Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf
charakteristische Eigenschaften primärer
Endothelzellen
Bachelorarbeit
zur Erlangung des akademischen Grades
Bachelor of Engineering (B. Eng.)
von
Melinda Sailer
März 2013
Hochschule München
Fakultät für Angewandte Naturwissenschaften und Mechatronik

Diese Arbeit wurde angefertigt unter der Aufsicht von:
Dr. Stefanie Sudhop
Fakultät für Angewandte Naturwissenschaften und Mechatronik
Hochschule München
München, Deutschland
Prof. Dr. rer. nat. Karlheinz Trebesius
Fakultät für Angewandte Naturwissenschaften und Mechatronik
Hochschule München
München, Deutschland
und
Dr. Roman Zantl und Dr. Julia Riedl
ibidi GmbH
Martinsried, Deutschland
2

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abstract 5
Abkürzungsverzeichnis 6
1 Einleitung 7
2 Material 9
2.1 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.3 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.4 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.5 Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.6 Hergestellte Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3 Methoden 13
3.1 Allgemeine Zellkulturstandards . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.2 Kultivierung und Passagieren der primären HUVEC . . . . . . . . . . . . . . 13
3.3 Kultivierung und Passagieren der immortalisierten HUVEC . . . . . . . . . . 13
3.4 Zellen auftauen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.5 Chemotaxis-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.5.1 2D-Chemotaxis-Assay - Zellaussaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.5.2 3D-Chemotaxis-Assay - Zellaussaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.5.3 Aufnahme am Mikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.5.4 Programmunterstützte Verfolgung der Zellen und Berechnung der Kennzahlen
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3.5.5 Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.6 Angiogenese-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.6.1 Einfüllen des Gels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.6.2 Zellaussaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.6.3 Aufnahme am Mikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.6.4 Bildauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.6.5 Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.7 Flow-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.7.1 ibidi Pump System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.7.2 Zellaussaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.7.3 Anschluss der µ-Slides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.7.4 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.7.5 Immunfluoreszenzfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.7.6 Aufnahme am Mikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.7.7 Bildbearbeitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4 Ergebnisse 31
4.1 Chemotaxis-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1.1 Rohdaten: Forward Migration Index und Ergebnisse des Rayleigh-Tests 31
4.1.2 Vergleich: Forward Migration Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.1.3 Rohdaten: Geschwindigkeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.1.4 Vergleich: Geschwindigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2 Angiogenese-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3

Inhaltsverzeichnis
4.3 Flow-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5 Diskussion 47
5.1 Chemotaxis-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.2 Angiogenese-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
5.3 Flow-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
6 Zusammenfassung 50
Danksagung 51
Abbildungsverzeichnis 54
Tabellenverzeichnis 55
Literatur 58
4

Abstract
Abstract
Primäre Endothelzellen werden für eine Vielzahl an Forschungsexperimenten verwendet. Beispiele
hierfür sind Forschungen, welche die Gefäßneubildung und die Migration untersuchen.
Um den Erfolg dieser Experimente nicht von der Heterogenität der primären Zellen abhängig
zu machen, geht man dazu über immortalisierte Endothelzellen zu entwickeln. Diese müssen
für eine Vergleichbarkeit die selben Eigenschaften wie die primären Zellen aufweisen. Die
gentechnisch veränderten Zellen müssen daher auf mögliche Unterschiede untersucht werden.
Mögliche charakteristische Eigenschaften können hierbei die chemotaktische Migration, die
Fähigkeit zur Tube formation, das Verhalten unter Fluss sowie physiologische Merkmale, wie
den von Willebrand-Faktor und die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten und Aktinfilamentbündeln,
sein. Dafür wurden vier Experimente herangezogen und zusätzlich eine Testversion
einer softwarebasierten Analyse des Verhaltens unter Fluss entwickelt.
Primary endothelial cells may be used for a variety of research experiments such as angiogenesis
and migration. To ensure that the success of these experiments is not depending on
the heterogeneity of the primary cells, one proceed to develop immortalized endothelial cells.
These must have the same characteristics for a comparability such as the primary cells. The
genetically modified cells have to be analyzed for possible differences. Possible characteristics
can here be the chemotactic migration, the ability to tube formation, the behavior under
flow and physiological characteristics, such as the von Willebrand factor and the formation
of cell-cell contacts and stress fibers. Therefore, four experiments were used and additionally
a trial version of a software-based analysis of the behavior under flow was developed.
5

Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
2D Assay Experiment in zweidimensionaler Ebene
3D Assay Experiment in dreidimensionaler Ebene
DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole
DMSO Dimethylsulfoxid
ECGM Endothelial Cell Growth Medium
FCS Fetale Calf Serum
FMI Forward Migration Index
g Erdbeschleunigung
h Stunde
HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells
ITO Indium Tin Oxid
µm Mikrometer
min Minute
PBS Phosphate Buffered Saline
TTL Total Tube Length
vWF von Willebrand-Faktor
6

1 Einleitung
1 Einleitung
Humane Endothelzellen wurden schon früh isoliert und kultiviert. Vor 40 Jahren beschreibt
Jaffe et al. (1973) in seinen Experimenten detailliert das Verhalten und die Morphologie von
Endothelzellen aus humanen Nabelschnurvenen (HUVEC) in vitro. Laut ihm bilden die Zellen
einen konfluenten Monolayer mit aneinanderliegender, homogener Zellstruktur. Die Zellen seien
polygonal mit einem ovalen, zentrierten Kern. Endothelzellen würden die Gefäßwände der
Arterien, Venen und Kapillaren auskleiden. Sie sollen einen gezielten Stoffaustausch zwischen
dem Gefäßlumen und dem umgebenden Gewebe vermitteln und somit eine Barrierefunktion
haben. Sie sind zudem an der Blutgerinnung und der Blutdruckregulation durch Vasodilatation
und Vasokonstriktion beteiligt (Stangl et al., 2004). Die Migration der Zellen in Richtung
eines Lockstoffes (Ridley et al., 2003) und die Fähigkeit zur Angiogenese spielt vor allem bei
der Vaskularisation von Tumoren und Transplantaten eine große Rolle (Santiago-Delpin and
Juan, 2004; Folkman, 1971).
Ein Bild primärer HUVEC ist in Abbildung 1 gezeigt.
Abbildung 1: Phasenkontrastbild primärer HUVEC. Der Größenbalken entspricht 500 µm.
Als physiologische Merkmale von Endothelzellen seien hier der von Willebrand-Faktor
(Schneider and Schneider, 2008), die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten (tight junctions)
(Wheelock and Johnson, 2003) und ebenso die Ausbildung von Aktinfilamentbündeln (stress
fibers) unter stressinduzierten Bedingungen genannt (Wong et al., 1983).
Endothelzellen werden in der Forschung vor allem eingesetzt, um die Blutversorgung von
Organen, Knochen und Tumoren untersuchen zu können (Jacoby, 2009). Die Verwendung von
primären Zellen weist dabei einige Nachteile gegenüber der Verwendung einer stabilen und
kulturfähigen Zelllinie auf. Schon bei den ersten Kultivierungsversuchen isolierter HUVEC
konnten diese nicht über einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden (Jaffe et al.,
1973). Die Eigenschaften der primären Zellen können von Spender zu Spender unterschiedlich
sein. Dies konnte am Beispiel des Spenderalters von v. J. Cristofalo et al. (1998) bewiesen
werden. Diese Heterogenität in den Zelleigenschaften schlägt sich auch auf die damit durchgeführten
Ergebnisse nieder, welche dadurch im schlimmsten Fall nicht mehr miteinander
vergleichbar werden. Außerdem ist der Vorgang der immer wieder neuen Isolierung der Zellen
zeitaufwändig und verursacht zusätzliche Kosten. Bei der Isolierung werden immer auch an-
7

1 Einleitung
dere Zellen, wie zum Beispiel Fibroblasten, mit isoliert und es entsteht somit eine heterogene
Zellpopulation (Jaffe et al., 1973). Primärzellen verlangen zudem meist ein speziell auf sie
abgestimmtes komplexes Medium und sind durch Transfektion nur mit erhöhtem Aufwand
zu manipulieren (Hamm et al., 2002).
Aufgrund dieses Mehraufwandes bei primären Zellen wird versucht stabile Zelllinien mit den
selben Eigenschaften zu finden bzw. zu entwickeln. Quellen solcher Zelllinien können Tumore
sein, welche aufgrund ihrer Eigenschaft als Tumorzelle eine Immortalisierung aufweisen (Jacoby,
2009). Eine weitere Möglichkeit ist, die isolierten Zellen so zu behandeln, dass daraus
immortalisierte Zellen entstehen.
Diese aktive Immortalisierung wird bei Ruley (1983) mit Adenoviren vorgenommen und
dabei gezielt Gene der Zellalterung ausgeschalten. Eine neuere Möglichkeit der Immortalisierung
ist das gezielte Einschleusen von Genen, welche die primären Zellen zur Proliferation
bringen (May et al., 2012). Dadurch wird eine homogene Zellpopulation gewonnen, deren
Erbstruktur gentechnisch weiter veränderbar ist. Das allerwichtigste Kriterium hierbei ist
aber die unbegrenzte Verfügbarkeit der Zellen. Die immortalisierten Zellen können lange Zeit
in Kultur gehalten werden. Somit sind auch Versuche über einen längeren Zeitraum mit derselben
Zelllinie möglich und die damit erzielten Ergebnisse bleiben vergleichbar.
In der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, ob sich primäre, frisch isolierte HUVEC
von gentechnisch veränderten und dadurch immortalisierten HUVEC unterscheiden. Diese
Immortalisierung wurde mit der Methode nach May et al. (2012), wie oben genannt, vorgenommen.
Der Schwerpunkt der Arbeit liegt hierbei in der Untersuchung verschiedener endothelzellenspezifischer
Charakteristika. Diese können mit nur vier verschiedenen Experimenten
festgestellt werden. Die Migration der Endothelzellen wird in zwei- und dreidimensionalen
Chemotaxis-Assays ermittelt. Die Fähigkeit zur Tube formation wird im Angiogenese-Assay
getestet. Das Verhalten unter Fluss und physiologische Merkmale werden im Flow-Assay untersucht.
Das Ziel dieser Arbeit ist mit den genannten Assays stabile kulturfähige HUVEC zu selektieren,
so dass die Verwendung primärer HUVEC auf lange Sicht überflüssig wird.
8

2 Material
2.1 Reagenzien
2 Material
Reagenz Hersteller Cat.Nr.
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Carl Roth 6335.1
Accutase PAA 11-007
AlexaFluor® 488 Phalloidin Molecular Probes A-12379
Collagen I, rat tail, 5 mg/ml, non-pepsinized ibidi 50201
ddH2O, Rotipuran® Carl Roth T172.3
Endothelial Cell Basal Medium 10x PromoCell customer formulation
Endothelial Cell Growth Medium (ECGM) PromoCell C-22010
Fötales Kälberserum (FCS) PAA A15-104
Formalin, 10 % (enthält 4 % Formaldehyd) Sigma-Aldrich HT50-1-1
Gelatin Solution, 2 % in H2O Sigma-Aldrich 111M60002
Immersion Oil Type DF Cargille /
Matrigel (growth factor reduced, phenolredfree)
BD 356231
Mounting Medium ibidi 50001
Natriumbicarbonat 7,5 % ccpro Z-30-M
PBS 1x ccpro PL-12-L
Penicillin/Streptomycin ccpro Z-13-M
Supplement Mix (Wachstumsfaktoren und Serum)
PromoCell C-39215
Triton® X-100 solution Sigma-Aldrich 93443
Trypan Blue 0,4 % Sigma-Aldrich T8154
Tabelle 1: Verwendete Reagenzien und Chemikalien.
9

2.2 Geräte
2 Material
Gerät Bezeichnung Hersteller
Brutschrank für Zellkultur von Säugetierzellen
(CO2-Anschluss, Temperatur- und
Feuchtigkeitssensor)
Digitales Inversmikroskop mit Phasenkontrast
HeraCell 240i Thermo-Scientific
EVOS® fl AMG
Inversmikroskop mit Phasenkontrast Axiovert 40 CFL Zeiss
Inversmikroskop mit Phasenkontrast, Fluoreszenzlampe,
motorisiertem Tisch
Pumpensystem mit Luftdruckpumpe und
ventilgeschaltetem Reagenzienreservoir
Temperaturregulierte Wärmekammer im
96-well Format
Tabelle 2: Verwendete Mikroskope und Laborgeräte.
2.3 Software
Eclipse Ti-E betrieben
mit µManager
Nikon
ibidi Pump System ibidi
ibidi Heating System 2
with heated lid
ibidi
Name Hersteller Version
Chemotaxis Migration Tool ibidi 2.0
ImageJ Wayne Rasband 1.45s
Manual Tracking PlugIn für ImageJ 2005/06/15
µManager Vale Lab 1.4
PumpControl ibidi v1.5.0
WimCounting Wimasis Online
WimTube Wimasis Online
Tabelle 3: Für die Aufnahmen und Auswertungen verwendete Software.
10

2.4 Materialien
2 Material
Bezeichnung Hersteller Cat.Nr.
15 ml-Tubes Sarstedt 62.554.502
50 ml-Tubes Sarstedt 62.547.254
Aspirations Pipette Sarstedt 86.1252.011
Filterspitzen: Starlab
10 µl S1121-3810
20 µl S1120-1810
100 µl S1120-1840
200 µl S1120-8810
1000 µl S1126-7810
Kühlrack IsoTherm-System eppendorf 3880 001.166
µ-Slide Angiogenesis ibiTreat ibidi 81506
µ-Slide Chemotaxis 2D Collagen IV ibidi 80322
µ-Slide Chemotaxis 3D ibiTreat ibidi 80326
µ-Slide I Luer 0.4 ibiTreat ibidi 80176
µ-Dish 35 mm, high ibiTreat ibidi 81156
Neubauer-improved Zählkammer Marienfeld 0640010
Kammertiefe 0,1 mm
Omnifix®-F (Spritze 1 ml) B. Braun Melsungen 916.1406V
Perfusion Set RED 15 cm ID 1,6 mm ibidi 10962
Petrischale 10 cm Sarstedt 83.1802.002
Safe-Lock Tubes 1,5 ml eppendorf 030120.086
Serial Connector for µ-Slides ibidi 10830
Serologische Pipetten: Sarstedt
2 ml 86.1252.001
5 ml 86.1253.001
10 ml 86.1254.001
25 ml 86.1685.001
Zellkulturflasche (75 cm 2 , 0,2 µm vented blue plug
seal cap)
Tabelle 4: Verwendetes Zellkultur- und Laborverbrauchsmaterial.
11
Falcon 353810

2.5 Antikörper
2 Material
Antikörper Hersteller Cat.Nr.
anti-Claudin-5 Rabbit pAb Invitrogen 34-1600
anti-Occludin (H-279) Rabbit pAb Santa Cruz Biotechnology sc-5562
anti-rabbit IgG (H+L), F(ab’)2 Fragment
(AlexaFluor® 555 conjugated)
Cell Signaling 4413
anti-VE-Cadherin (D87F2) XP® Rabbit mAb Cell Signaling 2500S
anti-von-Willebrand-Faktor Rabbit pAb Sigma-Aldrich F-3520
Tabelle 5: Für die Immunfluoreszenzfärbung verwendete primäre und sekundäre Antikörper.
2.6 Hergestellte Lösungen
Bezeichnung Zusammensetzung
0x ECGM Endothel Cell Growth Medium (ECGM)
1x ECGM ECGM
red. ECGM ECGM
ohne weitere Zusätze
+ 10 % FCS (v/v)
+ supplement mix (2 % FCS)
+ supplement mix (2 % FCS)
Gelatine 0,1 % 0,1 % Gelatine(v/v)
in PBS
Formaldehyd 2 % 2 % Formaldehyd (v/v)
in PBS
Triton X-100 0,1 % 0,1 % Triton® X-100
in PBS
Blocking Buffer 10 % FCS
0,2 % Triton® X-100
in PBS
Antibody Dilution Buffer 10 % FCS
0,05 % Triton® X-100
in PBS
Tabelle 6: Zusammensetzung und Bezeichnung der hergestellten Lösungen.
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3 Methoden
3.1 Allgemeine Zellkulturstandards
3 Methoden
Die Zellkultur erfordert absolut steriles Arbeiten. Dies soll die Zellen und die Umwelt vor
Kontaminationen schützen (Lindl, 2002). Alle Arbeiten mit den Zellen erfolgten unter einer
Zellkulturbank. Es wurden Latex-Handschuhe verwendet und diese und alle weiteren Materialien,
die unter die Zellkulturbank gelangten, gründlich mit 70 % Isopropanol desinfiziert.
Eine Ausnahme stellten die Zellkulturflaschen dar, da die Zellen sonst durch eintretenden
Alkohol Schaden nehmen könnten. Sterile Einwegmaterialien wurden unter der Zellkulturbank
aus ihrer Verpackung genommen. Sterile Reagenzien wurden ebenfalls nur unter der
Zellkulturbank geöffnet. Alle Abfälle wurden gesammelt und bei 121°C über 15 Minuten autoklaviert.
Flüssigabfälle wurden ebenfalls gesammelt und mit Desinfektionsmittelkonzentrat
versetzt.
3.2 Kultivierung und Passagieren der primären HUVEC
Die hier verwendeten primären Endothelzellen wurden aus humanen Nabelschnurvenen isoliert
(human umbilical vein endothelial cells = HUVEC). Es handelt sich hierbei um adhärente
Endothelzellen. HUVEC bilden in statischer Kultivierung eine kopfsteinpflasterförmige Morphologie
aus (Jaffe et al., 1973). In vivo richten sich diese Endothelzellen stromlinienförmig in
Richtung des fließenden Mediums aus und nehmen dabei eine eher spindelförmige Morphologie
an (Langille and Adamson, 1981; Nerem et al., 1981). Die Kultivierung der Zellen erfolgte
im Brutschrank unter Standardbedingungen für Säugertierzellen (37 °C, 5 % CO2 und 100 %
relative Luftfeuchtigkeit). Um Temperaturunterschiede bei der Handhabung außerhalb des
Brutschrankes zu vermeiden, wurden die Medien im Wasserbad auf 37 °C vorgewärmt.
Vor dem Erreichen der vollständigen Konfluenz fand das Passagieren statt. Das verbrauchte
Medium wurde dabei abgesogen und durch Waschen der Zellschicht mit 10 ml PBS weiter entfernt.
Nach Zugabe von 2 ml Accutase und einer dreiminütigen Inkubation im Brutschrank
lösten sich die Zellen von der Oberfläche. Ein Teil dieser Suspension wurde in eine neue
Zellkulturflasche (75 cm 2 ) gegeben und diese mit 13 ml einfach konzentriertem Endothel Cell
Growth Medium (1 x ECGM) (Zusammensetzung nach Tabelle 6) aufgefüllt. War für ein
Experiment eine Zellsuspension mit genau definierter Zellzahl notwendig, wurde die restliche
Zellsuspension fünf Minuten bei 200 g sedimentiert.
Die primären HUVEC wurden dreimal pro Woche passagiert. Dabei betrug der Splittfaktor
1:4 - 1:10, welcher anhand einer vorhergehenden mikroskopischen Untersuchung der bewachsenen
Fläche ermittelt wurde.
3.3 Kultivierung und Passagieren der immortalisierten HUVEC
Die immortalisierten HUVEC wurden durch Einschleusen von Proliferationsgenen gentechnisch
verändert und sollen in der Morphologie und dem Verhalten den primären HUVEC
ähneln. Somit wurde die Kultivierung und das Passagieren der immortalisierten Zellen wie
bei den primären Zellen beschrieben durchgeführt (siehe Kapitel 3.2). Der einzige Unterschied
bestand in einer Beschichtung der Zellkulturflasche mit Gelatine. Dafür wurden 5 ml einer
0,1 %igen Gelatinelösung (siehe Tabelle 6) auf dem Boden der neuen Zellkulturflasche verteilt,
diese für 30 Minuten im Brutschrank inkubiert und wieder abgesogen. So beschichtet,
konnten die Zellen darin ausgesät werden.
Die immortalisierten HUVEC wurden dreimal pro Woche passagiert. Dabei betrug der Splitt-
13

3 Methoden
faktor 1:5 - 1:12, welcher anhand einer vorhergehenden mikroskopischen Untersuchung der
bewachsenen Fläche ermittelt wurde.
3.4 Zellen auftauen
Das Auftauen der immortalisierten HUVEC musste zur Vermeidung von Zellschäden zügig
durchgeführt werden. Dazu wurden noch vor der Entnahme aus dem Stickstofftank 13 ml 1 x
ECGM in die gelatinisierte Zellkulturflasche gegeben. Das Medium wurde für jeden Zellklon
frisch angesetzt.
Das Kryoröhrchen wurde für drei Minuten ins Wasserbad (37 °C) gestellt und die aufgetaute
Zellsuspension vorsichtig mit einer 2 ml-Pipette in die Zellkulturflasche überführt. Am
darauffolgenden Tag wurde das Medium ausgetauscht. Dadurch wurden Reste von aus dem
Einfriermedium stammendem, zelltoxischem DMSO entfernt.
3.5 Chemotaxis-Assay
Um die gerichtete Zellmigration mikroskopisch untersuchen zu können wurde von der ibidi
GmbH das µ-Slide Chemotaxis entwickelt (siehe Abbildung 2). Hierbei handelt es sich um
einen Objektträger, welcher aus optisch hochwertigem und biokompatiblem Kunststoff besteht.
Pro Objektträger sind drei Kammersysteme vorhanden, in welchen voneinander unabhängige
chemotaktische Experimente stattfinden können. Der Beobachtungsbereich einer
Kammer grenzt an zwei Reservoire. Durch Füllen dieser Reservoire mit Medium unterschiedlichen
Lockstoffgehalts entsteht im Beobachtungsbereich ein linearer Konzentrationsgradient
dieses Stoffes. Somit kann eine mikroskopische Untersuchung der Zellen, bezogen auf den
Lockstoff, stattfinden (Zantl and Horn, 2011).
Abbildung 2: Darstellung des µ-Slides Chemotaxis 3D . Die drei unabhängigen Kammersysteme
sind mit den Ziffern 1 bis 3 nummeriert. Dabei besteht ein System aus einem mittig
angeordneten Kanal, welcher den Beobachtungsbereich darstellt, sowie den beiden
flügelartigen Medienreservoiren (Horn, 2012a).
Für die 2D- und 3D-Chemotaxis-Assays wurden nur Zellen mit einer Konfluenz von 60 -
95 % und einer Viabilität über 90 % verwendet. Die Zellen wurden in Medium (2D) oder in
Gel (3D) suspendiert und ausgesät. Als Chemoattractant diente bei den 2D- wie auch 3D-
Experimenten fötales Kälberserum. Die Versuche wurden mit Passage 4 und 5 der primären
HUVEC und den Passagen 22 bis 28 der immortalisierten HUVEC durchgeführt.
Beispielbilder des Beobachtungsbereiches mit Zellen in 2D und in 3D sind in Abbildung 3
gezeigt.
14

3 Methoden
Abbildung 3: Beobachtungsbereich der µ-Slides Chemotaxis 3D . Der Größenbalken entspricht
500 µm.
a) Adhärente Endothelzellen auf Collagen IV.
b) Endothelzellen eingebettet in einer Collagenmatrix.
3.5.1 2D-Chemotaxis-Assay - Zellaussaat
Für den 2D-Chemotaxis-Assays wurde das µ-Slide Chemotaxis 3D Collagen IV verwendet.
Das Chemotaxis-3D-Kit enthält ein µ-Slide, einen Kultivierungsdeckel und Stöpsel für die
Pipettierzugänge. Die Zellen wurden im Beobachtungsfenster ausgesät. Durch die Beschichtung
mit Collagen IV ist es den Zellen möglich sich am Boden zu verankern und darauf
fortzubewegen.
Es wurden vier Slides befüllt und dabei je ein Kammersystem pro Slide für die Kontrollen
reserviert. Durchgeführt wurden drei verschiedene Mediumkombinationen: Eine Negativkontrolle
(-/-) mit 0 x ECGM in beiden Reservoiren, eine Positivkontrolle (+/+) mit 1 x ECGM
in beiden Reservoiren und eine Gradientenmessung (+/-) mit 1 x ECGM in dem einen und 0 x
ECGM in dem anderen Reservoir (Zusammensetzung der Medien siehe Tabelle 6). Dadurch
ergaben sich je Ansatz 8 Experimente mit Gradient und je zwei Negativ- und Positivkontrollen.
Die ausgegasten µ-Slides wurden unter der Sterilbank mit Stöpseln versehen. Dabei wurden
pro Kammersystem immer die Reservoirzugänge C, D, E und F zugestöpselt und die
Kanalzugänge A und B offen gelassen (siehe Abbildung 4). Die Zellen wurden mikroskopisch
untersucht. Lagen entsprechend viele tote Zellen vor oder war 100 % Konfluenz erreicht konn-
15

3 Methoden
te der Versuch nicht durchgeführt werden. Die Zellsuspension wurde auf eine Konzentration
von 1 x 10 6 Zellen/ml eingestellt.
Mit einer 20 µl-Pipette wurden ein Tropfen von 6 µl Zellsuspension auf den Kanalzugang A
pipettiert. Mit derselben Pipette wurde am gegenüberliegenden Kanalzugang B ein vorsichtiger
Sog ausgeübt und die Zellen so im Kanal ausgesät. Dabei musste, um Luftblasen im Kanal
zu verhindern, unbedingt darauf geachtet werden, dass die Zugänge des Kanals bis oben hin
mit Medium gefüllt blieben. Der Prozess des Befüllens und ein Querschnitt der gefüllten
Kanalzugänge ist in Abbildung 4 dargestellt. Nach dem Befüllen aller Kanäle wurden die
Stöpsel entfernt und der Kultivierungsdeckel aufgelegt. Das Slide wurde in eine provisorische
Feuchtekammer, bestehend aus einer 10 cm -Petrischale und einem feuchten Zellstofftuch, gelegt.
Die Konzentration und Morphologie der Endothelzellen im Beobachtungsbereich wurde
mikroskopisch überprüft. Die Feuchtekammer mit den µ-Slides wurde 2 Stunden im Brutschrank
inkubiert. Während dieser Zeit setzten sich die Zellen an der Oberfläche des Kanals
fest.
Abbildung 4: Befüllen des µ-Slides Chemotaxis 3D (Horn, 2012a).
a) Die Zellsuspension wird auf den Kanalzugang A pipettiert.
b) Am Kanalzugang B wird ein Sog ausgeübt.
c) Korrekt gefüllter Kanalzugang nach dem Befüllen.
Zur Entfernung des serumhaltigen Mediums in den Kanälen der Negativkontrolle (-/-) und
der Gradientenmessung (+/-) wurden diese mit 0 x ECGM gespült. Vorhandene Blasen in
den Zugängen wurden zuvor mit einem 10 µl-Tip entfernt. Danach wurden die Zugänge C,
D, E und F geschlossen. Gespült wurde jeder Kanal jeweils dreimal mit 10 µl Medium, welches
auf den Zugang A pipettiert und vorsichtig hindurchgesogen wurde. Die Kanäle der
Positivkontrollen (+/+) wurden mit 1 x ECGM gewaschen. Dadurch wurde ausgeschlossen,
dass sich die Zellen der Positivkontrolle aufgrund des Waschschrittes anders verhalten als die
restlichen Experimente. Nach dem Waschen wurden die Stöpsel eines Reservoirs (C + D oder
E + F) auf die Kanalzugänge gesetzt und das offene Reservoir mit 65 µl Medium befüllt.
Die Stöpsel des leeren Reservoirs wurden auf das gefüllte gesetzt und das zweite Reservoir
mit 65 µl Medium befüllt. Abschließend wurden die Zellen im Beobachtungsfenster nochmals
kontrolliert (Horn, 2012a).
16

3.5.2 3D-Chemotaxis-Assay - Zellaussaat
3 Methoden
Für den 3D-Chemotaxis-Assay wurde das µ-Slide Chemotaxis 3D ibiTreat verwendet. Bei der
ibiTreat-Beschichtung handelt es sich um eine Methode, bei der die sonst hydrophobe Oberfläche
des Kunststoffes zu einer hydrophilen Oberfläche umgewandelt wurde. Somit konnten
Flüssigkeiten, wie das Gel, einfacher eingefüllt werden. Die Endothelzellen wurden hier in
einem Collagengel festgehalten und konnten sich somit im dreidimensionalen Raum bewegen.
Pro Versuchstag wurden vier Slides befüllt und dabei je ein Kammersystem pro Slide für die
Kontrollen reserviert. Dadurch ergaben sich je Ansatz 8 Experimente mit Gradient und je
zwei Negativ- und Positivkontrollen.
Alle Reagenzien aus Tabelle 7 wurden vor Versuchsbeginn auf Raumtemperatur gebracht.
Die Reservoirzugänge (C, D, E und F) der µ-Slides wurden mit den Stöpseln verschlossen
und ein Gel mit der in Tabelle 7 aufgelisteten Zusammensetzung hergestellt.
Reagenz Volumen [µl]
10 x ECGM 20
ddH2O 79
NaHCO3 7,5 % 11
1 x ECGM 50
Collagen I (5 mg/ml) 90
Zellsuspension (6 x 10 6 Zellen/ml
in 0 x ECGM)
Tabelle 7: Reagenzien zur Herstellung eines Collagengels mit einer Endkonzentration von
1,5 mg/ml (Horn, 2012b).
Die Reagenzien für die Gelherstellung wurden in der tabellarisch dargestellten Reihenfolge
pipettiert. Aus 10 x ECGM, ddH2O, NaHCO3 und 1 x ECGM wurde in einem 1,5 ml-Tube
ein Premix angesetzt und dieser für die Dauer der Zellpräparation in einem Kühlrack auf
0 °C gehalten. Die HUVEC wurden abgelöst und eine Zellsuspension von 6 x 10 6 Zellen/ml
hergestellt. Um ein Gel mit 2 % FCS herzustellen wurde für die Zellsuspension 0 x ECGM
verwendet. Somit kann der Gradientenaufbau optimal gewährleistet werden.
Bevor die Zellsuspension zugegeben wurde, gab man das Collagen I zu dem kaltgestellten
Premix. Ab diesem Schritt musste das Röhrchen unbedingt auf 0 °C gekühlt bleiben, um ein
vorschnelles Polymerisieren des Collagens zu vermeiden (Horn, 2012b). Die 6fach konzentrierte
Zellsuspension wurde luftblasenfrei mit der Matrix vermischt. In dem fertigen Gel waren
somit 1 x 10 6 HUVEC/ml vorhanden. 6 µl des Gels wurden mit einer 20 µl-Pipette auf den
Kanalzugang A pipettiert und dasselbe Volumen zügig, aber vorsichtig, an Zugang B durchgesogen.
Die Stöpsel der Reservoire wurden entfernt und die Kanalöffnungen A und B damit
geschlossen. Dabei wurde versucht das Gel nicht durch aprupte Verdrängungsmechanismen
zu schädigen. Die µ-Slides wurden in einer Petrischale mit einem feuchtem Zellstofftuch für 45
Minuten im Brutschrank inkubiert. Während dieser Zeit polymerisierte das Gel aus. Die entstandene
Struktur, die Zellkonzentration und mögliche Luftblasen im Beobachtungsbereich
konnten mikroskopisch betrachtet werden (Horn, 2012a).
Das Auffüllen der Reservoire wurde wie bei dem 2D-Chemotaxis-Assay in Absatz 3.5.1 be-
17
50
300

3 Methoden
schrieben durchgeführt. Auch hier gab es drei Mediumkombinationen: Eine Negativkontrolle
(-/-) mit 0 x ECGM in beiden Reservoiren, eine Positivkontrolle (+/+) mit 1 x ECGM in
beiden Reservoiren und eine Gradientenmessung (+/-) mit 1 x ECGM in dem einen und 0 x
ECGM in dem anderen Reservoir.
3.5.3 Aufnahme am Mikroskop
Um Videomikroskopie der sich bewegenden Zellen betreiben zu können, musste auf dem Mikroskop
eine brutschrankähnliche Umgebung geschaffen werden. Das dafür verwendete ibidi
Heating System (siehe Abbildung 5) bestand aus einer auf 37 °C erwärmten Kammer im
96well-Format, welche mit 5% CO2 durchströmt wurde (Strömungsgeschwindigkeit: 5 L/h).
Die Kammer wurde von einer beheizbaren Bodenplatte mit Platz für vier µ-Slides und einem
beheizbaren Deckel gebildet. Dieser bestand aus leitfähigem, transparentem ITO-Glas und
vermied Kondensationseffekte durch die Aufrechterhaltung einer gleichmäßigen Temperatur
innerhalb der Kammer (Kroutvar and von Guttenberg, 2012a). Die relative Feuchtigkeit des
Systems wurde auf 80 % eingestellt.
Luftblasen können die mikroskopischen Aufnahmen stören. Um das Auftreten dieses Störfaktors
zu reduzieren wurden die Lösungen in nicht dicht geschlossene 15 ml-Röhrchen pipettiert
und zusammen mit den steril verpackten Slides 24 Stunden vor Versuchsbeginn in den Brutschrank
gestellt. Bei dieser Temperaturanpassung gasen Medien und Slides aus ohne später
Einfluss auf das Experiment zu haben (Zantl and Horn, 2011).
Eine Stunde vor Versuchsbeginn wurde die Heizung zum Vorwärmen eingeschaltet. Die befüllten
µ-Slides Chemotaxis 3D wurden in die Kammer am Mikroskop gesetzt und der Deckel
aufgesetzt. Pro Aufnahme wurden entweder vier µ-Slides mit adhärenten HUVEC oder vier
µ-Slides mit in Collagen eingebetteten Zellen mikroskopisch betrachtet.
Der Beobachtungsbereich des µ-Slides wurde mit einem 4 x Phasenkontrastobjektiv komplett
erfasst. Es wurden von den Kanälen 145 Aufnahmen in einem Abstand von zehn Minuten
gemacht, was einer Gesamtaufnahmedauer von 24 Stunden entsprach. Die Bildersequenzen
wurden als TIFF-Dateien gespeichert und für die Auswertung in JPG-Dateien umgewandelt
(Horn, 2012a).
Abbildung 5: Heizsystem zur Betrachtung zellbiologischer, zeitaufgelöster Vorgänge am Mikroskop
(Kroutvar and von Guttenberg, 2012a).
18

3 Methoden
3.5.4 Programmunterstützte Verfolgung der Zellen und Berechnung der Kennzahlen
Für die Ermittlung der chemotaktischen Kennzahlen wurden die aufgenommenen Bildsequenzen,
bestehend aus 145 Einzelbildern, herangezogen. Ausgewertet wurden bei den 2D-
Chemotaxis-Assays nur die Bilder 37-108. Die ersten und letzten 6 Stunden wurden somit
von der Analyse ausgeschlossen. Anhand von Erfahrungswerten konnte davon ausgegangen
werden, dass eine 12h-Analyse die selben Ergebnisse erbringt, wie eine 24h-Analyse, bei gleichzeitig
weniger Zeitaufwand (Mashiah, 2012). Die Zellen der 3D-Chemotaxis-Assays wurden
über den gesamten Aufnahmezeitraum (24 Stunden) verfolgt. Die Bewegung der im Gel eingebetteten
HUVEC wurde ebenfalls zweidimensional aufgezeichnet. Dies ist in soweit als richtig
zu erachten, wie das Verhältnis der Kanallänge zur Kanalhöhe mindestens 10:1 beträgt (Horn,
2012a).
Ausgewertet wurden nur Experimente ohne Luftblasen. Pro Kanal wurden 40 Zellen über
einen vorher definierten Zeitraum verfolgt. Während dieser Zeit durfte sich die verfolgte Zelle
nicht teilen, absterben oder aus dem Beobachtungsbereich wandern. Die Zellen wurden nach
dem Zufallsprinzip ausgewählt. Zum Vermeiden der mehrfachen Analyse einer Zelle wurde
diese auf dem ersten Bild markiert.
Die Verfolgung der Zellen wurde mit dem Programm „ImageJ“ und des Plugins „Manual
Tracking“ vorgenommen. Die Zellen wurden auf jedem Bild mittig markiert, so dass ihnen
bei fortlaufender Bildsequenz ein Pfad aus Markierungspunkten folgte. Ein solches Beispiel
ist in Abbildung 6 gezeigt. Zu erkennen sind die einzelnen Zellspuren und an deren Ende
die jeweils markierte Zelle. Jede Zellmarkierung generierte zu dem dazugehörigen Zeitpunkt
einen Ortspunkt mit x/y - Koordinaten, welcher tabellarisch gespeichert wurde.
Abbildung 6: Adhärente HUVEC im Beobachtungsbereich des µ-Slides Chemotaxis 3D mit farblich
überlagerter Folgespur. Der Größenbalken entspricht 500 µm.
Um die Bewegung der Zellen übersichtlicher zu gestalten, wurden die Startpunkte aller Zellen
in den Ursprung eines Koordinatenkreuzes gelegt. Diese Plots geben einen ersten Aufschluss
darüber in welche Richtung sich die Zellen bewegen.
Wie Abbildung 7 a) zu sehen, wanderten die Zellen bevorzugt in Richtung der höheren
Chemoattractant-Konzentration (10 % FCS). Dies war hierbei in negativer y-Richtung der
Fall. Um die verschiedenen Kennzahlen miteinander vergleichen zu können, wurde der Betrag
aller Daten in y-Richtung herangezogen. Somit wurde der FMI in y-Richtung positiv
19

3 Methoden
betrachtet. Da die Lage des µ-Slides Einfluss auf die Richtung, in welche sich die Zellen
bewegen können, hatte, wurde eine einheitliche Richtungsbezeichung eingeführt. Der FMI,
welcher eine Zellbewegung parallel zum Konzentrationsgradienten darstellt, wurde als „paralleler
FMI“ ( FMI) bezeichnet; der FMI senkrecht dazu, als „senkrechter FMI“ (⊥ FMI).
Abbildung 7: Darstellung der Zellpfade ausgewählter 2D-Chemotaxis-Experimente. Schwarze Linien
geben Zellen an, deren Endpunkte in den unteren Sektoren liegen; rote Linien,
Zellen, deren Endpunkte in den oberen Sektoren liegen. Der Schwerpunkt der Zellen
(COM) ist durch einen grünen Punkt angezeigt.
a) Bewegungsdiagramm einer Gradientenmessung (+/-).
b) Bewegungsdiagramm der Kontrollen (Positivkontrolle (+/+); Negativkontrolle
(-/-)).
Die in Tabellenform gespeicherten Daten wurden von dem „Chemotaxis and Migration Tool“
in Kennzahlen der Zellwanderung umgewandelt. Aus dem objektivspezifischem Pixel/µm-
Verhältnis lassen sich die Bildpixel in Längeneinheiten umrechen und erlauben eine Auswertung
basierend auf µm. Der Forward Migration Index, der Rayleigh-Test und die Geschwin-
20

3 Methoden
digkeit der Zellen wurden hierbei genauer betrachtet.
• Forward and migration indices (FMI) in x- und y-Richtung (Horn and Asano, 2011)
Der FMI gibt die Fähigkeit der Zellen zur gerichteten Bewegung an. Der FMI in x-
Richtung repräsentiert den senkrechten FMI (⊥ FMI). Die Wanderung in Richtung des
Lockstoffes wurde mit dem y-FMI ( FMI) berechnet.
xF MI = 1
n
n
xi, end
di, i=1 accum
, yF MI = 1
n
n
yi, end
di, i=1 accum
n: Anzahl der, über den gesamten Aufnahmezeitraum, verfolgten Zellen
xi, end und yi, end: Koordinaten der Zellen im letzten Bild
di, accum: zurückgelegter Weg (accumulated distance) der Zellen
• Velocity
Die Zellgeschwindigkeit wurde gemessen in µm / h.
• Ergebnis des Rayleigh-Tests (P-Wert) (Fisher, 1993)
Der P-Wert ist das Ergebnis des Rayleigh Tests und gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit
welcher eine kreisförmige Anordnung der Zellen vom Zufall abhängen könnte. Bei Werten
größer 0,05 wurde von einer homogenen Verteilung ausgegangen und die gesetzte
Nullhypothese war abzulehnen. Von den P-Werten der Positiv- und Negativkontrollen
wurde angenommen, dass sie im Vergleich zu den Werten der (+/-) - Experimenten
größer seien, da hierbei der Zufall bei der Zellwanderung eine größere Rolle spiele.
3.5.5 Statistische Auswertung
Die ermittelten Kennzahlen wurden mit Hilfe eines Zweistichproben t-Test miteinander verglichen.
Die Nullhypothese lautete: Proben sind gleich. Es wurde unter untersucht, ob sich die
chemotaktischen Eigenschaften der primären HUVEC signifikant von den immortalisierten
HUVEC unterscheiden.
21

3.6 Angiogenese-Assay
3 Methoden
Für die Untersuchung der Sprossungs- und Spaltungsvorgänge beim Wachstum von Blutgefäßen
wurde von der ibidi GmbH das µ-Slide Angiogenesis entwickelt. Es besteht aus demselben
Kunststoff wie das µ-Slide Chemotaxis (vergleiche Kapitel 3.5) und hat 15 Vertiefungen
(wells), welche jeweils eine kleine und eine darüber liegende weitere Öffnung haben (siehe
Abbildung 8). Mit dieser well-in-well-Konstruktion wird erreicht, dass sich bei angezeigtem
Volumen eine ebene Oberfläche des Mediums bildet, welche einfacher zu mikroskopieren ist. In
die untere Vertiefung wurde eine Gelmatrix mit verschiedenen Wachstumsfaktoren gegeben.
Das hier verwendete Matrigel wurde aus dem Engelbreth-Holm-Swarm - Tumor in Mäusen
gewonnen. Dieser Tumor ist reich an extrazellulären Matrixproteinen wie Laminin, Collagen
IV, Heparan-sulfat-proteoglykanen und Entaktin (Kleinman et al., 1982). Dazu kommen
noch tumoreigene Wachstumsfaktoren wie bFGF, EGF, IGF-1, PDGF, NGF und TGF-beta
(Vukicevic et al., 1992). Auf diesem Gel vereinzelt ausgesäte Zellen bildeten nach einiger Zeit
netzförmige Strukturen und konnten somit auf ihre Fähigkeit Zellröhren zu bilden (Tube formation)
untersucht werden.
Für den Angiogenese-Assay wurden nur HUVEC mit einer Konfluenz von 60 - 95 % und die
Passagen 3 bis 5 der primären bzw. die Passagen 22 bis 28 der immortalisierten Endothelzellen
verwendet. Pro Versuchstag wurden zwei µ-Slides Angiogenesis ibiTreat verwendet,
wobei ein Slide mit HUVEC in Basalmedium (0x ECGM) und das andere mit HUVEC in
FCS-reduziertem Medium (red. ECGM) pipettiert wurde (siehe Tabelle 6).
Abbildung 8: µ-Slide Angiogenesis mit Maßen und Volumina der Vertiefungen (Wagner, 2012b).
3.6.1 Einfüllen des Gels
Auch in diesem Assay waren Luftblasen störend, da sie im Gel vorhanden das Volumen veränderten
und im Medium die Sicht auf die Zellen nahmen. Somit wurden die verwendeten
Medien, mit Ausnahme von Matrigel, im Brutschrank äquilibriert (siehe Abschnitt 3.5).
Um ein möglichst schonendes Auftauen des Gels zu garantieren, wurde dieses 24 Stunden
vor dem Experiment im Kühlschrank bei 4 °C gelagert. Außerdem wurde eine Box mit 20 µl-
22

3 Methoden
Spitzen bei -20 °C vorgekühlt.
Als Matrix wurde ein im Wachstumsfaktorengehalt reduziertes Matrigel ohne Phenolrot
verwendet. Davon wurden mit den vorgekühlten Pipettenspitzen 10 µl mittig in die Vertiefung
pipettiert. Wegen der hohen Viskosität des gekühlten Gels durfte die Spitze nur 1-2 mm
tief eintauchen und das Aufziehen musste langsam erfolgen. Das Slide wurde bis zum vollständigen
Erstarren des Gels verschlossen und in einer Petrischale mit feuchtem Zellstofftuch
liegend für 30 Minuten in den Brutschrank gegeben.
3.6.2 Zellaussaat
Die Zellen lagen nach dem Ablösen mit Accutase in Basalmedium (0 x ECGM) oder FCSreduziertem
Medium (red. ECGM) vor und wurden so konzentriert, dass nach Absinken aller
Zellen 1 x 10 4 Zellen/well vorlagen. Dies entsprach bei 50 µl Volumen einer Zellsuspension
von genau 2 x 10 5 Zellen/ml. Bei einer well-Größe von 0,1963 cm 2 liegen somit rechnerisch
˜51000 Zellen/cm 2 vor. Eine gleichmäßige Zellverteilung in allen 15 Wells wurde durch gründliches
Mischen der Suspension vor jedem Pipettieren sichergestellt. Das Volumen wurde mit
Hilfe eines Millimeterpapiers überprüft. Dazu wurde das Slide auf ein Rack gelegt und die
Millimeterstruktur in den Vertiefungen betrachtet (siehe Abbildung 9) und gegebenenfalls
mit Medium korrigiert.
Abbildung 9: µ-Slide Angiogenesis mit unterschiedlich gefüllten Vertiefungen. Durch zuviel oder
zuwenig Lösung entsteht ein Meniskus, welcher wie eine Linse das darunterliegende
Millimeterpapier vergrößert oder verkleinert. Durch Korrektur des Volumens verschwindet
der Meniskus (Wagner, 2012b).
3.6.3 Aufnahme am Mikroskop
Unverzüglich nach dem Absinken der ausgesäten Zellen und dann nach 6 Stunden wurden
von jeder Vertiefung beider Slides ein Bild (4x Objektiv) gemacht. Um möglichst vergleichbare
Bilderserien zu bekommen wurde jede Vertiefung am Mikroskop mittig ausgerichtet und
ungefähr 60 % der Oberfläche aufgenommen. Die Slides wurden bis zum nächsten Zeitpunkt
wieder in den Brutschrank gestellt.
23

3.6.4 Bildauswertung
3 Methoden
Bestimmung der Zellzahl
Die erste Bilderserie (direkt nach der Aussaat) wurde mit dem Cell-Counting-Tool von Wimasis
(WimCount) ausgewertet. Dabei wurden kreisförmige Strukturen bestimmter Größen
erkannt und deren Anzahl im Bildausschnitt ermittelt. Aufgrund der Kenntnis der Größe
dieses Ausschnittes konnte die Zellzahl im gesamten well berechnet werden.
Bestimmmung der Netzstruktur
Um die verschiedenen Zelltypen auf die Fähigkeit Zellröhren zu bilden untersuchen zu können,
wurden 6 Stunden nach dem Aussäen Bilder der Zellen gemacht. Es wurden nur Bilder
untersucht, in denen die Zellkonzentration zu Beginn des Versuches 1 x 10 4 ± 1000 Zellen/well
betrug. Somit wurden Effekte, die durch unterschiedliche Zelldichte auftreten können, ausgeschlossen.
Mit Hilfe des Tube formation - Tools (WimTube) der Firma Wimasis wurde die Netzstruktur
ausgewertet. Ein solchermaßen bearbeitetes Bild ist in Abbildung 10 b) zu sehen. Erkannt
wurden dabei die von Zellen bedeckte Fläche (blau), die Gesamtlänge der Tubes (rot), die
Verzweigungspunkte (weiß) und die durch das Netz gebildeten Schlaufen (gelbe Zahlen).
Erfahrungswerte mit primären HUVEC zeigten einen gleichzeitigen Anstieg dieser Strukturmerkmale
über die Zeit (Wagner, 2012c). Daher konnte davon ausgegangen werden, dass dies
ebenso bei den immortalisierten Zellen der Fall sein würde. Stellvertretend für alle Strukturmerkmale
wurde die Gesamtlänge der Tubes (Total Tube Length = TTL) untersucht.
Dabei wurde sowohl die Auswirkung von verschiedenen Medien auf die Zellen als auch die
Angiogenese-Fähigkeiten der primären und immortalisierten HUVEC miteinander verglichen.
24

3 Methoden
Abbildung 10: Netzstruktur von HUVEC auf Matrigel. Der Größenbalken entspricht 500 µm.
a) Phasenkontrastaufnahme 6 Stunden nach der Aussaat.
b) Mit WimTube ausgewertete Netzstruktur. Zu erkennen sind die mit Zellen bedeckte
Fläche (blau), die Tubes (rot), die Verzweigungspunkte (weiß) und die gebildeten
Schlaufen (gelbe Zahlen).
3.6.5 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung bezog sich auf den Vergleich der Zellen in verschiedenen Medien.
Es wurde ein Zweistichproben t-Test mit der Nullhypothese „Proben sind gleich“ gemacht.
Es wurde untersucht, ob sich die TTL im Basalmedium maßgeblich von der TTL in FCSreduziertem
Medium unterscheidet. Ein weiterer paarweiser t-Test stellte die Angiogenese-
Eigenschaften der primären denen der immortalisierten HUVEC gegenüber. Hierbei wurde
die Annahme überprüft, ob die TTL der primären HUVEC und die TTL der immortalisierten
HUVEC signifikant verschieden sind.
25

3.7 Flow-Assay
3 Methoden
HUVEC bilden unter Fluss Merkmale aus, welche charakteristisch für Endothelzellen sind.
Dies sind z. B. morphologisch die Ausrichtung der Zellen in Flussrichtung (Kumar et al.,
1987). Physiologisch kann die Bildung von Zell-Zell-Kontakten (tight junctions) und Veränderung
des von Willebrand-Faktors (Schneider and Schneider, 2008) festgestellt werden. Um
diese Veränderungen untersuchen zu können, wurden die HUVEC in ein Kanalslide ausgesät
und unter Mediumfluss gesetzt. Dafür wurde das in Abbildung 11 gezeigte µ-Slide I 0.4 Luer
ibiTreat in Verbindung mit dem ibidi Pump System verwendet. Das µ-Slide I 0.4 Luer besteht
aus einem 0,4 mm hohen Kanal, der über Schläuche mit einem „Perfusion Set“ verbunden
werden kann. Das ibidi Pump System besteht aus einer Luftdruckpumpe und ventilgeschalteten
Reagenzienreservoiren. Trotz wechselndem Flüssigkeitsstand der Medienreservoire des
„Perfusion Sets“ ändert sich die Flussrichtung im Kanal nicht (Wagner, 2012a). Durch gezielte
Wahl des Luftdruckes kann nun eine definierte Flussrate und damit ein definierter Scherstress
im Kanalinneren erzeugt werden, welcher somit auch auf die dort wachsenden Zellen wirkt.
Die vereinfachte Formel für das µ-Slide I 0.4 Luer zur Berechnung des Scherstresses aus der
Flussrate lautet (Zantl, 2012):
τ: Scherstress
Φ: Flussrate
τ[ dyn
ml
] = 1.316 Φ[
cm2 min ]
Um während der gesamten Laufzeit bakteriellen Kontaminationen vorzubeugen wurden alle
Medien mit Penicillin/Streptomycin versehen. Zur Vermeidung von Luftblasen wurden die
µ-Slides, Schläuche und Medien zum Ausgasen 24 h in den Brutschrank gegeben.
Abbildung 11: µ-Slide I 0.4 Luer. Die Homogenität des laminaren Scherstresses über den gesamten
Kanal ist anhand der Farben erkennbar. Nur am Kanalrand entstehen inhomogene
Bereiche (Zantl, 2012).
3.7.1 ibidi Pump System
Vor der Zellaussaat wurde das ibidi Pump System aufgebaut. Dazu wurde eine „Fluidic
Unit“ in den Brutschrank gestellt und die Anschlüsse für Luft und Elektrik nach außen verlegt.
Außerhalb des Brutschranks wurde die ibidi Pump mit der „Fluidic Unit“ und einem
PC verbunden (Aufbauschema siehe Abbildung 12). Mit Hilfe der Software „Pump Control“
konnten der Pumpendruck und die Schaltvorgänge gesteuert werden.
Zum Äquilibrieren und Entfernen der eingeschlossenen Luft wurde das „Perfusion Set“ befüllt
26

3 Methoden
in die „Fluidic Unit“ eingespannt und im Brutschrank laufen gelassen (Pumpenparameter siehe
Tabelle 8). Es wurden 12 ml entgasten Mediums (1 x ECGM) auf die Reagenzienreservoire
verteilt und dabei eingeschlossene Luftblasen entfernt.
Abbildung 12: Schematischer Aufbau des ibidi Pump Systems unter positivem Pumpendruck. Um
Korrosionen im Pumpengehäuse zu vermeiden, wird die angesaugte Inkubatorluft
durch eine Trockenflasche geleitet (Kroutvar and von Guttenberg, 2012b).
3.7.2 Zellaussaat
Für das Flussexperiment wurden nur Zellkulturflaschen mit einer Konfluenz von 60-90 % und
einer Viabilität von mindestens 90 % verwendet. Die Konzentration der Zellsuspension wurde
mit 1 x ECGM auf 20 x 10 5 Zellen/ml eingestellt. Es wurden 5 µ-Slides mit je 100 µl Zellsuspension
befüllt. Zum Vergleich der Zellen unter dynamischem Fluss mit statisch wachsenden
Zellen wurden auch HUVEC ohne Fluss kultiviert. Zeitgleich zu dem Flussexperiment wurden
die HUVEC in einem µ-Dish 35 mm, high ibiTreat ausgesät und beobachtet. Die befüllten
µ-Slides und das µ-Dish wurden für eine halbe Stunde im Brutschrank inkubiert. Danach wurden
die µ-Slide-Reservoire mit 120 µl Medium bzw. das µ-Dish mit 1 ml Medium aufgefüllt
und die Zellen für 2 Stunden im Brutschrank inkubiert. War nach mikroskopischer Betrachtung
der µ-Slides ein konfluenter Zellrasen zu sehen, konnten sie angeschlossen werden.
27

3.7.3 Anschluss der µ-Slides
3 Methoden
Die µ-Slides wurden erst durch „Serial Connectors“ untereinander verbunden und dann mit
dem schon befüllten „Perfusion Set“ (Wagner, 2012a). Dabei durften keine Luftblasen eingeschlossen
werden. Der genaue Vorgang ist in der Application Note 13 (Wagner, 2012a)
beschrieben. Die „Fluidic Unit“ wurde von der Pumpe getrennt und aus dem Brutschrank genommen.
Die Schläuche des „Perfusion Sets“ wurden mit einer Schlauchklemme abgeklemmt.
Somit konnte nach Entfernen des Verbindungsstücks kein Medium austreten. Die gut befüllten
Reservoire des Anfangs- und Endslides wurden mit den Luersteckern des „Perfusion Sets“
verbunden.
Der Volumenfluss geht bei unidirektionaler Schaltung und positivem Druck durch die Slides
in Richtung eines markierten Schlauchs (Wagner, 2012a). Zur besseren Nachverfolgung der
Zellausrichtung wurde die Flussrichtung auf den Slides vermerkt. Die Zellen wurden mikroskopisch
auf vollständige Konfluenz untersucht.
Die „Fluidic Unit“ mit mediumgefülltem „Perfusion Set“ und den verbundenen µ-Slides wurde
wieder in den Brutschrank gestellt und an die Pumpe angeschlossen (Luftdruckschlauch
und Kabel). Die Zellen im µ-Dish wurden jeden zweiten Tag mit frischem Medium versorgt,
so dass sich auch unter statischen Bedingungen ein konfluenter Zellrasen ausbilden konnte.
3.7.4 Software
Die HUVEC wurden 5 Tage unter einem Scherstress von 10 dyn/cm 2 kultiviert.
Zum Steuern des Scherstresses wurde die Software „Pump Control“ der ibidi GmbH verwendet.
Die Oberfläche der Software ist in Abbildung 13 gezeigt.
Durch einen anfangs hohen Scherstress im Kanal würden sich die Zellen lösen. Um die Zellen
somit erst an den Volumenstrom zu gewöhnen wurde eine Rampe mit zunehmendem
Scherstress gefahren (siehe Tabelle 8). Die Parameter wurden zeitabhängig eingegeben, so
dass der Scherstress nach Ablauf der ersten Phase automatisch gesteigert wurde. Durch
das Hintereinanderschalten mehrerer Slides kann es zu Differenzen zwischen dem eingestellten
und dem tatsächlichen Volumenstrom kommen und dadurch zu einem unterschiedlichen
Scherstress. Daher wurde der Volumenstrom während der ersten Phase überprüft und gegebenenfalls
korrigiert (Kroutvar and von Guttenberg, 2012b).
Druck Scherstress Zeit
(1) 50 mbar keiner (keine Slides) 30 min
(2) 5 mbar 5 dyn/cm 2 30 min
(3) 22 mbar 10 dyn/cm 2 unbegrenzt
Tabelle 8: Parameter der Software „PumpControl“ für die Steuerung des ibidi Pump Systems.
(1) Parameter zur Entfernung der Luftblasen.
(2) und (3) Parameter zur Flussgenerierung mit bewachsenen Slides. Hierbei nimmt der
Scherstress nach einer halben Stunde zu. Die Druckangaben bei (2) und (3) sind nur
ungefähre Werte, da das Hauptaugenmerk auf dem Scherstress liegt.
28

3 Methoden
Abbildung 13: Oberfläche der Pumpensteuersoftware „PumpControl“. Auf der linken Seite werden
der Pumpendruck und die Ventilschaltung manuell eingestellt. Auf der rechten
Seite hat man nach Wahl des verwendeten µ-Slides und des „Perfusion Sets“ die
Möglichkeit entweder den Scherstress oder den Volumenfluss gezielt einzugeben.
3.7.5 Immunfluoreszenzfärbung
Nach Ablauf der 5 Tage unter Fluss wurde der Fluss gestoppt, die µ-Slides vom „Perfusion
Set“ und voneinander getrennt und angefärbt. Auch das µ-Dish wurde für die Fluoreszenzfärbung
mitbehandelt. Die Kanäle der µ-Slides wurden dabei mit 120 µl Lösung versetzt, das
µ-Dish mit 500 µl. Zwischen den einzelnen Fixier- und Färbereagenzien wurde dreimal mit
PBS gewaschen.
Die Zellen wurden mit 2 % Formaldehyd überschichtet und 30 Minuten bei Raumtemperatur
fixiert. Perforiert wurde mit 0,1 % Triton® X-100 für 4 Minuten bei Raumtemperatur. Die folgenden
Färbeschritte wurden in einem lichtarmen Raum durchgeführt und die Slides während
den Einwirkzeiten im Dunklen aufbewahrt. Das Aktin des Cytoskeletts wurde mit AlexaFluor
488 Phalloidin (0,5 units/ml) angefärbt. Die Färbelösung wurde mit PBS verdünnt und die
Zellen damit 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Mit 0,1 µg/ml DAPI wurde innerhalb
von 4 Minuten der Zellkern bei Raumtemperatur angefärbt. Zum Blockieren unspezifischer
Bindungsstellen wurden die Zellen vor dem Auftragen der Antikörper eine Stunde bei
Raumtemperatur mit dem Blocking Buffer überschichtet und danach nicht gewaschen. Nun
wurden drei verschiedene Zellproteine spezifisch mit Antikörpern markiert und diese durch
einen zweiten Antikörper dargestellt. Pro Slide wurde eine Antikörperfärbung durchgeführt.
In dem µ-Dish wurde nur eine Antikörperfärbung durchgeführt. Bei den markierten Proteinen
handelte es sich um die Zellkontaktproteine Claudin-5 (0,625 µl/ml) und VE-Cadherin
(1:400) und den von Willebrand-Faktor (1:200). Verdünnt wurden alle Antikörper mit dem
Antibody Dilution Buffer (siehe Tabelle 6). Die Färbungen wurden im Kühlschrank (4 °C)
über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurde der sekundäre Antikörper anti-rabbit IgG
29

3 Methoden
(AlexaFluor® 555 gelabelt) (2 µl/ml) auf die gewaschenen Zellen gegeben und 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurde überschüssiger Antikörper weggewaschen
und die Zellen mit Mounting Medium überschichtet. Dies verhindert ein schnelles Ausbleichen
des Fluoreszenzfarbstoffes während der mikroskopischen Betrachtung.
3.7.6 Aufnahme am Mikroskop
Zur besseren Übersicht wurden nach Ablauf der 5 Tage unter Fluss Phasenkontrastbilder in
niedriger Vergrößerung (4 x Objektive) gemacht. Dabei wurden auch die Zellen in statischer
Kultur aufgenommen.
Einen genaueren Einblick davon, was in den Zellen nach einigen Tagen unter Fluss geschieht,
bekam man durch eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme in großer Vergrößerung (60 x
Ölimmersionsobjektiv). Hierbei wurden die angefärbten Strukturen wie Zellkern, Aktin, Zell-
Zell-Kontakte und von Willebrand-Faktor sichtbar. Durch Wahl des geeigneten Filters konnten
von diesen gezielt Aufnahmen gemacht werden. Somit wurden pro Slide und Dish drei
Aufnahmen gemacht: Aktin, Zellkern und vWF bzw. Zell-Zell-Kontakte.
3.7.7 Bildbearbeitung
Die Bilder wurden mit einem Größenbalken versehen und bei den Aufnahmen der dynamischen
Zellen ein Pfeil, der die Flussrichtung anzeigt, eingefügt. Außerdem wurden die Bilder
entsprechend ihrer Anregungswellenlänge eingefärbt. Somit wurde der Zellkern blau, das Aktin
grün und die antikörpermarkierten Strukturen rot dargestellt. Durch Überlagerung der
drei eingefärbten Aufnahmen, konnten gegebenenfalls Bilder erzeugt werden, auf denen das
Zusammenspiel der Strukturen erkennbar wurde .
Für eine genauere Analyse der Zellorientierung wurde versucht eine Software zu entwickeln.
Diese befindet sich aber noch in der Testphase und wird hier als weiter zu verfolgendes
Analyseinstrument vorgestellt. Die Software analysiert Phasenkontrastbilder in geringer Vergrößerung
und legt eine Ellipse über jede detektierte Zelle. Die Ausrichtung der längeren
Ellipsenachse bezogen auf die Flussrichtung (= 0°) wird berechnet und tabellarisch gespeichert.
Aus allen Analysen pro Bild wurde ein Histogramm erstellt, welches die Ausrichtung
aller Zellen von 0° bis ± 90° anzeigt.
30

4 Ergebnisse
4 Ergebnisse
In Abschnitt 3 wurde die Durchführung von 2D- und 3D-Chemotaxis-Assays, Angiogenese-
Assays und Flow-Assays beschrieben. Da aus ihnen eine Fülle von Daten hervorgeht, wurden
diese zur besseren Übersicht zusammengefasst. Bei allen Diagrammen wurde der arithmetische
Mittelwert dargestellt. Um außerdem einen Aufschluss über die Streuung der Messwerte
zu geben, wurde ein Fehlerbalken angezeigt. Dieser entspricht der Standardabweichung der
Stichprobe. Die Ergebnisse des Student-t-Tests wurden als Signifikanzniveaus direkt im Diagramm
angegeben. Welche Daten dabei miteinander verglichen wurden, wird aus den grünen
Klammern ersichtlich. Der hierbei verwendete Zweistichproben t-Test bezieht sich auf das
Signifikanzniveau α=0.05 und geht von unterschiedlichen Varianzen aus.
α > 0.05 (> 5 %) nicht signifikant
α = 0.01 bis 0.05 (1 bis 5 %) signifikant (*)
α = 0.001 bis 0.01 (0.1 bis 1 %) hoch signifikant (**)
α ≤ 0.001 (≤ 0.1 %) höchst signifikant (***)
Tabelle 9: P-Werte des Student-t-Tests und deren Aussage bezüglich Signifikanz (Bender and Lange,
2001).
4.1 Chemotaxis-Assay
In den folgenden Abbildungen (Abbildungen 14 bis 18) sind die Kennzahlen Forward Migration
Index (FMI), Ergebnisse des Rayleigh-Tests und die Zellgeschwindigkeiten für die 2Dund
3D-Chemotaxis-Assays zu sehen. Dabei entspricht ein Diagramm den jeweiligen Messwerten
pro Zelltyp. In den Diagrammen des FMI und der Geschwindigkeit sind die einzelnen
Versuche als graues Symbol und der Mittelwert dieser Versuche als roter Balken zu sehen. Die
roten Fehlerbalken des Mittelwertes repräsentieren die Standardabweichung der Messwerte.
Die Diagramme des Rayleigh-Tests zeigen die einzelnen Versuche als graue Symbole und eine
gestrichelte Linie als Markierung des Signifikanzniveaus (siehe Rayleigh-Test in Abschnitt
3.5.4).
4.1.1 Rohdaten: Forward Migration Index und Ergebnisse des Rayleigh-Tests
In Abbildung 14 zeigen die Diagramme a), c) und e) die parallelen und senkrechten FMIs der
zweidimensionalen Gradientenmessung (+/-) und deren Kontrollen (Positivkontrolle (+/+);
Negativkontrolle (-/-)). Bei allen drei Zelltypen beträgt der parallele FMI des Gradienten
ungefähr 0,2. Der senkrechte FMI des Gradienten liegt bei ungefähr 0. Dieser Unterschied
zwischen dem parallelen und dem senkrechten FMI der Gradientenmessung ist bei allen Zellen
höchst signifikant.
Die FMI (parallel und senkrecht) der Positiv- und Negativkontrollen liegen bei ungefähr 0.
Auch hier sind diese Unterschiede zwischen parallelem FMI des Gradienten und den Kontrollen
signifikant.
Die Diagramme b), d) und f) der Abbildung 14 zeigen die Ergebnisse des Rayleigh-Tests.
Das bei einem P-Wert von 0,05 gesetzte Signifikanzniveau sagt aus, ob eine Zellbewegung als
zufällig (≥ 0,05) oder gerichtet (< 0,05) gesehen werden kann. Die P-Werte der Gradientenmessung
liegen größtenteils unter 0,05. Bei Klon 1 bzw. Klon 2 der immortalisierten HUVEC
liegen ein bzw. zwei Versuche leicht darüber.
31

4 Ergebnisse
Die P-Werte der Kontrollen liegen im Mittel über 0,05.
In Abbildung 15 zeigen die Diagramme a), c) und e) die parallelen und senkrechten
FMIs der dreidimensionalen Gradientenmessung (+/-) und deren Kontrollen (Positivkontrolle
(+/+); Negativkontrolle (-/-)). Bei den primären HUVEC und dem Klon 2 der immortalisierten
HUVEC beträgt der parallele FMI im Gradienten ungefähr 0,17. Der parallele FMI
des Klon 2 der immortalisierten HUVEC liegt bei 0,07. Der senkrechte FMI im Gradienten
liegt bei ungefähr 0. Dieser Unterschied zwischen dem parallelen und dem senkrechten FMI
der Gradientenmessung ist bei den primären HUVEC und dem Klon 2 der immortalisierten
HUVEC höchst signifikant. Bei Klon 1 der immortalisierten HUVEC ist der geringere Unterschied
immer noch signifikant.
Die FMI (parallel und senkrecht) der Positiv- und Negativkontrollen liegen größtenteils bei
0 bis 0,05. Auch hier sind diese Unterschiede zwischen parallelem FMI des Gradienten und
den Kontrollen signifikant. Bei Klon 2 der immortalisierten HUVEC liegt der parallele FMI
der Positivkontrolle mit 0,07 höher als die FMIs der anderen Kontrollen. Er liegt trotzdem
noch deutlich unter dem selben Wert der Gradientenmessung (+/-). Dies spiegelt sich auch
in der Signifikanz des Unterschiedes wider.
Die Diagramme b), d) und f) der 15 zeigen die Ergebnisse des Rayleigh-Tests. Die P-Werte
der Gradientenmessung liegen größtenteils unter 0,05. Bei den primären HUVEC bzw. Klon
1 der immortalisierten HUVEC liegen ein bzw. vier Versuche darüber.
Die P-Werte der Kontrollen liegen größtenteils deutlich über 0,05. Bei den primären HUVEC
liegen zwei Versuche darunter, bei Klon 1 bzw. Klon 2 der immortalisierten HUVEC zwei
bzw. drei Versuche.
32

4 Ergebnisse
Abbildung 14: Forward Migration Indices und Ergebnisse des Rayleigh-Tests der 2D-Chemotaxis-
Assays. Die Diagramme a) und b) zeigen die Ergebnisse der primären HUVEC, die
Diagramme c) und d) die des Klon 1 der immortalisierten HUVEC und die Diagramme
e) und f) die des Klon 2 der immortalisierten HUVEC. Jedes Diagramm
ist unterteilt in die Werte der Gradientenmessung (+/-), die der Positivkontrolle
(+/+) und die der Negativkontrolle (-/-). Bei den Diagrammen der FMI (a), c)
und e)) fand eine weitere Unterteilung in parallelen () und senkrechten (⊥) FMI
statt.
33

4 Ergebnisse
Abbildung 15: Forward Migration Indices und Ergebnisse des Rayleigh-Tests der 3D-Chemotaxis-
Assays. Die Diagramme a) und b) zeigen die Ergebnisse der primären HUVEC, die
Diagramme c) und d) die des Klon 1 der immortalisierten HUVEC und die Diagramme
e) und f) die des Klon 2 der immortalisierten HUVEC. Jedes Diagramm
ist unterteilt in die Werte der Chemotaxismessung (+/-), die der Positivkontrolle
(+/+) und die der Negativkontrolle (-/-). Bei den Diagrammen der FMI (a), c)
und e)) fand eine weitere Unterteilung in parallelen () und senkrechten (⊥) FMI
statt.
34

4.1.2 Vergleich: Forward Migration Index
4 Ergebnisse
In Abbildung 16 werden die FMI der verschiedenen Zelltypen miteinander verglichen. Es
werden nur die parallelen FMI der Gradientenmessung berücksichtigt. Beim 2D-Chemotaxis-
Assay (Abbildung 16 a) weisen die primären HUVEC mit 0,22 den größten parallelen FMI
auf. Danach kommt Klon 2 mit 0,19 und Klon 1 der immortalisierten HUVEC mit 0,18. Es
ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Zelltypen festzustellen.
Beim 3D-Chemotaxis-Assay (Abbildung 16 b) weist Klon 2 der immortalisierten HUVEC mit
0,19 den größten parallelen FMI auf. Danach kommen die primären HUVEC mit 0,16 und
Klon 1 der immortalisierten HUVEC mit 0,07. Zwischen dem parallelen FMI der primären
HUVEC und Klon 2 der immortalisierten HUVEC ist kein signifikanter Unterschied festzustellen.
Der parallele FMI von Klon 1 der immortalisierten HUVEC unterscheidet sich jedoch
signifikant von dem der primären HUVEC.
Insgesamt sind die parallelen FMI des 2D-Chemotaxis-Assays etwas größer als die des 3D-
Chemotaxis-Assays.
Abbildung 16: Parallele FMI der Chemotaxis-Assays. Diagramm a) zeigt den Vergleich in der 2D-
Chemotaxis zwischen den primären HUVEC und den immortalisierten HUVEC.
Diagramm b) zeigt den selben Vergleich in der 3D-Chemotaxis.
35

4.1.3 Rohdaten: Geschwindigkeiten
4 Ergebnisse
In Abbildung 17 sind die Geschwindigkeiten der adhärenten Zellen (2D-Chemotaxis-Assay)
dargestellt. Die Geschwindigkeit ist in Mikrometer pro Stunde angegeben. Die größte Geschwindigkeiten
der primären HUVEC erreichen die Ergebnisse der Gradientenmessung mit
durchschnittlich 47 µm/h. Die Kontrollen liegen hier mit 45 µm/h für die Positivkontrolle und
29 µm/h für die Negativkontrolle ein wenig zurück. Dieser Unterschied ist jedoch nicht signifikant.
Klon 1 der immortalisierten HUVEC erreicht ebenfalls bei der Gradientenmessung die größte
Geschwindigkeit mit 54 µm/h. Die Kontrollen liegen hier mit 44 µm/h für die Positivkontrolle
und 28 µm/h für die Negativkontrolle ein wenig zurück. Dieser Unterschied ist jedoch ebenfalls
nicht signifikant.
Bei Klon 2 der immortalisierten HUVEC haben die Zellen der Negativkontrolle mit 73 µm/h
die größte Geschwindigkeit. Die Gradientenmessung liegt mit 56 µm/h zurück; ebenso die
Positivkontrolle mit 50 µm/h. Die Unterschiede hierbei sind, bezogen auf den Gradienten,
signifikant.
Abbildung 17: Geschwindigkeiten der Zellen im 2D-Chemotaxis-Assay. Das Diagramm a) zeigt
die Ergebnisse der primären HUVEC, das Diagramm b) die des Klon 1 der immortalisierten
HUVEC und das Diagramm c) die des Klon 2 der immortalisierten
HUVEC. Jedes Diagramm ist unterteilt in die Werte der Gradientenmessung
(+/-), die der Positivkontrolle (+/+) und die der Negativkontrolle (-/-).
In Abbildung 18 sind die Geschwindigkeiten der Zellen dargestellt, die sich in der Collagenmatrix
dreidimensional fortbewegen. Die Geschwindigkeit aller drei Zelltypen liegt bei
der Gradientenmessung bei 14 µm/h. Die Geschwindigkeiten der Kontrollen sind größtenteils
kleiner als die der Messung. Sie liegen bei 8 bis 12 µm/h. Bei Klon 2 der immortalisierten
HUVEC beträgt die Geschwindigkeit der Positivkontrolle 15 µm/h und liegt somit über
36

4 Ergebnisse
der der Gradientenmessung. Signifikante Unterschiede gibt es nur bei den immortalisierten
HUVEC. Die Geschwindigkeiten der primären HUVEC sind nicht signifikant unterschiedlich.
Abbildung 18: Geschwindigkeiten der Zellen im 3D-Chemotaxis-Assay. Das Diagramm a) zeigt
die Ergebnisse der primären HUVEC, das Diagramm b) die des Klon 1 der immortalisierten
HUVEC und das Diagramm c) die des Klon 2 der immortalisierten
HUVEC. Jedes Diagramm ist unterteilt in die Werte der Gradientenmessung
(+/-), die der Positivkontrolle (+/+) und die der Negativkontrolle (-/-).
4.1.4 Vergleich: Geschwindigkeit
In Abbildung 19 werden die Geschwindigkeiten der verschiedenen Zelltypen miteinander verglichen.
Beim 2D-Chemotaxis-Assay (Abbildung 19 a) weist Klon 2 der immortalisierten
HUVEC mit 56 µm/h die größte Geschwindigkeit auf, die nächst kleinere Geschwindigkeit
weist Klon 1 mit 53 µm/h auf. Die primären HUVEC haben mit 49 µm/h die kleinste Geschwindigkeit.
Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Zelltypen festzustellen.
Beim 3D-Chemotaxis-Assay (Abbildung 19 b) liegen die Geschwindigkeiten aller drei Zelltypen
bei 14 µm/h. Es ist kein signifikanter Unterschied festzustellen.
Insgesamt sind die Geschwindigkeiten des zweidimensionalen Chemotaxis-Assays um einiges
größer als die des dreidimensionalen Assays.
37

4 Ergebnisse
Abbildung 19: Geschwindigkeiten der Zellen in den Chemotaxis-Assays. Diagramm a) zeigt den
Vergleich in der 2D-Chemotaxis zwischen den primären HUVEC und den immortalisierten
HUVEC. Diagramm b) zeigt den selben Vergleich in der 3D-Chemotaxis.
38

4.2 Angiogenese-Assay
4 Ergebnisse
In Abbildung 20 sind Aufnahmen der gebildeten Netzstruktur zu sehen. Man kann in allen 6
Bildern solch ein Netz erkennen. Dennoch gibt es Unterschiede in der Struktur bei verschiedenen
Zelltypen und Medienzusammensetzungen.
Die primären HUVEC in red. ECGM (Abbildung 20 a) bilden ein Netz mit dünnen Zellröhren
und schmalen Verzweigungspunkten. Die Schlaufengröße ist unterschiedlich. Es gibt
auch unfertige Schlaufen. Die primären HUVEC in 0x ECGM (Abbildung 20 b) bilden kein
zusammenhängendes Netz. Es gibt viele Röhrenfragmente und nur selten ganze Schlaufen.
Die immortalisierten HUVEC Klon 1 und Klon 2 (Abbildung 20 b), c), e) und f) bilden in
red. ECGM und auch in 0x ECGM ein zusammenhängendes Netz. Die Unterschiede bestehen
dabei in der Größe der Schlaufen. Diese sind in red. ECGM viel größer. In 0x ECGM kann
man mehr kleinere Schlaufen erkennen. Zudem sind die Verzweigungspunkte in red. ECGM
viel stärker ausgeprägt als dies bei den primären HUVEC der Fall ist. Dies fällt vor allem bei
Klon 1 der immortalisierten HUVEC auf (Abbildung 20 b) und e).
Abbildung 20: Beispielbilder der Netzstruktur verschiedener Zelltypen und Medien. Die Aufnahmen
wurden 6 Stunden nach dem Ausäen der Zellen auf die Gelmatrix gemacht.
Der Größenbalken entspricht 500 µm.
In der oberen Reihe liegen die Zellen in FCS-reduziertem Medium (red. ECGM)
vor. In der unteren Reihe liegen die Zellen in Basalmedium ohne jede Zusätze
(0x ECGM) vor.
In Abbildung 21 wird die Gesamtlänge der Zellröhren der verschiedenen Zelltypen miteinander
verglichen. Im FCS-reduzierten Medium bilden die primären HUVEC ungefähr
7000 µm Tubes/mm 2 . Die immortalisierten HUVEC bilden in demselben Medium mehr Zellröhren:
Klon 1 8500 µm Tubes/mm 2 und Klon 2 8000 µm Tubes/mm 2 . Die Unterschiede
zwischen den Zellen sind dabei signifikant.
In Basalmedium ohne weitere Zusätze bilden die primären HUVEC ungefähr
5500 µm Tubes/mm 2 . Die immortalisierten HUVEC bilden in demselben Medium mehr Zellröhren:
Klon 1 10500 µm Tubes/mm 2 und Klon 2 9000 µm Tubes/mm 2 . Die Unterschiede
zwischen den Zellen sind dabei signifikant.
Ein weiterer Unterschied ist, dass die primären HUVEC in Basalmedium weniger Tubes bil-
39

4 Ergebnisse
den als in FCS-reduziertem Medium. Bei beiden Klonen der immortalisierten HUVEC werden
im Basalmedium mehr Tubes gebildet als in FCS-reduziertem Medium. Die Unterschiede zwischen
den Medien sind bei den primären HUVEC und Klon 2 der immortalisierten HUVEC
signifikant. Bei Klon 1 der immortalisierten HUVEC ist kein signifikanter Unterschied zwischen
den Medien festzustellen. Diese Signifikanz-Vergleiche sind nicht in den Diagrammen
der Abbildung 21 eingetragen.
Abbildung 21: Vergleich der Tube formation von primären und immortalisierten HUVEC in FCSreduziertem
Medium und Basalmedium ohne Zusätze.
40

4.3 Flow-Assay
4 Ergebnisse
In Abbildung 22 sind Phasenkontrastbilder der primären und immortalisierten HUVEC in
niedriger Vergrößerung zu sehen.
Die primären HUVEC unter Fluss bilden nach 5 Tagen einen geordneten einschichtigen Zellrasen.
Die vergrößerte Darstellung zeigt, dass die Zellen in Richtung des Flusses ausgerichtet
sind und dicht an dicht sitzen.
Die statischen primären HUVEC zeigen einen ungeordneten Zellrasen. Es gibt Zellhaufen mit
übereinanderliegenden Zellen. Bei diesen ist keine Ausrichtung der Zellen in eine bestimmte
Richtung zu erkennen.
Bei Klon 1 und 2 der immortalisierten HUVEC ist weder unter Fluss, noch bei statischen
Bedingungen, ein geordneter Zellrasen zu erkennen. Die Zellen bilden eher Zellhaufen. Die
statische Kultur von Klon 2 der immortalisierten HUVEC sind nach 5 Tagen nicht 100 %
konfluent.
Abbildung 22: Phasenkontrastbilder der primären und immortalisierten HUVEC nach 5 Tagen
unter dynamischer und statischer Kultivierung. Der Größenbalken entspricht
50 µm. Die Flussrichtung ist durch einen Pfeil dargestellt.
a) bis c) Zellen unter Fluss.
d) bis f) Zellen in statischer Kultur.
Der rot umrandete Bereich ist zur besseren Sichtbarkeit der Zellmorphologie vergrößert
dargestellt.
41

4 Ergebnisse
Um einen besseren Überblick über die molekularen Unterschiede bei Kultivierung unter Fluss
und in statischer Kultur zu bekommen, sind in Abbildung 23 Fluoreszenzbilder der primären
HUVEC dargestellt.
Man kann die Aktinfilamente eindeutig erkennen. Diese sind unter Fluss annähernd in Flussrichtung
ausgerichtet und unter statischen Bedingungen ungeordnet.
Als weitere eindeutige Färbung kann die Claudin-5-Färbung betrachtet werden. Hierbei sieht
man nur unter Fluss die Ausbildung zellbegrenzender Proteine. Bei statischer Kultivierung
sind zellkernnahe Strukturen angefärbt.
Abbildung 23: Immunfluoreszenzbilder der primären HUVEC nach 5 Tagen unter Fluss
(10 dyn/cm 2 ). Der Größenbalken entspricht 50 µm. Die Flussrichtung ist durch
einen Pfeil dargestellt.
a) und b) Aktinfilamente
c) und d) Claudin-5
42

4 Ergebnisse
In der Abbildung 24 sind Fluoreszenzbilder der primären und immortalisierten HUVEC zu
sehen.
Fluoreszenzbilder der Aktinfilamente sind in Abbildung 24 a) bis c) zu sehen. Bei den primären
HUVEC sind die Aktinfilamente der Zelle stark ausgeprägt. Die einzelnen Fasern
sind annähernd parallel zur Flussrichtung. Bei Klon 1 der immortalisierten HUVEC sind die
Aktinfasern schwächer ausgebildet. Sie liegen nicht parallel zur Flussrichtung. Die Aktinfasern
von Klon 2 der immortalisierten HUVEC sind schwächer als bei den primären HUVEC,
aber eindeutiger zu erkennen als bei Klon 1. Die Ausrichtung ist ungefähr 30° zur Flussrichtung.
Fluoreszenzbilder des von Willebrand-Faktors (vWF) sind in Abbildung 24 d) bis f) zu sehen.
Bei den primären HUVEC ist der vWF in jeder Zelle zu sehen. Bei genauer Betrachtung (siehe
rot umrandeter Bereich) kann man die langgezogene Form des vWF erkennen. Bei Klon 1
und Klon 2 der immortalisierten HUVEC haben nur wenige Zellen den vWF. Die Fluoreszenz
scheint hier eher diffus und es ist keine Streckung des vWF zu erkennen.
Fluoreszenzbilder von Claudin-5 angefärbten Strukturen sind in Abbildung 24 g) bis i) zu
sehen. Bei den primären HUVEC ist eine schmale, die Zellen umschließende Linie an Zell-
Zell-Kontakten zu erkennen. Bei Klon 1 und Klon 2 der immortalisierten HUVEC ist solch
eine Linie nicht zu finden.
Fluoreszenzbilder von VE-Cadherin sind in Abbildung 24 j) bis l) zu sehen. Bei den primären
HUVEC ist eine breite, die Zellen umschließende Linie zu erkennen. Bei Klon 1 und Klon 2
der immortalisierten HUVEC ist diese Linie viel unregelmäßiger und weniger stark ausgebildet
als bei den primären HUVEC.
43

4 Ergebnisse
Abbildung 24: Immunfluoreszenzbilder der primären und immortalisierten HUVEC nach 5 Tagen
unter Fluss (10 dyn/cm 2 ). Der Größenbalken entspricht 50 µm. Die Flussrichtung
ist durch einen Pfeil dargestellt.
a) bis c) Aktinfilamente
d) bis f) von Willebrand-Faktor. Der rot umrandete Bereich ist zur besseren Sichtbarkeit
der Struktur des vWFs vergrößert dargestellt.
g) bis i) Claudin-5
j) bis l) VE-Cadherin
44

4 Ergebnisse
Bei der Betrachtung der Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop wurde eine weitere Beobachtung
gemacht. Diese ist in Abbildung 25 dargestellt. Die Bilder a) bis c) zeigen mittig
eine Zellteilung in der Anaphase (weißer Kreis). In b) sind die DNA-Strukturen durch DAPI
angefärbt. Man kann die kondensierten Chromatiden erkennen. In a) färbt Claudin-5 eine
Struktur an, welche Teil des Spindelapparates sein könnte. Untersucht man die Claudin-5-
Färbung der Zellen, die sich in der Interphase befinden (d), kann man erkennen, dass ein
winziger Punkt (weiße Pfeile) angefärbt ist.
In Abbildung 25 c) ist eine Überlagerung der einzelnen Färbungen zu sehen. Die Aktinfärbung
(grün) zeigt eine ungeordnete Zellausrichtung.
Abbildung 25: Floureszenzbilder von primären HUVEC in statischer Kultur. Der Größenbalken
entspricht 500 µm.
a) Claudin-5-Färbung eines Teils des Spindelapparates.
b) DAPI-Färbung der Zellkerne. Bei der sich teilenden Zelle sind die kondensierten
Chromatiden zu erkennen.
c) Überlagerung der Claudin-5-Färbung (rot), der DAPI-Färbung (blau) und
Aktin-Färbung (grün) einer Zelle in der Anaphase.
d) Überlagerung der Claudin-5-Färbung (rot) und der DAPI-Färbung (blau) von
Zellen in der Interphase.
45

4 Ergebnisse
Aus der Softwareanalyse stammende Histogramme der Zellen unter Fluss (dynamisch) und
statisch sind in Abbildung 26 dargestellt. Darin sind die Verteilungen der Zellorientierung zu
sehen.
Bei den Histogrammen der statisch kultivierten Zellen (Abbildung 26 a) bis c)) ist eine gleichmäßige
Verteilung sichtbar. Die Histogramme der dynamisch kultivierten Zellen (Abbildung
26 d) bis f)) zeigen teilweise eine größere Verteilungsdichte bei 0°. Ungefähr 80 % der Zellen
liegen in einem Bereich ± 35°. Bei Klon 2 der immortalisierten HUVEC ist die Streuung der
Werte um 0° etwas größer als bei den primären HUVEC. Hier ist der Bereich, in welchem
ungefähr 80 % der Zellen liegen, auf ± 60° angestiegen. Klon 1 weist eine noch größere Streuung
als Klon 2 auf. 80 % der Zellen liegen hier bei ± 70°.
Abbildung 26: Vergleich der Orientierung der primären und immortalisierten HUVEC nach 5 Tagen
Kultivierung. Die x-Achse gibt die Abweichung von der Flussrichtung (0°) in
Gradschritten an. Die y-Achse gibt die Anzahl der Zellen an.
a) bis c) Auswertung der statischen HUVEC.
d) bis f) Auswertung der HUVEC unter Fluss.
46

5 Diskussion
5.1 Chemotaxis-Assay
5 Diskussion
Anhand des parallelen FMI kann eine Abschätzung der chemotaktischen Eigenschaften erfolgen.
Bei einem hohen FMI kann von einer gerichteten Bewegung ausgegangen werden (Zengel
et al., 2011). Entspricht diese Bewegungsrichtung dem Konzentrationsgradienten eines Lockstoffes,
findet eine gerichtete Bewegung zu dem Lockstoff hin statt. Bei Verwendung eines
cytotoxischen Stoffes, kann auch eine gerichtete Bewegung weg von dem Stoff beobachtet
werden.
Die FMI der Kontrollen sind niedrig im Vergleich zu dem parallelen FMI der Gradientenmessung
(siehe Abbildungen 14 und 15 im Kapitel 4.1). Dies war nach Vergleich mit internen,
nicht veröffentlichten Ergebnissen (Hoehne, 2011) zu erwarten, da bei den Kontrollen
aufgrund des Fehlens eines Konzentrationsgradienten keine gerichtete Bewegung stattfinden
kann. Der FMI senkrecht zum Konzentrationsgradienten ist bei der Gradientenmessung erwartungsgemäß
ebenfalls um einiges niedriger als der parallele FMI.
Bei den Ergebnissen des 2D-Chemotaxis-Assays (vergleiche Abbildung 16) liegen die parallelen
FMI der HUVEC mit durchschnittlich 0,2 in einem Bereich, in dem von einer gerichteten
Bewegung ausgegangen werden kann (Zengel et al., 2011). Die Bewegung erfolgte
zu dem FCS-Konzentrationsgradienten hin. Somit registrieren adhärente primäre und auch
immortalisierte HUVEC die höhere Konzentration an dem komplexen Nährstoff FCS und
wandern gezielt darauf zu.
Bei den Ergebnissen des 3D-Chemotaxis-Assay (vergleiche Abbildung 16) liegen die parallelen
FMI der primären HUVEC und von Klon 2 der immortalisierten HUVEC mit 0,16 und
0,19 in einem Bereich, in dem auch hier von einer gerichteten Bewegung ausgegangen werden
kann (Zengel et al., 2011). Der parallele FMI von Klon 1 der immortalisierten HUVEC weist
mit nur 0.07 nicht mehr eindeutig auf eine gerichtete Bewegung der Zellen hin. Im Vergleich
mit den Kontrollen ist aber durchaus ein Unterschied zu ihnen zu erkennen. Somit kann auch
hier von einer chemotaktisch induzierten Migration gesprochen werden, wenn auch in einem
geringeren Ausmaß als dies bei den anderen Zelltypen der Fall ist.
Die Geschwindigkeiten, mit denen diese Bewegungen vonstatten gehen, liegen beim 2D-
Chemotaxis-Assay mit durchschnittlich 50 µm/h noch im Bereich langsam migrierender Zellen
(Zengel et al., 2011).
Einzig die Geschwindigkeit von Klon 2 der immortalsierten HUVEC weicht in der Negativkontrolle
stark von der der anderen Zellen ab. Ein Grund hierfür könnte sein, dass die Zellen
viel stärker als die restlichen registrieren, dass ihnen Nährstoffe fehlen und somit schnellstmöglich
zu einer nährstoffreicheren Region wandern wollen. Dies ist aber nur eine Vermutung
und muss vor dem weiteren Verfolgen durch eine größere Anzahl an 2D-Chemotaxis-Assays
reproduziert und untersucht werden.
Beim 3D-Chemotaxis-Assay die Geschwindigkeiten der Migration liegen um einiges niedriger
als beim 2D-Chemotaxis-Assay. Dies ist durch die Beschaffenheit der Matrix, in der sich
die Zellen ja befinden, leicht zu erklären. Aufgrund der Struktur von Collagen I müssen die
HUVEC sich ihren Weg durch das gebildete Netz suchen und bahnen. Dies konnte intern mit
Videomikroskopie-Aufnahmen gezeigt werden. Zu sehen waren dabei Zellen, die auf einmal
in der Beobachtungsebene erschienen sind, nachdem sie sich durch das Netz des Collagens
hindurch gezwängt hatten.
Auch hier fällt eine Kontrolle von Klon 2 der immortalisierten HUVEC mit einer höheren
Geschwindigkeit als die Gradientenmessung auf. Diesesmal handelt es sich um eine Positiv-
47

5 Diskussion
kontrolle. Die vorherige Annahme, dass Klon 2 der immortalisierten HUVEC stärker auf
Nährstoffknappheit reagieren als die anderen getesteten Zellen, ist somit hinfällig. Es muss
vermutet werden, dass durch die gentechnische Veränderung dieses Klones Rezeptoren oder
der Bewegungsapparat der Zellen beschädigt wurden. Somit kann es, wie gezeigt, bei Abwesenheit
eines Konzentrationsgradienten zu anderen Ergebnissen kommen wie erwartet.
Insgesamt zeigte sich jedoch, dass die immortalisierten HUVEC bei der chemotaktisch induzierten
Migration kein auffällig anderes Verhalten aufweisen wie die primären HUVEC. Das
unterschiedliche Verhalten von Klon 2 der immortalisierten HUVEC bei den Kontrollen ist
zu beobachten, aber vorerst kein ausschlaggebendes Kriterium für eine Nichteignung dieses
Klons als kulturfähige Endothelzelllinie.
5.2 Angiogenese-Assay
Anhand der Anzahl der gebildeten Zellröhren (hier TTL) kann auf die Fähigkeit zur Neubildung
von Blutgefäßen geschlossen werden (Folkman and Haudenschild, 1980a).
Wie in den Experimenten auf Matrigel gezeigt (vergleiche Abbildung 21 in Kapitel 4.2),
ist die TTL der primären und immortalisierten HUVEC in FCS-reduziertem Medium (red.
ECGM) annähernd gleich. In Basalmedium ohne Zusätze (0x ECGM) werden jedoch größere
Unterschiede registriert. Der auffälligste Unterschied ist hierbei, dass nur die primären
HUVEC bei einer Abwesenheit des Nährstoffes FCS auch weniger Tubes bilden. Beide Klone
der immortalisierten HUVEC bilden ohne FCS mehr Tubes. Dieser Effekt konnte schon
in internen, nicht veröffentlichten Daten beobachtet werden (von Ledebur-Wicheln, 2011).
Die Zelllinie EA.hy926, welche dabei in FCS-freiem Medium auch mehr Tubes bildete, ist
ein Hybrid primärer HUVEC mit Thioguanin-resistenten Klonen von A549 (Rieber et al.,
1993). Die Daten dieser beiden Zelllinien würden darauf hinweisen, dass fötales Kälberserum
den Tube formation-Prozess inhibieren kann. Bei primären HUVEC ist solch eine Inhibition
durch FCS nicht bekannt, da das komplexe Serum in vielen Fällen sogar zur Induktion von
Tube formation-Prozessen genutzt wird (Miura et al., 2004).
Der Unterschied des FCS-Gehalts von dem verwendeten Kulturmedium (12 %) zu dem Versuchsmedium
(0 bis 2 %) kann zu den Unterschieden der immortalisierten HUVEC geführt
haben. Oft werden gerade in den Versuchsmedien viel höhere Serumkonzentrationen (15 bis
30 %) verabreicht (Franke et al., 1979). Da die genaue Zusammensetzung jedes Serums von
Spender zu Spender schwankt, können beobachtete Effekte nicht genau zugeordnet werden.
Man geht daher dazu über serumfreie Medien zu verwenden und Nährstofffaktoren gezielt
und in bekannter Konzentration zuzusetzen (Brunner et al., 2010). Für weitere Versuche
würde es sich auch anbieten Humanserum zu testen. Dieses findet bei Angiogenese-Forschern
verstärkt Beachtung, da ja auch die zu testenden Zellen humanen Ursprungs sind (Folkman
and Haudenschild, 1980b).
In Vorversuchen wurde die für die Tube formation geeignete Zelldichte der primären HUVEC
herausgefunden. Diese wurde auf 51000 Zellen/cm 2 eingestellt (Wagner, 2012b). Die immortalisierten
HUVEC sollen dieselben Eigenschaften wie die primären HUVEC aufweisen. Daher
wurde dieselbe Zelldichte, wie bei den primären HUVEC, für alle Klone verwendet, obwohl
bekannt war, dass die Zelldichte Einfluss auf die Tube formation-Prozesse haben kann (Arnaoutova
et al., 2010). Wäre bei Vorversuchen eine veränderte Zelldichte ermittelt worden,
hätte man schon hier von einem veränderten Verhalten der immortalisierten HUVEC ausgehen
können.
48

5 Diskussion
Für eine Eignung der immortalisierten HUVEC als kulturfähige Endothelzelllinie sollte
gerade die Angiogenese-Fähigkeit genau der der primären HUVEC entsprechen. Ein genau
konträres Verhalten würde für starke Unterschiede der Zellen sprechen und wäre somit nicht
wünschenswert.
5.3 Flow-Assay
Endothelzellen richten sich unter Fluss in Richtung des Volumenstroms aus. Diese Orientierung
ist in vitro zu beobachten (Langille and Adamson, 1981) und konnte auch bei den
primären HUVEC festgestellt werden. Bei den immortalisierten HUVEC kann solch eine Orientierung
auf den ersten Blick nicht beobachtet werden. Diese Annahme stützt sich auf den
Vergleich der Phasenkontrastbilder in Abbildung 22.
Durch die Analyse der Phasenkontrastbilder mit der Testversion einer eigens dafür entwickelten
Software, konnte gezeigt werden, dass sich die immortalisierten HUVEC unter Fluss
doch mehr ausrichten wie auf den ersten Blick zu sehen war. Dennoch entsteht ausschließlich
bei den primären HUVEC ein klar strukturierter und einschichtiger Zellrasen, was gegen die
Verwendung der immortalisierten HUVEC für weitere Flow-Assays spricht.
Weitere Merkmale, welche bei Endothelzellen vorkommen bzw. sich unter Fluss verändern,
konnten bei den immortalisierten HUVEC nicht oder nur in sehr geringem Ausmaß festgestellt
werden. Der Nachweis an VE-Cadherin konnte bei den immortalisierten HUVEC erbracht
werden. VE-Cadherine sind in den „adherens junctions“ von Endothelzellkontakten zu
finden (Wheelock and Johnson, 2003). In früheren internen Experimenten war VE-Cadherin
auch bei statisch kultivierten Endothelzellen nachzuweisen. Bei Endothelzellen unter Fluss
sind die Begrenzungen jedoch deutlicher ausgeprägt (Wagner, 2012a)
Der von Willebrand-Faktor ist nur in Endothelzellen und Megakaryozyten vorhanden (von
Willebrand, 1999). Bei den immortalisierten HUVEC konnte er nur in einigen wenigen Zellen
nachgewiesen werden. Dies spricht alleine für sich für eine starke genetische Veränderung
der Zellen. Auch konnte in den wenigen Zellen keine Streckung des von Willebrand-Faktors
(vWF) beobachtet werden. Dies ist für ein erfolgreiches Zusammenspiel des vWFs mit den
Thrombozyten jedoch unerlässlich (Fuchs et al., 2010). Eine Färbung des vWFs unter statischen
Bedingungen wurde nicht gemacht. Laut Schneider and Schneider (2008) kann aber
davon ausgegangen werden, dass dabei keine auffällige Streckung zu sehen ist.
Einzig bei den dynamisch kultivierten primären HUVEC konnten durch die Claudin-5-Färbung
die „tight junctions“ nachgewiesen werden. Diese werden laut Walsh et al. (2011) erst nach
einigen Stunden unter dem Einfluss von Scherstress gebildet. Diese Bildung konnte in den
Versuchen zumindest bei den primären HUVEC eindrucksvoll gezeigt werden.
Die Anfärbung eines Teils des Spindelapparates durch anti-Claudin-5 deutet auf eine zu geringe
Spezifität des verwendeten Antikörpers hin. Da sich die Zielproteine hier jedoch nicht
überlappen, liegt nur eine vernachlässigbare Störung vor.
Am deutlichsten konnte der Einfluss von Scherstress auf die Zellen bei der Aktinfärbung gesehen
werden. Durch den Scherstress, welcher unter Fluss auf die Zellen wirkt, bilden sich
sogenannte „stress fibers“ aus (Wojciak-Stothard and Ridley, 2003). Diese sind vor allem
bei den primären HUVEC gut zu sehen. Dort sind sie auch schön parallel zum Fluss angeordnet.
Bei Klon 2 der immortalisierten HUVEC sind die „stress fibers“ nicht ganz parallel
zum Fluss. Bei Klon 1 der immortalisierten HUVEC fehlen sie sogar fast komplett und auch
das restliche Aktingerüst der Zelle sieht sehr ungeordnet aus. Dies spricht stark dafür, dass
zumindest Klon 1 durch den Scherstress nicht beeinflusst wird. Es könnte noch untersucht
49

6 Zusammenfassung
werden, ob dies bei höheren oder auch niedrigeren Scherraten der Fall sein würde.
Vor allem das Fehlen von für Endothelzellen charakteristischen Ausprägungen deutet auf
eine starke Veränderung der HUVEC durch die Immortalisierung hin. Diese sind somit für
Untersuchungen in Flow-Assays nicht geeignet.
6 Zusammenfassung
Der Vorgang der Immortalisierung hat bei den getesteten HUVEC zu starken Veränderungen
hauptsächlich bei physiologischen Merkmalen wie Aktingerüst, Bildung von tight junctions
und Vorhandensein und Streckung des von Willebrand-Faktors geführt. Auch die unvollständige
Orientierung und Ausbildung einer geordneten Endothelschicht unter Fluss zeigen starke
Unterschiede zu primären HUVEC auf. Das veränderte Verhalten im Angiogenese-Assay wäre
vor einer weiteren Analyse zu überprüfen.
Obwohl die immortalisierten Zellen im Chemotaxis-Assay dieselben Eigenschaften aufweisen
wie primäre Endothelzellen, sind sie in der Mehrzahl der getesten Eigenschaften zu unterschiedlich.
Daher sind sie in dieser Form als kulturfähige Endothelzelllinie und somit als
Ersatz für die primären HUVEC nicht anwendbar.
50

Danksagung
Einen herzlichen Dank an:
Danksagung
Dr. Stefanie Sudhop für die Betreuung meiner Arbeit und das Interesse an den durchgeführten
Versuchen.
Dr. Roman Zantl und Dr. Julia Riedl für die Bereitstellung des interessanten Themas, der
Betreuung und Unterstützung meiner Arbeit, sowie den vielen hilfreichen Gesprächen.
Dipl. Biol. Helga Wagner für die hilfreichen Anregungen und Tipps für eine erfolgreiche
Durchführung der Experimente, sowie die Hilfestellung bei der Interpretation der Ergebnisse.
Dipl. Ing. Elias Horn für die Unterstütung bei der Planung der Experimente.
Jana Peliskova des Arbeitskreises Prof. Dr. Vollmar (LMU München) für die Bereitstellung
der Zellen.
Juan Escribano der Firma Wimasis für die Programmierung der Software zur Analyse von
Zellbildern.
Das gesamte ibidi-Team für eine angenehme Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders danken
möchte ich Brigitte Berger, Armin Bieser, Roseane Hashiguchi, Simon Herzog, Kristin Kahl,
Johannes Jürschick, Trung Pham und Andreas Rainer.
Meine Familie für die Erweckung und Förderung all der Interessen, die halfen das Studium
erfolgreich zu absolvieren.
Meinen Freund Ralf Doubek für die moralische Unterstützung während meines gesamten Studiums
und besonders während den Prüfungszeiten.
51

Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
1 Phasenkontrastbild primärer HUVEC. Der Größenbalken entspricht 500 µm. . 7
2 Darstellung des µ-Slides Chemotaxis 3D . Die drei unabhängigen Kammersysteme
sind mit den Ziffern 1 bis 3 nummeriert. Dabei besteht ein System aus
einem mittig angeordneten Kanal, welcher den Beobachtungsbereich darstellt,
sowie den beiden flügelartigen Medienreservoiren (Horn, 2012a). . . . . . . . . 14
3 Beobachtungsbereich der µ-Slides Chemotaxis 3D . Der Größenbalken entspricht
500 µm. a) Adhärente Endothelzellen auf Collagen IV. b) Endothelzellen eingebettet
in einer Collagenmatrix. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4 Befüllen des µ-Slides Chemotaxis 3D (Horn, 2012a). a) Die Zellsuspension wird
auf den Kanalzugang A pipettiert. b) Am Kanalzugang B wird ein Sog ausgeübt.
c) Korrekt gefüllter Kanalzugang nach dem Befüllen. . . . . . . . . . . . 16
5 Heizsystem zur Betrachtung zellbiologischer, zeitaufgelöster Vorgänge am Mikroskop
(Kroutvar and von Guttenberg, 2012a). . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
6 Adhärente HUVEC im Beobachtungsbereich des µ-Slides Chemotaxis 3D mit
farblich überlagerter Folgespur. Der Größenbalken entspricht 500 µm. . . . . . 19
7 Darstellung der Zellpfade ausgewählter 2D-Chemotaxis-Experimente. Schwarze
Linien geben Zellen an, deren Endpunkte in den unteren Sektoren liegen; rote
Linien, Zellen, deren Endpunkte in den oberen Sektoren liegen. Der Schwerpunkt
der Zellen (COM) ist durch einen grünen Punkt angezeigt. a) Bewegungsdiagramm
einer Gradientenmessung (+/-). b) Bewegungsdiagramm der
Kontrollen (Positivkontrolle (+/+); Negativkontrolle (-/-)). . . . . . . . . . . 20
8 µ-Slide Angiogenesis mit Maßen und Volumina der Vertiefungen (Wagner,
2012b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
9 µ-Slide Angiogenesis mit unterschiedlich gefüllten Vertiefungen. Durch zuviel
oder zuwenig Lösung entsteht ein Meniskus, welcher wie eine Linse das darunterliegende
Millimeterpapier vergrößert oder verkleinert. Durch Korrektur des
Volumens verschwindet der Meniskus (Wagner, 2012b). . . . . . . . . . . . . . 23
10 Netzstruktur von HUVEC auf Matrigel. Der Größenbalken entspricht 500 µm.
a) Phasenkontrastaufnahme 6 Stunden nach der Aussaat. b) Mit WimTube
ausgewertete Netzstruktur. Zu erkennen sind die mit Zellen bedeckte Fläche
(blau), die Tubes (rot), die Verzweigungspunkte (weiß) und die gebildeten
Schlaufen (gelbe Zahlen). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
11 µ-Slide I 0.4 Luer. Die Homogenität des laminaren Scherstresses über den gesamten
Kanal ist anhand der Farben erkennbar. Nur am Kanalrand entstehen
inhomogene Bereiche (Zantl, 2012). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
12 Schematischer Aufbau des ibidi Pump Systems unter positivem Pumpendruck.
Um Korrosionen im Pumpengehäuse zu vermeiden, wird die angesaugte Inkubatorluft
durch eine Trockenflasche geleitet (Kroutvar and von Guttenberg,
2012b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
13 Oberfläche der Pumpensteuersoftware „PumpControl“. Auf der linken Seite
werden der Pumpendruck und die Ventilschaltung manuell eingestellt. Auf der
rechten Seite hat man nach Wahl des verwendeten µ-Slides und des „Perfusion
Sets“ die Möglichkeit entweder den Scherstress oder den Volumenfluss gezielt
einzugeben. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
52

Abbildungsverzeichnis
14 Forward Migration Indices und Ergebnisse des Rayleigh-Tests der 2D-Chemotaxis-
Assays. Die Diagramme a) und b) zeigen die Ergebnisse der primären HUVEC,
die Diagramme c) und d) die des Klon 1 der immortalisierten HUVEC und
die Diagramme e) und f) die des Klon 2 der immortalisierten HUVEC. Jedes
Diagramm ist unterteilt in die Werte der Gradientenmessung (+/-), die der
Positivkontrolle (+/+) und die der Negativkontrolle (-/-). Bei den Diagrammen
der FMI (a), c) und e)) fand eine weitere Unterteilung in parallelen ()
und senkrechten (⊥) FMI statt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
15 Forward Migration Indices und Ergebnisse des Rayleigh-Tests der 3D-Chemotaxis-
Assays. Die Diagramme a) und b) zeigen die Ergebnisse der primären HUVEC,
die Diagramme c) und d) die des Klon 1 der immortalisierten HUVEC und
die Diagramme e) und f) die des Klon 2 der immortalisierten HUVEC. Jedes
Diagramm ist unterteilt in die Werte der Chemotaxismessung (+/-), die der
Positivkontrolle (+/+) und die der Negativkontrolle (-/-). Bei den Diagrammen
der FMI (a), c) und e)) fand eine weitere Unterteilung in parallelen ()
und senkrechten (⊥) FMI statt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
16 Parallele FMI der Chemotaxis-Assays. Diagramm a) zeigt den Vergleich in
der 2D-Chemotaxis zwischen den primären HUVEC und den immortalisierten
HUVEC. Diagramm b) zeigt den selben Vergleich in der 3D-Chemotaxis. . . 35
17 Geschwindigkeiten der Zellen im 2D-Chemotaxis-Assay. Das Diagramm a)
zeigt die Ergebnisse der primären HUVEC, das Diagramm b) die des Klon 1
der immortalisierten HUVEC und das Diagramm c) die des Klon 2 der immortalisierten
HUVEC. Jedes Diagramm ist unterteilt in die Werte der Gradientenmessung
(+/-), die der Positivkontrolle (+/+) und die der Negativkontrolle
(-/-). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
18 Geschwindigkeiten der Zellen im 3D-Chemotaxis-Assay. Das Diagramm a)
zeigt die Ergebnisse der primären HUVEC, das Diagramm b) die des Klon 1
der immortalisierten HUVEC und das Diagramm c) die des Klon 2 der immortalisierten
HUVEC. Jedes Diagramm ist unterteilt in die Werte der Gradientenmessung
(+/-), die der Positivkontrolle (+/+) und die der Negativkontrolle
(-/-). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
19 Geschwindigkeiten der Zellen in den Chemotaxis-Assays. Diagramm a) zeigt
den Vergleich in der 2D-Chemotaxis zwischen den primären HUVEC und den
immortalisierten HUVEC. Diagramm b) zeigt den selben Vergleich in der 3D-
Chemotaxis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
20 Beispielbilder der Netzstruktur verschiedener Zelltypen und Medien. Die Aufnahmen
wurden 6 Stunden nach dem Ausäen der Zellen auf die Gelmatrix
gemacht. Der Größenbalken entspricht 500 µm. In der oberen Reihe liegen die
Zellen in FCS-reduziertem Medium (red. ECGM) vor. In der unteren Reihe
liegen die Zellen in Basalmedium ohne jede Zusätze (0x ECGM) vor. . . . . . 39
21 Vergleich der Tube formation von primären und immortalisierten HUVEC in
FCS-reduziertem Medium und Basalmedium ohne Zusätze. . . . . . . . . . . 40
22 Phasenkontrastbilder der primären und immortalisierten HUVEC nach 5 Tagen
unter dynamischer und statischer Kultivierung. Der Größenbalken entspricht
50 µm. Die Flussrichtung ist durch einen Pfeil dargestellt. a) bis c)
Zellen unter Fluss. d) bis f) Zellen in statischer Kultur. Der rot umrandete
Bereich ist zur besseren Sichtbarkeit der Zellmorphologie vergrößert dargestellt. 41
23 Immunfluoreszenzbilder der primären HUVEC nach 5 Tagen unter Fluss (10 dyn/cm 2 ).
Der Größenbalken entspricht 50 µm. Die Flussrichtung ist durch einen Pfeil
dargestellt. a) und b) Aktinfilamente c) und d) Claudin-5 . . . . . . . . . . . 42
53

Abbildungsverzeichnis
24 Immunfluoreszenzbilder der primären und immortalisierten HUVEC nach 5
Tagen unter Fluss (10 dyn/cm 2 ). Der Größenbalken entspricht 50 µm. Die Flussrichtung
ist durch einen Pfeil dargestellt. a) bis c) Aktinfilamente d) bis f) von
Willebrand-Faktor. Der rot umrandete Bereich ist zur besseren Sichtbarkeit
der Struktur des vWFs vergrößert dargestellt. g) bis i) Claudin-5 j) bis l) VE-
Cadherin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
25 Floureszenzbilder von primären HUVEC in statischer Kultur. Der Größenbalken
entspricht 500 µm. a) Claudin-5-Färbung eines Teils des Spindelapparates.
b) DAPI-Färbung der Zellkerne. Bei der sich teilenden Zelle sind
die kondensierten Chromatiden zu erkennen. c) Überlagerung der Claudin-
5-Färbung (rot), der DAPI-Färbung (blau) und Aktin-Färbung (grün) einer
Zelle in der Anaphase. d) Überlagerung der Claudin-5-Färbung (rot) und der
DAPI-Färbung (blau) von Zellen in der Interphase. . . . . . . . . . . . . . . 45
26 Vergleich der Orientierung der primären und immortalisierten HUVEC nach
5 Tagen Kultivierung. Die x-Achse gibt die Abweichung von der Flussrichtung
(0°) in Gradschritten an. Die y-Achse gibt die Anzahl der Zellen an. a) bis c)
Auswertung der statischen HUVEC. d) bis f) Auswertung der HUVEC unter
Fluss. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
54

Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
1 Verwendete Reagenzien und Chemikalien. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2 Verwendete Mikroskope und Laborgeräte. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3 Für die Aufnahmen und Auswertungen verwendete Software. . . . . . . . . . 10
4 Verwendetes Zellkultur- und Laborverbrauchsmaterial. . . . . . . . . . . . . . 11
5 Für die Immunfluoreszenzfärbung verwendete primäre und sekundäre Antikörper.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
6 Zusammensetzung und Bezeichnung der hergestellten Lösungen. . . . . . . . . 12
7 Reagenzien zur Herstellung eines Collagengels mit einer Endkonzentration von
1,5 mg/ml (Horn, 2012b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
8 Parameter der Software „PumpControl“ für die Steuerung des ibidi Pump
Systems. (1) Parameter zur Entfernung der Luftblasen. (2) und (3) Parameter
zur Flussgenerierung mit bewachsenen Slides. Hierbei nimmt der Scherstress
nach einer halben Stunde zu. Die Druckangaben bei (2) und (3) sind nur
ungefähre Werte, da das Hauptaugenmerk auf dem Scherstress liegt. . . . . . 28
9 P-Werte des Student-t-Tests und deren Aussage bezüglich Signifikanz (Bender
and Lange, 2001). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
55

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58

Selbstständigkeitserklärung
Ich, Melinda Sailer, erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur
unter Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe.
Ort, Datum Unterschrift
59