: „Calibration Table“
Zusätzlich können hier Parameter, für die Kalibrierung jeder einzelnen detektierten
Substanz, eingestellt werden. Es kann angegeben werden, welcher Kalibrierungstyp
verwendet werden soll, ob die Kalibrierungskurve durch den Ursprung gehen soll,
welche Gewichtung die Substanz hat, ob sie einen Internen Standard darstellt, oder
welche Substanz als Referenzsubstanz gilt. Alle diese Parameter werden in Kapitel
4.2.4 Data nochmal genauer ausgeführt.
Außerdem kann hier unter „Level“ noch bestimmt werden, in welcher Menge die
Substanz pro Kalibrierungs-Level eingespritzt werden soll.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.2.3 Methods
„Methods“ ist in sechs Unterfunktionen aufgeteilt:
● General
● Chart Layout
● Integration
● Print
● Calibration
● Results
Mit diesen sechs Unterfunktionen kann man für jeden aufgezeichneten Kanal einer
Methode einzeln, die Parameter für die graphische Darstellung, die Berechnung der
Peaks, den Ausdruck, die Kalibrierung und der darzustellenden Ergebnisse bestimmen.
4.2.3.1 General
Unter „General“ werden Daten wie Methodenname und aufzeichnender Kanal
angezeigt bzw. ausgewählt. Somit sind alle weiteren Parameter, die zum Beispiel in
„Chart Layout“ oder „Integration“ gesetzt werden, für jede Probe, die mit dieser
Methode und auf diesem Kanal aufgezeichnet werden, generell gültig.
Abbildung 19: Method Table „General“ - Funktion
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.2.3.2 Chart Layout
Die Funktion „Chart Layout“ unterteilt sich in die folgenden Funktionen:
● Chromatogram Chart Editor
● Spectra Chart Editor
Chromatogram Chart Editor
Abbildung 20: Method Table „Chart Layout“ - Funktion
Hier kann man in der Funktion „Chart“, von Achsenskalierung über
Achsenbeschriftung, bis hin zu farblichen Hintergründen, alles für die graphische
Gestaltung eines Chromatograms erstellen lassen.
Unter der zweiten Funktion „Series“ können alle Parameter der Peakdarstellung, wie
zum Beispiel Beschriftungsorientierung oder Schriftart, gewählt werden. Hauptsächlich
wird hier aber bestimmt, wie sich die Peakbezeichnung zusammensetzen soll.
Angefangen bei Peak-Fläche, Peak-Höhe, Peak-Nummer etc. kann man aus über 50
bestehenden Komponenten wählen.
Abbildung 21: „Chart Parameter“ - Editor
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Spectra Chart Editor
Ähnlich wie für das Chromatogram, kann man hier Parameter für die Darstellung im
Spektrenbereich vornehmen. ( siehe Kapitel 3.5 Qualitative Information durch
Spektrenvergleich )
Einerseits kann man Minimal- bzw. Maximalwerte der drei Achsen X, Y und Z, für die
3D-Darstellung bestimmen. Zusätzlich kann man hier X- und Y-Werte für den
„Contour-Plot“ angeben, sowie Parameter für die Peak-Reinheitsberechnung
bestimmen.
Abbildung 22: „Spectra Parameter“ - Editor
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.2.3.3 Integration
Bei der Funktion „Integration“ kann man Parameter folgender Unterfunktionen
einstellen:
● Baseline Subtraction
● Smooth Type
● Peak Table
● Group Table
● Integration Events
Test zur Prüfung: Kapitel 5.2 Test der Funktion „Integration"
Baseline Subtraction
Abbildung 23: Method Table „Integration“ - Funktion
Diese Funktion wird verwendet, um den Drift einer Basislinie rechnerisch kompensieren
zu können. Das ist wichtig, um die Fläche des Peaks und somit auch die
Substanzmenge korrekt bestimmen zu können. Gerade bei Gradientenläufen mit
Lösungsmitteln starker Unterschiede im Brechungsindex, steigt die Basislinie nicht
unerheblich an. Bei empfindlichen Läufen könnte dieser Basislinienanstieg zu
spürbaren Verfälschungen in der Flächenberechnung und damit in der Quantifizierung
führen.
Bei dieser Subtraktion wird zunächst ein Gradientenlauf aufgenommen, wobei
keinerlei Substanzen mit eingespritzt werden. Dieser Lauf zeigt somit nur die Basislinie
mit dem Drift ohne Peaks.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Dann wird der normale Analyselauf gestartet, bei dem das zu analysierende
Stoffgemisch eingespritzt wird. Nun kann man vom System den ersten Referenzlauf
gegen den zweiten Analyselauf abziehen lassen. Dadurch wird der Drift der Basislinie
kompensiert und es bleiben die Peak-Flächen der einzelnen Substanzen zur
Integration übrig.
Abbildung 24: Basislinie mit Drift
Unter „Baseline Reference“ kann man den Lauf angeben, der bei der
Basisliniensubtraktion als Referenzlauf gelten soll.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Smooth Type
Unter „Smooth Type“ kann man zwischen zwei verschiedenen Glättungsvarianten
eines Peaks entscheiden:
● Savitzky
● Rolling Average
Die „Savitzky-Golay-Glättung“, wie sie richtig bezeichnet wird, wird bei der
Auswertung von Spektren mit verrauschten Spektrallinien unterschiedlicher Breite
angewandt. Hierbei führt die Tiefpass-Filterung dazu, dass sich die Linien verbreitern
und in der Höhe reduziert werden.
Eingesetzt wird das Verfahren besonders, wenn ein Peak durch nur wenige Punkte
abgetastet wurde. Es lässt sich die Lage und die Höhe des Peaks schätzen, auch
wenn das Maximum zwischen zwei Abtastpunkte fällt.
Typische Anwendungen sind die Auswertungen von Infrarot-Spektren.
[ CES ]
„Rolling Average“ ist eine Methode zur Glättung eines verrauschten Signals, das die
Mittelwertbildung der Datenpunkte anwendet.
Man kann aber unter „Smooth Type“ auch komplett auf eine Glättung der Signale
verzichten.
Mit der Funktion „Smooth Level“ besteht weiterhin noch die Möglichkeit, die Intensität
der Glättung zwischen „Low“, „Medium“ und „High“, zu wählen.
Zu beachten ist aber besonders, dass bei unterschiedlichen Varianten und
unterschiedlicher Intensität auch abweichende Integrationsergebnisse entstehen
können.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Peak Table
Dieser Abschnitt wird verwendet, um die Peaks eines Chromatograms zu identifizieren.
Hierbei können für Peaks, die bei bestimmten Retentionszeiten identifiziert werden,
Namen zugewiesen werden.
Normalerweise werden Peaks automatisch, mithilfe der Spektrenbibliothek ( siehe
Kapitel 3.5.3 Spektren-Bibliothekensuche ), erkannt. Dies ist aber nicht möglich,
wenn sich die Retentionszeiten der Peaks verschieben.
Aus diesem Grund kann man ein so genanntes „Identification Table“ manuell mit
Peak-Namen und Retentionszeiten anlegen.
Wenn das Chromatogram schon berechnet wurde, wird diese „Identification Table“
automatisch mit den Retentionszeiten der integrierten Peaks gefüllt.
Abbildung 25: „Peak Identification“ - Funktion
Jede Zeile dieses „Tables“ steht für einen Peak. Hierbei sind Name der Komponenten,
Retentionszeit und Breite des Identifikationsfensters angegeben.
Bei diesem Fenster kann man zwischen absoluten ( min ) oder relativen Teil ( % )
unterscheiden. Diese definieren den maximalen Bereich um die angegebene
Retentionszeit, in der der genannte Peak spezifiziert ist.
Das absolute Identifikationsfenster wird in Minuten angegeben, wobei das relative
Fenster ein prozentualer Anteil der gewählten Retentionszeit ist.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Unter „Peak ID“ wird definiert, welcher Peak gewählt wird, wenn mehrere in einem
Identifikationsfenster gefunden werden:
First: Der Peak, der zuerst in diesem Fenster gefunden wird.
Highest: Der höchste Peak.
Nearest: Der Peak, dessen Retentionszeit am wenigsten von der definierten Zeit
abweicht.
Max. Area: Der flächenmäßig größte Peak.
Last:
Der Peak, der zuletzt in diesem Fenster gefunden wird.
Zusätzlich kann ein jeder Peak auch als so genannter Interner Standard ( IS )
ausgewählt werden.
Ein IS ist ein Hilfsmittel bei quantitativen Analysen, zur Erkennung von Fehlern,
während des Analyseverfahrens. Sie dienen als relative Bezugsgrößen, die den
Einfluss des Verfahrens auf das Ergebnis abbilden und eine Einschätzung der Qualität
des Verfahrens erlauben.
IS sind Stoffe, die dem Analyten möglichst ähnlich sind, in der Analysenprobe jedoch
nicht vorkommen. Ein IS wird jeder Probe in einem möglichst frühen Stadium des
Analyseverfahrens in definierter Menge hinzugefügt. Nach erfolgter Analyse wird das
Ergebnis des IS`s mit der erwarteten Menge verglichen ( Bestimmung des
Korrekturfaktors ). Hat der IS durch das Verfahren seine Konzentration verändert, wird
angenommen, dass sich die Konzentration des Analyten in gleicher Weise verändert
hat. Das Ergebnis des Analyten kann mit dem Korrekturfaktor des IS korrigiert werden.
[ INT 1 ]
mit:
KF = Korrekturfaktor
IS Soll = Interner Standard SOLL
IS Ist
KF = IS Soll / IS Ist
= Interner Standard IST
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Group Table
Hier gibt es zwei Arten von Gruppen: „Result Groups“ und „Calibration Groups“.
Beim erstellen einer „Result Group“ wählt der Benutzer ein Retentionszeitfenster aus,
wobei alle Peaks innerhalb dieses Zeitintervalls, zu einer Gruppe
zusammengeschlossen werden. Weiterhin können separat noch außerhalb liegende
Peaks, manuell hinzugefügt werden.
Diese Gruppe beinhaltet die integrierten und quantifizierten Ergebnisse dieser
Komponenten.
Bei der „Calibration Group“ werden die Peaks verschiedener Stoffe, zu einer Gruppe
zusammengefasst. Diese werden dann bei der Kalibrierung wie eine einzige Substanz
behandelt.
Gruppen werden gebildet, wenn chemisch instabile Stoffe Abbauprodukte bilden, wobei
aber nur die Gesamtmengen dieser Stoffgemische relevant sind und nicht die der
Einzelkomponenten. Das erleichtert die Berechnung und Auswertung einer solchen
Analyse.
Integration Event
Unter „Integration Event“ können genau die selben Parameter für die
Integrationsberechnung der Chromatograme eingestellt werden, wie unter „Integration
defaults“. Ausnahmen sind die beiden Parameter „Inhibit Integration“ und „Average
Noise“, die nur als lokale Parameter unter „Integration Event“ sinnvoll verwendet
werden können.
„Integration Event“-Parameter sind applikationsbezogene Werte, die nur lokal für
eine spezielle Methode gültig sind. Sind hier keine Werte eingestellt, werden zur
Berechnung die globalen, allgemein gültigen Parameterwerte der „Integration
defaults“-Funktion vom Programm verwendet.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Welche Parameter für die Berechnungen eingestellt werden können, wird unter Kapitel
4.3.2.4 Integration defaults ausführlich beschrieben.
Die nur unter „Integration Event“ gültigen Parameter, „Inhibit Integration“ und
„Average Noise“, sind wie folgt definiert:
● Inhibit Integration
Diese Funktion wird verwendet, wenn die Peak-Detektion und -Integration
für ein definiertes Zeitfenster unterdrückt werden soll.
Abbildung 26: Chromatogram ohne „Inhibit Integration“
Wie hier in Abbildung 26 gezeigt, können vor dem ersten entscheidenden
Peak Verunreinigungen auftreten, die aber für die Auswertung des
Chromatograms unwichtig sind.
Wenn diese Verunreinigungen, die bis zur Retentionszeit( RT ) 2.00 Minuten
auftreten, unterdrückt werden sollen, kann man die „Inhibit Integration“-
Funktion bei 0.00 Minuten starten lassen und beim Zeitpunkt RT = 2.00 Minuten
beenden. Die daraus resultierende Integration zeigt Abbildung 27.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Abbildung 27: Chromatogram mit „Inhibit Integration“
Man sieht nun in dem gewählten Zeitfenster keine Basislinienberechnung mehr.
Somit findet auch keine Integration der Peaks mehr statt. Erst ab dem
Zeitpunkt RT = 2.00 Minuten ist wieder eine Basislinie zu erkennen. Ab dort wird
das Chromatogram wie üblich integriert.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
● Average Noise
„Average Noise“ erlaubt es identifizierte Peaks zu filtern, die aber nur das
Ergebnis des Detektorrauschens sind. Laut Definition sind nur Peaks, die höher
als das angegebene Rausch-Level sind, wahre Peaks.
Die Geminyx III-Software kontrolliert das Detektor-Rauschen normalerweise
immer vor jedem Lauf automatisch, wodurch diese Funktion nur bei signifikanten
Veränderungen des Rauschens während der Läufe notwendig wird.
Abbildung 28: Peak mit detektiertem Rider-Peak
Wie in Abbildung 28 dargestellt, wird hier vom System ein Rider-Peak auf einem
Haupt-Peak detektiert. Dieser Rider-Peak resultiert aber nur aus dem
Signalrauschen des Detektors.
Die Höhe dieses Rider Peaks beträgt in etwa 100µV.
Wenn nun das „Average Noise“- Level auf 200 µV gesetzt wird, wird dieser
Rider- Peak nicht mehr als solches erkannt, sondern automatisch als Basislinie
definiert.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.2.3.4 Print
Unter „Print“ wird nur ein „Print Template“, dass unter der Funktion
„Configuration → Print Templates“ vordefiniert wird, für die gewünschte
Ausdrucksform ausgewählt ( siehe Kapitel 4.3.3 Print Templates ).
4.2.3.5 Calibration
In der Funktion „Calibration“ wird ebenfalls nur eine „Calibration Group“
ausgewählt, die in einem „Calibration Table“ vordefiniert wird ( siehe Kapitel 4.2.2
Calibration ).
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.2.3.6 Results
Hier kann sich der Benutzer über das „Result Layout“ seinen „Result Report“, der
nach der Berechnung unter dem Chromatogram erscheint, individuell
zusammenstellen. Er kann bestimmen, welche berechneten Kenngrößen des
Chromatograms für ihn wichtig sind und seinem Ausdruck beinhalten soll.
Man kann zwischen ca. 50 verschiedenen Datentypen wählen, wobei man unter der
Funktion „Configuration → Edit Variables“ ( siehe Kapitel 4.3.1 Edit Variables )
seinen eigenen Datentyp, mit eigener Berechnungsformel erstellen kann und diesen
jederzeit in den „Result Report“ mit einfügen. Auch die Reihenfolge der Auflistung ist
für den Benutzer frei wählbar.
Abbildung 29: „Result Layout“
In dem in Abbildung 29 gewählten Beispiel wird zunächst der Probenname, sowie der
Komponentenname angezeigt. Neben der Retentionszeit und der Peak-Höhe sind mit
Peak-Fläche und relative Peak-Fläche, sowie der Substanz-Menge, die fünf wichtigsten
Daten eines Chromatograms aufgeführt.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.2.4 Data
In der Unterfunktion „Data“ sind alle Daten der analysierten Proben folgendermaßen
aufgeführt:
Sequence Name
└ Sample Name
└ Method Name
└ Calibration Name
└ Component Name
Test zur Prüfung: Kapitel 5.3 Test der Funktion „Data"
Abbildung 30: Unterfunktion „Data“
Hier sind die Funktionalitäten der beiden Unterfunktionen „Calibration“ und
„Methods“ in einem zusammengefasst.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Sample Name
Unter „Sample Name“ wird das Chromatogram mit den berechneten Ergebnissen
dargestellt ( siehe Abbildung 30 ).
Method Name
Hier kann man, wie schon in Kapitel 4.2.3 Methods beschrieben, die wesentlichen
Parameter einer Methode einstellen.
Calibration Name
Unter „Calibration Name“ kann man die Einstellungen für eine Kalibrierungsgruppe
ändern ( siehe Kapitel 4.2.2 Calibration ).
Component Name
In der Funktion „Component Name“ werden zusätzliche Parameter, für die
Berechnung der Kalibrierungskurve einer Substanz, angegeben und eingestellt.
Abbildung 31: Kalibrierungskurve
In Abbildung 31 werden die Parameter einer Kalibrierungskurve, sowie die
Kalibrierungskurve selbst, mit Konzentrations- ( X-Achse ) und Flächenangabe
( Y-Achse ) gezeigt.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
● Component
Hier wird der Name der Substanz angezeigt, dessen Kalibrierungskurve gerade
modifiziert wird.
● Calibration Type
Unter „Calibration Type“ wird festgelegt, wie die Kalibrierungskurve berechnet
werden soll. Da diese mit steigender Konzentration immer nichtlinearer wird,
kann man, bezogen auf den Anwendungsbereich, diese Kurve linear,
quadratisch oder auch exponentiell berechnen lassen.
Bei normalen Konzentrationen, der zu analysierenden Probe, kann
weitestgehend die lineare Berechnung angewandt werden. Bei höheren
Konzentrationen, sollte die Berechnung quadratisch erfolgen.
Eine Kalibrierungskurve kann bis hin zum fünften Polynom berechnet werden,
falls die Anwendung diese Genauigkeit erfordert, wobei dies analytisch gesehen
wenig Sinn macht.
● Forcing Origin
Hierbei handelt es sich um die Berechnungen, mit sehr geringen
Stoffkonzentrationen, an der so genannten Nachweisgrenze. Diese befindet sich
am Schnittpunkt der Kalibrierungskurve und der X-Achse. Mit „Forcing Origin“
kann nun dieser Punkt in den Ursprung des Koordinatensystems gezwungen
werden. Dies ist aber in den seltensten Fällen ratsam, da dies die komplette
Berechnung der Originalkurve verfälscht.
● Scaling Factor
Dieser „Scaling Factor“ ist ein Multiplikator. Er wird als Faktor verwendet, wenn
man chemisch instabile Substanzen analysieren will und das Verhältnis
zwischen dieser und einer bereits bekannten Substanz kennt. Dieses Verhältnis
kann einschlägiger Fachliteratur entnommen werden.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
● Weighting
Je nach Kundenbedarf, wird bei „Weighting“ die Gewichtung auf die
Konzentrationen geändert. Je nachdem, in welchem Bereich der Anwender
seine Berechnungen durchführen will, wird die Gewichtung entweder auf einen
höheren bzw. niedrigeren Konzentrationsbereich gelegt.
x; x² :
Gewichtung steigt mit zunehmendem x-Wert der
Kalibrierungskurve ( Bereich hoher Konzentrationen ).
1/x; 1/x² : Gewichtung fällt mit zunehmendem x-Wert der Kalibrierungskurve
( Bereich niedriger Konzentrationen ).
● Internal Standard Reference
Hier kann angegeben werden, welcher der definierten Internen Standards für
diese Substanz als Referenz gelten soll.
● Calib is in Band
Für die Steigung der Kalibrierungskurve, wird hier ein Minimal- und ein
Maximalwert festgelegt. Falls nun ein neuer Kalibrierungslauf nicht in den
definierten Grenzen liegt, steht fest, dass in diesem Lauf Komplikationen
aufgetreten sind und er somit nicht für die Berechnung der Kalibrierfunktion
herangezogen werden darf.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.3 Configuration
Die zweite Hauptfunktion neben „Data“ besteht aus den unten aufgeführten drei
Nebenfunktionen:
● Edit Variables
● Option
● Print Templates
In diesen drei Funktionen werden die wesentlichen Konfigurationen und die
übergeordneten und allgemein gültigen Parameter, zur Berechnung und Ausgabe der
aufgezeichneten Daten, gesetzt.
4.3.1 Edit Variables
Test zur Prüfung: Kapitel 5.4.1 Test der Funktion „Edit Variables"
Abbildung 32: „Edit Variables“ - Funktion
Wie schon unter Kapitel 4.2.3.6 Results erwähnt, kann der Anwender unter „Edit
Variables“ eigene Berechnungsvariablen mit eigens erstellten Formeln editieren, die
später in den „Result Report“ eingefügt werden können.
Zum erstellen einer solchen Variablen, ist zunächst ein eindeutiger und eventuell
selbsterklärender Variablenname wichtig. Zudem wird hier jeder Variablen eine ID-
Kennung zugewiesen, die zusätzlich eine eindeutige Erkennung ermöglicht.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Falls kein selbsterklärender Variablenname zugewiesen werden konnte, besteht
weiterhin die Möglichkeit unter „Description“ eine kurze Beschreibung der Variablen
einzufügen, die durch die Help-Funktion dem Benutzer auch angezeigt wird. Diese drei
Parameter bilden den Kopf der Variablen, der zur eindeutigen Erkennung und
Zuweisung der Variablen dient.
Um jede Änderungen der Parameter nachvollziehen zu können, werden neben dem
Erstellungsdatum und Ersteller auch das Änderungsdatum automatisch erfasst und
dem eingeloggten Benutzer zugewiesen. Dies dient einerseits zur Vermeidung
unerwünschter Manipulationen aber auch zur lückenlosen Nachvollziehbarkeit der
Variablenerstellung.
Display Format
Hier kann der Benutzer festlegen, mit welcher Genauigkeit die Variable im „Result
Report“ angegeben wird, indem er unter „Display Format“ die gewünschten
Nachkommastellen angibt.
Sum
Abbildung 33: „Sum“ - Funktion
Unter „Sum“ wird lediglich ausgewählt, ob die berechneten Ergebnisse der
Einzelsubstanzen im „Result Report“ aufsummiert werden sollen oder nicht.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Var Type
In „Var Type“ wird grundsätzlich ausgewählt, welche Art von Variablen erstellt werden
soll.
Es gibt folgende drei Variablentypen:
● String: eine Abfolge von Buchstaben und Sonderzeichen, also eine
Zeichenkette.
● Integer: ganzzahlige Werte.
● Float: Gleitkommazahl.
User Definition
Hier wird nun die gewünschte Berechnungsformel der Variablen erstellt. Der Benutzer
hat hierbei die Auswahl, aus ca. 55 verschiedenen, automatisch bei der Integration des
Chromatograms berechneten, Ergebnissen. Diese können beliebig miteinander addiert,
subtrahiert, multipliziert und dividiert oder auch mit gewünschten Faktoren verrechnet
werden.
Hierbei gelten aber grundsätzlich immer die allgemeinen Rechenregeln und müssen
auch unbedingt eingehalten werden, um aussagekräftige und gültige Ergebnisse zu
erhalten.
Scope
Die Funktion „Scope“ wird verwendet, um zu definieren, ob eine Variable für einen
Peak, für eine Peak-Gruppe oder für die komplette Probe ( global ) gültig ist.
Peak-Variable werden in dem Peak-Report dargestellt, Gruppen-Variablen in den
Gruppen-Reports und globale Variablen können für alle Reports verwendet werden.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Origin
Das „Origin“ einer Variablen hängt ab von der Art, wie der Wert einer Variable
verfügbar ist. Für eine Standard-Variable ist die Quelle das System, das heißt, hier
werden die Variablenwerte vom System übernommen. Ist eine Variable als „User
Input“ definiert, können keine Werte übernommen werden, denn durch den Anwender
muss eine Eingabe erfolgen.
Benutzerdefinierte Variablen können, über ein „User Formular“, aus bestehenden
Kenngrößen, zusammengesetzt werden.
Dimension
Hier wird festgelegt, in welcher physikalischen Einheit die berechnete Variable
angezeigt werden soll.
4.3.2 Option
Die Funktion Option ist in vier wesentliche Unterfunktionen unterteilt:
● General
● Company
● Charts
● Integration defaults
● Spectra defaults
In diesen vier Funktionen werden die grundlegenden Konfigurationen für den
Seitenkopf des „Print Reports“ eingestellt, sowie die allgemein gültigen
Benutzerfestwerte der Integration der Peaks eines Chromatograms festgelegt.
Test zur Prüfung: Kapitel 5.4.2 Test der Funktion „Option"
4.3.2.1 General
Unter „General“ wird der Konfiguration ein eindeutiger Name zugewiesen.
4.3.2.2 Company
In der Funktion „Company“ wird der zu verwendete Firmenkopf für den „Print
Report“ erstellt. Neben dem Firmennamen, der Abteilung und dem Bürositz, kann das
Firmenlogo mit eingefügt werden. Dieser Kopf wird somit bei jedem Ausdruck auf jeder
Seite mit ausgegeben.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.3.2.3 Charts
Hier können die Farben ausgewählt werden, die verwendet werden sollen, wenn
Chromatograme verschiedener Läufe übereinander gelegt werden.
4.3.2.4 Integration defaults
In der Konfiguration „Integration defaults“ werden die allgemein gültigen Parameter
für die Integration der Peaks eines Chromatograms gesetzt.
Abbildung 34: „Integration defaults“ - Funktion
Unter „Min. Area“, „Min. Height“ und „Min. Width“ werden Minimumwerte für
Fläche, Höhe und Breite angegeben, ab denen ein Peak erst berechnet werden soll.
Das dient dazu, unerwünschte Rauschsignale zu unterdrücken und aus der Peak-
Erkennung und Peak-Berechnung auszugrenzen. Laut Definition sind demnach alle
unterdrückten Peaks als Basislinie zu betrachten. Dies erleichtert dem Benutzer die
Bewertung eines Chromatograms.
Um die unten aufgeführten Funktionen „Rider Threshold“ und „Max. Rider Ratio“
besser verstehen zu können, wird hier zunächst der Begriff „Skimming“ näher erklärt.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Das so genannte „Skimming“ erlaubt es dem Benutzer einen nicht berücksichtigten
Peak, nahe eines größeren erkannten Peaks, entweder als so genannten Rider-Peak
zu berechnen oder beide Peaks durch eine Lotfällung an geeigneter Stelle zu trennen
und als zwei separate Peaks zu integrieren.
Wenn nun der Peak als Rider-Peak berechnet werden soll, wird die Fläche des
kleineren Peaks so bestimmt, dass von Anfang bis Ende des Peaks eine Tangente
gebildet wird, wodurch die Fläche unterhalb dieser Tangente zu der Fläche des
größeren Peaks hinzu addiert wird
Rider Threshold
Abbildung 35: Peak mit Rider-Peaks
„Rider Threshold“ unterdrückt den Algorithmus des „Skimmings“, wenn das Tal
zwischen den beiden relevanten Peaks schon relativ nahe der eigentlichen Basislinie
liegt. Falls das „Rider Ratio“-Kriterium erfüllt sein sollte, das Tal aber unterhalb des
eingestellten Grenzwertes liegt, so werden die beiden Peaks, wie oben schon erwähnt,
durch Lotfällung getrennt und die Flächen separat für jeden Peak einzeln berechnet.
Abbildung 36: „Rider Threshold“ - Funktion
- 56 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Max. Rider Ratio
„Max. Rider Ratio“ definiert die obere Grenze, bei der der kleinere Peak noch als
Rider-Peak berechnet werden kann.
Wenn der Anteil der Höhe, zwischen dem Scheitel des kleineren Peaks und dem Tal
zwischen den beiden Peaks und der totalen Höhe des größeren Peaks, kleiner ist als
des eingestellten Wertes des „Max Rider Ratio“, dann ist neben dem „Rider
Threshold“-Kriterium auch dieses Kriterium erfüllt.
Allgemein gilt:
Abbildung 37: „Rider Ratio“ - Funktion
h < [ Max. Rider Ratio ] * H UND d > [ Rider Threshold ] * H
Nur wenn beide Kriterien erfüllt sind, kann der kleinere Peak als Rider-Peak des
größeren Peaks berechnet werden.
- 57 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Detect Negative Peaks
Diese Funktion wird angewendet, wenn negative Peaks identifiziert und integriert
werden sollen.
Abbildung 38: „Negativ Peak Detection“ - Funktion
In Abbildung 38 erkennt man die Basislinie, die unter dem positiven und über dem
negativen Peak verläuft. Dies bedeutet, die „Detect Negative Peak“-Funktion ist aktiv.
Somit wird neben dem ersten Peak auch der zweite, negative Peak berechnet.
- 58 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Lock Baseline
Geminyx III berechnet die Basislinie automatisch, nachdem das komplette
Chromatogram analysiert und charakterisiert wurde. Deshalb ist es normalerweise
nicht notwendig, die Basislinienberechnung durch Parameter zu beeinflussen.
Falls der Anwender dennoch eine andere Basislinienberechnung wünscht, kann diese
folgendermaßen durch drei verschiedene Einstellungen beeinflusst werden:
● Lock Baseline = 0
Die „Lock Baseline“-Funktion mit dem eingestellten Parameter = 0 beeinflusst
die automatische Berechnung der Basislinie nicht.
Abbildung 39: „Lock-Baseline“ = 0
Hier wird die Basislinie automatisch von „Valley“ zu „Valley“ zwischen den
einzelnen Peaks berechnet.
- 59 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
● Lock Baseline = 1
Diese Basislinie wird immer vom Anfang bis zum Ende einer Peak-Gruppe
berechnet.
Falls das Tal zwischen zwei Peaks einer Gruppe oberhalb der Basislinie liegt,
was normalerweise immer der Fall ist, werden die beiden Peaks durch eine
Lotfällung getrennt und die Flächen dann separat berechnet.
● Lock Baseline = 2
Abbildung 40: „Lock-Baseline“ = 1
Hier zählt der Zeitpunkt, ab dem der „Lock Baseline“-Parameter auf Zwei
gesetzt wird. Der zu diesem Zeitpunkt bestehende Signalwert wird als
Basislinien-Level definiert und ist solange gültig, bis entweder der „Lock
Baseline“-Parameter auf Null gesetzt oder gelöscht wird.
Abbildung 41: „Lock-Baseline“ = 2
- 60 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
● Lock Baseline = 3
Mit dem eingestellten Parameter Drei, wird der niedrigste Signalwert des
Chromatograms als Baseline-Level gewählt. Auch dieses Level ist solange
gültig, bis entweder der „Lock Baseline“-Parameter auf Null gesetzt oder
gelöscht wird.
Valley to Valley
Abbildung 42: „Lock-Baseline“ = 3
Diese Funktion hat die gegenteilige Wirkung wie oben in „Lock Baseline“
beschrieben. Hier wird das Tal zwischen zwei Peaks für die Berechnung der Flächen
immer mit der Basislinie verbunden. Aus diesem Grund kann die „Valley to
Valley“-Funktion nie zusammen mit der „Lock Baseline“-Funktion verwendet werden.
Die zuletzt ausgewählte Funktion deaktiviert automatisch die zuvor ausgewählte.
Filter Length
Diese Funktion erlaubt eine Filterung von vermeintlich erkannten Peaks, die aber nur
durch kurzzeitig auftretendes Signalrauschen des Detektors verursacht werden. Per
Definition werden nur Peaks als reale Peaks erkannt, deren Flanken breiter sind, als
die in der Funktion „Filter Length“ angegeben.
Ein Richtwert hierfür ist üblicherweise 50% der Flanke des kürzesten realen Peaks.
Smooth Type & Smooth Level
Hier wird die Peak-Glättung und deren Intensität eingestellt. Diese Funktionen werden
unter Kapitel 4.2.3.3 Integration → Smooth Type ausführlich beschrieben.
- 61 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.3.2.5 Spectra defaults
Match Factor Exponent
Hier kann die Sensibilität der Reinheitsberechnung der einzelnen Substanzen eines
Chromatograms eingestellt werden. Man kann zwischen dem Faktor 2 und 3 des
Exponenten wählen, wobei mit aufsteigendem Faktor die Sensibilität erhöht wird.
Die Reinheitsberechnung wird in Kapitel 3.5.4 Peak-Reinheits-Berechnung
ausführlicher beschrieben.
4.3.3 Print Templates
„Print Templates“ sind Vorlagen für einen Druckreport ( siehe auch Kapitel 3.4.2
Druck / Export ). Hier wird eine Maske erstellt mit fixen und variablen Texteinheiten,
die dann nach der Berechnung einer Analyse vom System automatisch eingesetzt
werden.
4.3.3.1 Template Groups
Hier kann eine Gruppe erstellt werden, in denen einzelne Reportvarianten
zusammengefasst werden können. Somit kann man immer auf verwendete Standards
zurückgreifen und muss nicht ständig neue Templates für die einzelnen Anwendungen
zusammenstellen. Es stehen folgende Reportarten zur Verfügung:
● Single Chromatogram
● Spectra Surface
● Spectra Contour
● Spectra all
● Calibration
● Method
● Chromatogram
- 62 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
4.3.3.2 Templates
Hier können die einzelnen „Templates“ nochmal benutzerspezifisch variiert werden.
Abbildung 43: Beispiel „Template“ - Vorlage
In Abbildung 43 sieht man ein Beispiel eines solchen „Templates“. Es können Fix-
Texte vom Benutzer frei wählbar eingefügt werden. Zusätzlich können diesen Fix-
Texten Variablen zugewiesen werden, die nach einer Analyseberechnung automatisch
eingesetzt werden. Logos bzw. Graphiken können ebenfalls verwendet werden.
- 63 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5 TEST ZUR PRÜFUNG
5.1 Test der Funktion „Sample Editor“
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sample Editor→ Sequenz „EXAMPLE“.
Ausgabe Der Sample Editor wird angezeigt.
Eingabe Wähle in der Toolbar „Sequential“.
Eingabe Bestätige mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ Sample 1-30.
Eingabe Bilde einen Overlay aller Läufe und lass sie integrieren.
Ausgabe Das Overlay-Chromatogram, sowie die Results aller Läufe
werden angezeigt.
Eingabe Lass von allen Läufen Single Chromatograme in PDF-
Format erstellen.
Eingabe Vergleiche die Werte der Flächen des PDF-Dokuments mit
den Flächenwerten des Result-Reports. ( Toleranz: maximal
0,1% ).
Beachte Die ersten vier Läufe bilden die Referenz für die weiteren
zehn Läufe und Lauf 15-18 die Referenz für Lauf 19-26.
- 64 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.2 Test der Funktion „Integration“
Test der Funktion „Integration Events“
Diese Tests sind geeignet um die Peak-Detektion und -Integration zu testen.
Min. Area
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird.
Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 30 eingetragen ist.
Falls nicht, ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert.
Es dürfen nur noch die Werte für „Propyl Ester“ und „Butyl
Ester“ angezeigt werden.
Die Werte müssen mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen ( Toleranz: maximal 0,1% bei der Fläche ):
- 65 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Min. Height
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „INTEG“→ „Sample 1“→
Methodenname „INTEG“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird:
Active RT[min] Name Value
0,00 Min. Height 10,00
Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 10 eingetragen ist.
Falls nicht, ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „INTEG“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „INTEG.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte müssen mit
den unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:
maximal 0,1% bei der Fläche ):
- 66 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Schritt Operation
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „INTEG“→ „Sample 1“→
Methodenname „INTEG“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt. Überprüfe, ob
nur eine Zeile angezeigt wird:
Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 20 eingetragen ist.
Falls nicht ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „INTEG“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „INTEG.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte müssen mit
den unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:
maximal 0,1% bei der Fläche ):
- 67 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Min Width
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird.
Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 0,50 eingetragen ist.
Falls nicht, ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz “EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert.
Es dürfen nur noch die Werte für „Ethyl Ester“, „Propyl
Ester“und „Butyl Ester“ angezeigt werden.
Die Werte müssen mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen ( Toleranz: maximal 0,1% bei der Fläche ):
- 68 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Rider Threshold & Max. Rider Ratio
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „080212“→ „Sample b“→
Methodenname „CASPO“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur zwei Zeilen angezeigt werden.
Kontrolliere, ob in der ersten Zeile „Max Rider Ratio“ und in
„Value“ der Wert 75 eingetragen ist. Und in der zweiten Zeile
„Rider Ratio“ und in „Value“ der Wert 25 eingetragen ist.
Falls nicht, ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz “080212“→ „Sample b“.
Ausgabe Das Chromatogram für „080212.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte müssen mit
den unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:
maximal 0,1% bei der Fläche ):
- 69 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Detect Negativ Peaks
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz “EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Der Wert für den
negativen Peak ( Nr. 3 ) muss mit dem unten angezeigten
Wert übereinstimmen ( Toleranz: maximal 0,1% bei der
Fläche ):
- 70 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Lock Baseline
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird.
Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 0 eingetragen ist
Falls nicht, ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte müssen mit
den unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:
maximal 0,1% bei der Fläche der 4 großen Peaks ):
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird.
Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 1 eingetragen ist
Falls nicht, ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
- 71 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Schritt Operation
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte müssen mit
den unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:
maximal 0,1% bei der Fläche der 4 großen Peaks ):
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird.
Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 2 eingetragen ist
Falls nicht, ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte müssen mit
den unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:
maximal 0,1% bei der Fläche der 4 großen Peaks ):
- 72 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Schritt Operation
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird.
Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 3 eingetragen ist
Falls nicht, ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte müssen mit
den unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:
maximal 0,1% bei der Fläche der 4 großen Peaks ):
- 73 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Inhibit Integration
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur zwei Zeilen angezeigt werden
Kontrolliere, ob unter „RT“ zuerst der Wert 0,00 eingetragen
ist und in der zweiten Zeile der Wert 2,00. Falls nicht,
ändere die Werte.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert und muss wie folgt
angezeigt werden.
Die detektierten Peaks vor RT = 2.00 min dürfen nicht
integriert werden.
- 74 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Schritt Operation
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methodenname „EXAMPLE“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur zwei Zeilen angezeigt werden.
Kontrolliere, ob unter „RT“ zuerst der Wert 5,50 eingetragen
ist und in der zweiten Zeile der Wert 6,00. Falls nicht,
ändere die Werte.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Ausgabe Das Chromatogram für „EXAMPLE.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte für „Propyl
Ester“ müssen mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen ( Toleranz: maximal 0,1% bei der Fläche ):
- 75 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Filter Length
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „080212“→ „Sample b“→
Methodenname „CASPO“→ „Integration“→ „Integration
Event“.
Ausgabe Der „Integration Event“-Editor wird angezeigt.
Überprüfe, ob nur eine Zeile angezeigt wird.
Kontrolliere, ob unter „Value“ der Wert 50 eingetragen ist.
Falls nicht, ändere den Wert.
Eingabe Verlass den „Integration Event“-Editor. Bestätige unter
„Method Table“ mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „080212“→ „Sample b“.
Ausgabe Das Chromatogram für „080212.SMP“ wird angezeigt.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das Chromatogram wird integriert. Die Werte f müssen mit
den unten angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz:
maximal 0,1% bei der Fläche ):
- 76 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3 Test der Funktion „Data“
5.3.1 Lineare Kalibrierung ohne Offset, externer Standard
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LIN“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „LIN“→ „Sample 9“→ Methode „LIN“→
Kalibrierung „CAL“→ Komponente „Methyl Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 77 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.2 Lineare Kalibrierung mit Offset, externer Standard
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINOFF“→ „Sample 9“
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „LINOFF“→ „Sample 9“→
Methode „LINOFF“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 78 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.3 Lineare Kalibrierung ohne Offset, interner Standard
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINIS“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „LINIS“→ „Sample 9“→
Methode „LINIS“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 79 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.4 Lineare Kalibrierung mit Offset, interner Standard
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINOFFIS“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „LINOFFIS“→ „Sample 9“→
Methode „LINOFFIS“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl
Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 80 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.5 Lineare Kalibrierung ohne Offset, interner Standard gewichtet
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINIW“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „LINIW“→ „Sample 9“→
Methode „LINIW“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 81 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.6 Lineare Kalibrierung mit Offset, interner Standard gewichtet
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „LINOFFIW“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „LINOFFIW“→ „Sample 9“→
Methode „LINOFFIW“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl
Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 82 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.7 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, externer Standard
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUA“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „QUA“→ „Sample 9“→
Methode „QUA“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 83 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.8 Quadratische Kalibrierung mit Offset, externer Standard
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAOFF“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „QUAOFF“→ „Sample 9“→
Methode „QUAOFF“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 84 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.9 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, interner Standard
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAIS“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „QUAIS“→ „Sample 9“→
Methode „QUAIS“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 85 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.10 Quadratische Kalibrierung mit Offset, interner Standard
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAOFFIS“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „QUAOFFIS“→ „Sample 9“→
Methode „QUAOFFIS“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl
Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 86 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.11 Quadratische Kalibrierung ohne Offset, interner Standard
gewichtet
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAIW“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „QUAIW“→ „Sample 9“→
Methode „QUAIW“→ Kalibrierung „CAL“→
„Methyl Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
- 87 -

Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.3.12 Quadratische Kalibrierung mit Offset, interner Standard
gewichtet
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „QUAOFFIW“→ „Sample 9“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die „Amount“-Werte müssen mit den unten
angezeigten Werten übereinstimmen ( Toleranz: maximal
0,1% beim Amount ):
Eingabe Wähle Sequenz „QUAOFFIW“→ „Sample 9“→
Methode „QUAOFFIW“→ Kalibrierung „CAL“→ „Methyl
Ester“.
Ausgabe Die Kalibrierungskurve mit den Kalibrierungsdaten wird
angezeigt. Die Werte müssen, im Rahmen der
Toleranzgrenzen, mit den unten angezeigten Werten
übereinstimmen:
Eingabe Überprüfe die Werte zusätzlich anhand einer Excel-Tabelle.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.4 Test der Funktion „Configuration“
5.4.1 Test der Funktion „Edit Variables“
Hier wird getestet, ob die Berechnungen der zusammengesetzten Variablen korrekt
sind.
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Configuration“→ „Edit Variables“
Ausgabe Der „Variable“-Editor wird angezeigt.
Eingabe Füge mit dem „+“ Zeichen aus der oberen Toolleiste eine
neue Variable ein.
Ausgabe Das Formular für die Erstellung einer neuen Variablen wird
angezeigt.
Eingabe Fülle das Formular folgendermaßen aus:
Name: Validierungsvariable
ID: VV
Decimals: 2
Sum: ja
Var Type: float
User Definition: Amount+Area
Scope: Peak
Origin: User
Eingabe Bestätige die Eingabe mit
Ausgabe Unter den bestehenden Variablen auf der linken Seite
erscheint eine neue Variable mit dem Namen
„Validierungsvariable“.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“→
Methode „EXAMPLE“.
Ausgabe Der Methoden-Editor wird angezeigt.
Eingabe Wähle „Results“→ „Grid Layout“.
Ausgabe Der „Result Layout“-Editor wird angezeigt.
Eingabe Klicke oben unter „Available Items“ die Variable
„Validierungsvariable“ an und ziehe diese bei gedrückten
Mouse-Button nach unten in den „Grid Layout“.
Ausgabe Das Feld für die Variable erscheint im „Grid Layout“.
Eingabe Bestätige mit OK.
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Schritt Operation
Ausgabe Das berechnete Chromatogram mit dem „Result Report“
wird angezeigt. Die Validierungsvariablen-Werte müssen
mit den unten angezeigten Werten übereinstimmen.
Area Amount Validierungsvariable
Unknown 2,70 0,00 2,70
Methyl Ester 23,30 10,03 33,33
Ethyl Ester 23,37 10,06 33,43
Propyl Ester 40,54 10,06 50,60
Butyl Ester 43,61 10,21 53,82
133,53 40,35 173,88
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
5.4.2 Test der Funktion „Option“
Schritt Operation
Anfangspunkt Geminyx wird geladen. Geminyx Hauptmenü wird
angezeigt.
Eingabe Wähle „Configuration“→ „Option“.
Ausgabe Der Options-Editor wird angezeigt.
Eingabe Füge mit dem „+“ Zeichen aus der Toolbar ein neues
Formular ein.
Eingabe Fülle das Formular folgendermaßen aus:
Configuration Name: Validierung
Company Name: Muster Company
Department: Muster Department
Office: Muster Office
Eingabe Bestätige die Eingabe mit
Eingabe Wähle „Data“→ Sequenz „EXAMPLE“→ „Sample 1“.
Eingabe Lass das Chromatogram integrieren.
Eingabe Lass das berechnete Chromatogram entweder im „Single
Chromatogram“-Modus oder im „Chromatogram“-Modus
drucken.
Ausgabe Der Kopf des Ausdrucks muss folgendermaßen angezeigt
werden:
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK
Um dem heutigen Qualitätsstandard, in Sachen Software, gerecht zu werden, ist es
unabdingbar, schon während der Entwicklungsphase eines Datensystems, auf
Normkonformität zu achten. Dies wird bei Softwareentwicklung grundsätzlich durch
einen Validierungsplan realisiert.
Der Validierungsplan gewährleistet, die gesetzten Qualitätsziele, in den vorgegebenen
Zeit- und Kostenrahmen, verwirklichen zu können. Des weiteren gestaltet sich die
Softwarepflege, auch nach dem Entwicklungszeitraum, mit einem Validierungsplan
wesentliche einfacher.
Das hier beschriebene Chromatographie-Datensystem wird im Bereich der HPLC
angewandt. Die HPLC beschäftigt sich mit der Trennung und der chemischen Analyse
von flüssigen Stoffgemischen. Dies wird hauptsächlich in der Pharmaindustrie genutzt,
um die Zusammensetzung der produzierten Wirkstoffe kontrollieren zu können. Vor
allem im medizinischen Bereich ist es wichtig, eine sicherheits- und qualitätsorientierte
Softwareentwicklung zu gewährleisten.
In dieser Arbeit werden die Funktionen im Vorfeld genau beschrieben, um den
Zusammenhang zwischen den in der Software verwendeten Funktionen und dem
erstellten Validierungsplan besser verstehen zu können.
Im Hauptteil der Diplomarbeit wird der, von mir erstellte, Validierungsplan behandelt.
Dabei steht im Vordergrund, die wichtigsten Funktionen des Datensystems, sorgfältig
und bis ins kleinste Detail zu testen.
Es ist klar, dass ein Validierungsplan in vollem Umfang den Rahmen einer Diplomarbeit
deutlich überschreiten würde. Aus diesem Grund werden in dieser Arbeit auch nur die
wichtigsten Funktionstests näher beschrieben.
Das nächste Ziel wird sein, den Validierungsplan für die Alpha-Version für alle
implementierten Funktionen zu vervollständigen und eine erste Test-Version an
ausgewählte Betatest-Kunden auszuliefern. Der vollständige Validierungsplan gibt
dann Aufschluss darüber, dass alle Funktionen zu 100% und darüber hinaus alle
wichtigen Funktionen in mehreren Kombinationen getestet werden. Die Software wird
dazu auch firmenintern, mit Hilfe des Validierungsplans, sorgfältig getestet.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
Ziel dieser umfangreichen Validierung ist es, möglichst alle Fehler in der Validierung zu
erkennen und bereits vor der ersten Release zu beheben. Nur durch diese sorgfältigen
und umfassenden formalen Tests können die hohen Anforderungen an eine Qualitäts-
Software für den Einsatz im Bereich "pharmazeutische Qualitätskontrolle" erfüllt
werden.
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
ÜBERSICHT CD-ROM
Ordner Inhalt
01 Diplomarbeit Diplomarbeit-Keller-2008.pdf
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
LITERATURVERZEICHNIS
[ COE ] http://www.coe.int/T/d/Com/Dossiers/Themen/Pharmakopoee/
[ UNI ] http://www.unitransferklinik.de/cc/software_validierung.php
[ HPLC 1 ] Universität Ulm, Abteilung Analytische Chemie und Umwelttechnik:
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).
[ HPLC 2 ] http://de.wikipedia.org/wiki/Hochleistungsfluessigkeitschromatographie
[ HPLC 3 ] http://www-proj.loel.hs-anhalt.de/oeko/vitamine/grdlhplc.html
[ CES ] https://ces.karlsruhe.de/culm/mathematik/filterung/savitzky.html
[ INT 1 ] http://de.wikipedia.org/wiki/Interner_Standard
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Validierungsplan eines Chromatographie-Datensystems
ERKLÄRUNG ZUR DIPLOMARBEIT
( gemäß § 13 Abs.5 RaPO )
Name: Markus Keller
geb.: 09.04.1980
Matrikelnummer: 13702101
06MFB im SS 2008
Hiermit erkläre ich, dass ich die Diplomarbeit selbstständig verfasst, noch nicht
anderweitig für Prüfungszwecke vorgelegt, keine anderen als die angegebenen
Quellen oder Hilfsmittel benützt sowie wörtliche und sinngemäße Zitate als solche
gekennzeichnet habe.
___________________ ___________________
Ort, Datum Unterschrift
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