Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

3.7.3 Anschluss der µ-Slides
3 Methoden
Die µ-Slides wurden erst durch „Serial Connectors“ untereinander verbunden und dann mit
dem schon befüllten „Perfusion Set“ (Wagner, 2012a). Dabei durften keine Luftblasen eingeschlossen
werden. Der genaue Vorgang ist in der Application Note 13 (Wagner, 2012a)
beschrieben. Die „Fluidic Unit“ wurde von der Pumpe getrennt und aus dem Brutschrank genommen.
Die Schläuche des „Perfusion Sets“ wurden mit einer Schlauchklemme abgeklemmt.
Somit konnte nach Entfernen des Verbindungsstücks kein Medium austreten. Die gut befüllten
Reservoire des Anfangs- und Endslides wurden mit den Luersteckern des „Perfusion Sets“
verbunden.
Der Volumenfluss geht bei unidirektionaler Schaltung und positivem Druck durch die Slides
in Richtung eines markierten Schlauchs (Wagner, 2012a). Zur besseren Nachverfolgung der
Zellausrichtung wurde die Flussrichtung auf den Slides vermerkt. Die Zellen wurden mikroskopisch
auf vollständige Konfluenz untersucht.
Die „Fluidic Unit“ mit mediumgefülltem „Perfusion Set“ und den verbundenen µ-Slides wurde
wieder in den Brutschrank gestellt und an die Pumpe angeschlossen (Luftdruckschlauch
und Kabel). Die Zellen im µ-Dish wurden jeden zweiten Tag mit frischem Medium versorgt,
so dass sich auch unter statischen Bedingungen ein konfluenter Zellrasen ausbilden konnte.
3.7.4 Software
Die HUVEC wurden 5 Tage unter einem Scherstress von 10 dyn/cm 2 kultiviert.
Zum Steuern des Scherstresses wurde die Software „Pump Control“ der ibidi GmbH verwendet.
Die Oberfläche der Software ist in Abbildung 13 gezeigt.
Durch einen anfangs hohen Scherstress im Kanal würden sich die Zellen lösen. Um die Zellen
somit erst an den Volumenstrom zu gewöhnen wurde eine Rampe mit zunehmendem
Scherstress gefahren (siehe Tabelle 8). Die Parameter wurden zeitabhängig eingegeben, so
dass der Scherstress nach Ablauf der ersten Phase automatisch gesteigert wurde. Durch
das Hintereinanderschalten mehrerer Slides kann es zu Differenzen zwischen dem eingestellten
und dem tatsächlichen Volumenstrom kommen und dadurch zu einem unterschiedlichen
Scherstress. Daher wurde der Volumenstrom während der ersten Phase überprüft und gegebenenfalls
korrigiert (Kroutvar and von Guttenberg, 2012b).
Druck Scherstress Zeit
(1) 50 mbar keiner (keine Slides) 30 min
(2) 5 mbar 5 dyn/cm 2 30 min
(3) 22 mbar 10 dyn/cm 2 unbegrenzt
Tabelle 8: Parameter der Software „PumpControl“ für die Steuerung des ibidi Pump Systems.
(1) Parameter zur Entfernung der Luftblasen.
(2) und (3) Parameter zur Flussgenerierung mit bewachsenen Slides. Hierbei nimmt der
Scherstress nach einer halben Stunde zu. Die Druckangaben bei (2) und (3) sind nur
ungefähre Werte, da das Hauptaugenmerk auf dem Scherstress liegt.
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