Untersuchung immortalisierter Endothelzellen auf charakteristische ...

5 Diskussion
kontrolle. Die vorherige Annahme, dass Klon 2 der immortalisierten HUVEC stärker auf
Nährstoffknappheit reagieren als die anderen getesteten Zellen, ist somit hinfällig. Es muss
vermutet werden, dass durch die gentechnische Veränderung dieses Klones Rezeptoren oder
der Bewegungsapparat der Zellen beschädigt wurden. Somit kann es, wie gezeigt, bei Abwesenheit
eines Konzentrationsgradienten zu anderen Ergebnissen kommen wie erwartet.
Insgesamt zeigte sich jedoch, dass die immortalisierten HUVEC bei der chemotaktisch induzierten
Migration kein auffällig anderes Verhalten aufweisen wie die primären HUVEC. Das
unterschiedliche Verhalten von Klon 2 der immortalisierten HUVEC bei den Kontrollen ist
zu beobachten, aber vorerst kein ausschlaggebendes Kriterium für eine Nichteignung dieses
Klons als kulturfähige Endothelzelllinie.
5.2 Angiogenese-Assay
Anhand der Anzahl der gebildeten Zellröhren (hier TTL) kann auf die Fähigkeit zur Neubildung
von Blutgefäßen geschlossen werden (Folkman and Haudenschild, 1980a).
Wie in den Experimenten auf Matrigel gezeigt (vergleiche Abbildung 21 in Kapitel 4.2),
ist die TTL der primären und immortalisierten HUVEC in FCS-reduziertem Medium (red.
ECGM) annähernd gleich. In Basalmedium ohne Zusätze (0x ECGM) werden jedoch größere
Unterschiede registriert. Der auffälligste Unterschied ist hierbei, dass nur die primären
HUVEC bei einer Abwesenheit des Nährstoffes FCS auch weniger Tubes bilden. Beide Klone
der immortalisierten HUVEC bilden ohne FCS mehr Tubes. Dieser Effekt konnte schon
in internen, nicht veröffentlichten Daten beobachtet werden (von Ledebur-Wicheln, 2011).
Die Zelllinie EA.hy926, welche dabei in FCS-freiem Medium auch mehr Tubes bildete, ist
ein Hybrid primärer HUVEC mit Thioguanin-resistenten Klonen von A549 (Rieber et al.,
1993). Die Daten dieser beiden Zelllinien würden darauf hinweisen, dass fötales Kälberserum
den Tube formation-Prozess inhibieren kann. Bei primären HUVEC ist solch eine Inhibition
durch FCS nicht bekannt, da das komplexe Serum in vielen Fällen sogar zur Induktion von
Tube formation-Prozessen genutzt wird (Miura et al., 2004).
Der Unterschied des FCS-Gehalts von dem verwendeten Kulturmedium (12 %) zu dem Versuchsmedium
(0 bis 2 %) kann zu den Unterschieden der immortalisierten HUVEC geführt
haben. Oft werden gerade in den Versuchsmedien viel höhere Serumkonzentrationen (15 bis
30 %) verabreicht (Franke et al., 1979). Da die genaue Zusammensetzung jedes Serums von
Spender zu Spender schwankt, können beobachtete Effekte nicht genau zugeordnet werden.
Man geht daher dazu über serumfreie Medien zu verwenden und Nährstofffaktoren gezielt
und in bekannter Konzentration zuzusetzen (Brunner et al., 2010). Für weitere Versuche
würde es sich auch anbieten Humanserum zu testen. Dieses findet bei Angiogenese-Forschern
verstärkt Beachtung, da ja auch die zu testenden Zellen humanen Ursprungs sind (Folkman
and Haudenschild, 1980b).
In Vorversuchen wurde die für die Tube formation geeignete Zelldichte der primären HUVEC
herausgefunden. Diese wurde auf 51000 Zellen/cm 2 eingestellt (Wagner, 2012b). Die immortalisierten
HUVEC sollen dieselben Eigenschaften wie die primären HUVEC aufweisen. Daher
wurde dieselbe Zelldichte, wie bei den primären HUVEC, für alle Klone verwendet, obwohl
bekannt war, dass die Zelldichte Einfluss auf die Tube formation-Prozesse haben kann (Arnaoutova
et al., 2010). Wäre bei Vorversuchen eine veränderte Zelldichte ermittelt worden,
hätte man schon hier von einem veränderten Verhalten der immortalisierten HUVEC ausgehen
können.
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