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Inhaltsverzeichnis 

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes 

1. Einleitung und Motivation ................................................................................................. 6 

1.1. Geschichte und Bedeutung der Chemotaxisforschung ................................................ 6 

1.2. Mechanismus von Zellbewegung und Chemotaxis ..................................................... 7 

1.3. Zellbewegung durch 3-dimensionale Matrizes ........................................................... 9 

1.4. Analytische Verfahren ............................................................................................... 11 

1.4.1. Entwicklung analytischer Verfahren .................................................................. 11 

1.4.2. Anforderungsprofil an neue Systeme. ................................................................ 14 

1.5. Diffusion in Flüssigkeiten ......................................................................................... 16 

2. Zielsetzung der Arbeit ...................................................................................................... 17 

3. Material und Methoden .................................................................................................... 18 

3.1. Das µ-Slide Chemotaxis 3D ...................................................................................... 18 

3.1.1. Physikalische Eigenschaften .............................................................................. 18 

3.1.2 Zellkultur in µ-Slides ......................................................................................... 20 

3.2. Zellkultur ................................................................................................................... 21 

3.2.1. Kultivierung und Differenzierung von HL-60 Zellen ........................................ 21 

3.2.2. Kultivierung von HT-1080 Zellen ...................................................................... 22 

3.3. Mikroskopietechniken ............................................................................................... 24 

3.3.1. Zellmikroskopie ................................................................................................. 24 

3.3.1.1. Nieder- und Hochaufgelöster Phasenkontrast ............................................. 24 

3.3.1.2. Fluoreszenzmarkierung mit LifeAct-tag GFP2/RFP .................................. 24 

3.3.2. Diffusionsstudien ............................................................................................... 25 

3.3.2.1. Konfokale Laser Scanning Mikroskopie .................................................... 25 

3.3.2.2. Fluoreszenz-Korrelations Spektroskopie .................................................... 26 

3.4. Verwendete Gelmatrizes ............................................................................................ 29 

3.4.1. Collagen ............................................................................................................. 29 

3.4.2. Synthetische Hydrogele ..................................................................................... 29 

3.5. Chemotaxis mit HL-60 und HT-1080 ........................................................................ 32 

3.5.1. Durchführung der Experimente .......................................................................... 32 

3.5.2. Auswertung und Datenanalyse ........................................................................... 34 

4. Ergebnisse ........................................................................................................................ 36 

4.1. Errichtung und Messung von definierten Konzentrationsprofilen ............................ 36 

im µ-Slide Chemotaxis 3D. .................................................................................................. 36 

4.1.1. Untersuchung von Sonden-Matrix Interaktionen ................................................... 36 

4.1.2. LSM - Messungen mit Alexa 488 und FITC-Dextran ....................................... 40 

4.1.3. FCS-Messungen ................................................................................................. 46 

4.2. Zellkultur und Migration im Chemotaxis 3D µ-Slide ................................................... 52 

1.Einleitung und Motivation 4


4.2.1. HT-1080 Zellen in Gelmatrizes .......................................................................... 52 

4.2.1.1. Chemotaxis in Collagen I Matrizes: ........................................................... 52 

4.2.1.3. Chemotaxis in synthetischen Gelmatrizes .................................................. 55 

4.2.2. HL-60 Zellen in Gelmatrizes ............................................................................. 58 

4.2.3. Migrationsanalyse durch Aktinfärbung mit LifeAct-tag GFP2/RFP ................. 63 

5. Diskussion und Ausblick .................................................................................................. 65 

5.1. Bewertung der Ergebnisse ......................................................................................... 65 

5.1.1. Diffusionsmessungen ......................................................................................... 65 

5.1.2. Chemotaxis-experimente mit HT-1080 und HL-60 Zellen ................................ 66 

5.2 Weiterführende Ansätze ............................................................................................. 72 

6. Zusammenfassung ............................................................................................................ 73 

7. Abbildungsverzeichnis: .................................................................................................... 74 

8. Tabellenverzeichnis .......................................................................................................... 78 

9. Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................... 79 

10. Anhang ......................................................................................................................... 80 

11. Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 88 

Selbstständigkeitserklärung ...................................................................................................... 91 



1. Einleitung und Motivation 

1.1. Geschichte und Bedeutung der Chemotaxisforschung 

Erste Beobachtungen und Erkenntnisse bezüglich der Fortbewegung zellulärer Organismen 

wurden schon während der Entwicklung von Mikroskopen im 17. Jahrhundert durch den 

niederländischen Mikroskopbauer und Naturforscher Antoni van Leeuwenhoek gewonnen. In 

seinen Studien beobachtete er Bakterien und Protozoen, sowie menschliche und tierische 

Spermatozoen. Erheblich später, vor ungefähr 130 Jahren, befasste sich die Wissenschaft, 

vertreten durch die beiden deutschen Forscher Theodor Wilhelm Engelmann und Wilhelm 

Pfeffer erstmals gezielt und eingehender mit der Chemotaxis von Bakterien. Ihre Studien 

eröffneten den Zugang zu einem neuen Forschungsgebiet, das in den folgenden Jahre 

wichtige Erkenntnisse vor allem im Bereich der Medizin ermöglichte. 

Heute ist bekannt, dass Chemotaxis im menschlichen Körper unter Anderem wichtige Stufen 

der embryonalen Entwicklung beeinflusst [Singer & Kupfer, 1987], die Bekämpfung einer 

Infektion durch das Immunsystem koordiniert und eine entscheidende Rolle bei der 

Verbreitung und Versorgung bösartiger Tumore spielt [Schiffmann , 1982] [Downey, 1994]. 

Die Forschungsarbeit auf dem Gebiet der Chemotaxis stellt inzwischen eine der wichtigsten 

Datensammlungen dar, um neue Therapieansätze zur Bekämpfung von malignen Tumoren 

oder bakteriellen Infektionen zu entwickeln. 

Es sollte diesbezüglich also nicht verwundern, dass inzwischen verschiedenste Ansätze zur 

detaillierten Beobachtung chemotaktischer aktiver Zellen und deren Reaktion auf negative 

oder positive Stimuli in der Forschung etabliert sind. Bevor die wichtigsten unter ihnen kurz 

vorgestellt werden, gilt es aber zuerst einen kurzen Blick auf die Bewegungsmechanismen 

von Zellen zu werfen. 



1.2. Mechanismus von Zellbewegung und Chemotaxis 

Bei der Betrachtung und Analyse zellulärer Bewegungen ist zwischen den unterschiedlichen 

Bewegungsprofilen grundlegend zu unterscheiden. Chemokinese stellt die Fähigkeit zu 

willkürlicher und ungerichteter Bewegung, als Reaktion auf die Zugabe eines bestimmten 

Stoffes dar. [Becker, 1977]. Erfolgt die Ausrichtung des Bewegungsprofiles von Zellen gezielt 

und in Abhängigkeit eines zugegebenen Stoffes spricht man von Chemotaxis. [Engelmann, 

1881] [Pfeffer, 1884/1888]. Die Bewegung kann dabei auf den Stoff zu erfolgen 

(Chemoattraktant), oder von ihm fort (Chemorepellent). Dabei wird noch unterschieden, ob 

die chemotaktische Reaktion durch Stoffgradienten in der flüssigen Phase (Chemotaxis) oder 

bezüglich der Anzahl der Adhäsionsmoleküle an einer Oberfläche induziert wird 

(Haptotaxis). [Carter, 1967]. 

Abbildung 1 gibt einen Überblick über die unterschiedlichen Formen der Fortbewegung 

eukaryontischer Zellen. 

Abbildung 1: Die verschiedenen Arten stimulierter Zellbewegungen eukaryontischer Zellen in 

schematischer Darstellung [Kőhidai L., 2006] 

Es bestehen grundlegende Unterschiede in der Bewegungsmechanik von Prokaryonten und 

Eukaryonten. Diese Arbeit befasst sich allerdings ausschließlich mit der Chemotaxis von 

Eukaryonten. 

Eukaryontischen Zellen steht zur „Erkundung“ ihres Umfelds ein umfangreiches Netzwerk an 



Oberflächenrezeptoren zur Verfügung. Im Idealfall, bei einer mittleren Chemoattraktand 

Konzentration, die in etwa der Dissoziations-Konstante des Rezeptor-Ligand Komplexes 

entspricht, kann so über die Zelllänge ein Gradient von etwa 2% „erfühlt“ werden. [Devreotes 

et al., 1988]. So vielfältig dabei stimulierende und hemmende Mechanismen auch sein 

mögen, läuft die dadurch ausgelöste Reaktion in den meisten Fällen nach einem simultanen 

Schema ab: 

– Protrusion/Fortsatzbildung (Lamellipodien) 

– Adhäsion der Zellfront. 

– Translokation/Umlagerung der Zellkörpers 

– Retraktion/Ablösen des rückwärtigen Zellteils 

Innerhalb der Zelle kommt es während der Bewegung zu einer Umlagerung des Aktingerüsts. 

Die chemotaktisch induzierte Ausrichtung einer Zelle und die Ausbildung einer Zellfront 

sowie eines rückwärtigen Zellteils bezeichnet man als Polarisation. [Zigmond et al., 

1981],[Weiner, 2002]. Die Polarisation eines neutrophilen Granulozyten, ausgelöst durch den 

chemotaktischen Stimulus aus einer Mikropipette ist in Abbildung 2 gezeigt. 

Abbildung 2: Polarisation eines neutrophilen Granulozyten als Reaktion auf eine Stimulation mit N- 

Formylmethionyl-Lencyl-Phenylalanin (fMLP) aus einer Mikropipettenspitze (weisser Punkt), nach (A) 5s, 

(B) 30s, (C) 81s, (D) 129s. Der weiße Balken in (A) entspricht 5µm. [Weiner et al., 1999] 



1.3. Zellbewegung durch 3-dimensionale Matrizes 

Unter natürlichen Bedingungen bewegen sich wandernde Zellen in vivo durch eine aus 

mehreren Komponenten bestehende Matrix. Bei dem Versuch den Vorgang der Chemotaxis 

auf in vitro Modelle zu übertragen, beschränkten sich die meisten Modelle der vergangenen 

Jahre darauf, die Bewegung von Zellen über eine beschichtete Oberfläche zu analysieren. 

Diese Art Versuchsansatz hat den Vorteil, dass die Bewegung der Zellen abhängig von einem 

überschaubaren Maß an einstellbaren Parametern erfolgt und sich hauptsächlich über die 

Fähigkeit zur Adhäsion und De-adhäsion definiert. Inzwischen hat man festgestellt dass 

zwischen dem „Kriechen“ von Zellen entlang einer Oberfläche und der Bewegung durch eine 

vernetzte, 3-dimensionale Matrix wichtige Unterschiede bestehen. 

Das morphologische Erscheinungsbild von Zellen in einer 3-dimensionalen Matrix 

unterscheidet sich grundlegend von adhärenten Zellen auf einer beschichteten Oberfläche. 

Adhärente Zellen besitzen einen großen Durchmesser und weitreichende Fortsätze 

(Pseudopodien). Zellen, die komplett von einer Gelmatrix umschlossen werden, erscheinen 

kleiner, rundlich und bilden deutlich kürzere Pseudopodien aus. Je nach Beschaffenheit der 

Matrix und der Größe der Zelle findet die Fortbewegung entweder durch eine morphologische 

Anpassungsreaktion (lange spindelförmige Verformung der Zellen), eine Ummodellierung der 

umgebenden Matrix, zum Beispiel durch Matrix-metalloproteasen (MMPs) , oder eine 

Mischung aus beiden Prozessen statt. Der Ablauf und die Geschwindigkeit dieses Prozesses 

variiert in Abhängigkeit des untersuchten Zelltyps und der Beschaffenheit von dessen 

natürlicher Umgebung. Dieser Umstand resultiert in der Notwendigkeit einer weiteren 

Einteilung chemotaktisch aktiver Zellen. 

„langsame Zellen“ 

Die Geschwindigkeit mit der sich eine Zelle durch ein Gel bewegt ist im weitesten Sinne 

umgekehrt proportional zu ihrer Größe. Um sich zu bewegen müssen große, langsame Zellen 

die umgebende Gelmatrix „umzuformen“. Meist geschieht das unter Verwendung einer 

vielfältigen Palette an Proteasen, mit denen die Quervernetzung der zu durchwandernden 

Struktur aufgelöst werden kann. Derartige Zellen bewegen sich mit Geschwindigkeiten im 

Bereich von 0,5 – 1µm pro Minute. Als „langsam migrierend“ zu klassifizierende Zellen sind 

unter Anderem diverse Endothelzellen, mit etwa 10-20µm/h, oder Fibroblasten mit ungefähr 



30-40µm/h einzuordnen. [Martin et al., 2001] [Even-Ram et al., 2005]. Besonders 

hervorzuheben sind hierbei HUVEC-Zellen (human umbilicar vascular endothelial cells), die 

bei der Tumorforschung und Angiogenese eine zentrale Rolle spielen oder die humane 

Fibrosarkom Zelllinie HT-1080, die im Rahmen dieser Arbeit stellvertretend für Versuche mit 

langsamen Zellen betrachtet werden soll. 

„schnelle Zellen“ 

Zellen des Immunsystem die, anhand ihrer natürlichen Bestimmung, schnell am Einsatzort 

sein müssen und außerdem Gewebe aller Art durchdringen, migrieren zwischen 10 und 40- 

fach so schnell wie oben beschriebene Zellen. Aufgrund der, in der Regel geringeren Größe, 

bewegen sich schnelle Zellen, wie zum Beispiel Leukozyten ohne Matrixummodellierung und 

nur durch eine morphologische Anpassungsreaktion durch die Gelmatrix. [Friedl et al., 2000] 

Innerhalb der Zellen zeigt sich eine höhere Tendenz zur Polarisation und das Ausbilden und 

Ablösen von Adhäsionspunkten findet deutlich beschleunigt statt. [Even-Ram et al., 2005] 

So liegen die Literaturangaben für die Migrationsgeschwindigkeit von beispielsweise T- 

Lyphozyten bei etwa 15 µm/min [Lefort et al., 2010] und die neutrophiler Granulozyten bei 

etwa 24-27 µm/min [Foxman et al. 1999]. Ambivalent dazu können auch Zellen der HL-60 

Leukämie Zellinie betrachtet werden, die zu eingeschränkt funktionellen Neutrophilen 

differenziert werden können und in dieser Arbeit stellvertretend für schnelle Zelllinien 

verwendet werden sollen. 



1.4. Analytische Verfahren 

Die fortlaufende Veröffentlichung neuer Erkenntnisse auf dem Gebiet der Zellmigration und 

Chemotaxis erfordert die stetige Entwicklung neuer, dem Fokus des Interesses angepasster 

Methoden. Im Folgenden soll ein kurzer Überblick über die Entwicklung der 

Analysemethoden in den vergangenen Jahren gegeben werden. 

1.4.1. Entwicklung analytischer Verfahren 

Eines der ersten Systeme zur Analyse des chemotaktischen Potentials verschiedener 

Substanzen und zugleich der Pionier einer andauernden Entwicklung sogenannter 2-Kammer 

Systeme, war die von Steve Boyden entwickelte Boyden-Kammer [Boyden, 1962]. Das 

zugrunde liegende Prinzip dieser Systeme sind 2 Flüssigkeitsreservoirs, von denen eines mit 

dem zu untersuchenden Stoff und das andere mit Referenzlösung gefüllt ist. Im Fall der 

ursprünglichen Boyden-Kammer werden die beiden Flüssigkeiten durch eine Membran 

getrennt, deren Porengröße so gewählt wurde, dass darauf liegende Zellen sie nur durch 

aktive Migration überwinden können. Später wurde das System dahingehend modifiziert, dass 

man die poröse Membran durch eine Gelmatrix ersetzte, welche die Zellen durchwandern 

mussten, um in Richtung der höheren Chemoattraktant Konzentration zu gelangen. 

Der Aufbau einer modifizierten Boyden-Kammer ist in Abbildung 3 schematisch dargestellt: 

Abbildung 3: Modifizierte Boyden-Kammer mit Gelmatrix. C0 entspricht Medium ohne Chemoattraktant, 

C100 Medium mit Chemoattraktant. 

Ausgewertet wird in beiden Verfahren rein statistisch durch die Ermittlung der Zellzahl auf 

der Unterseite der Membran (für adhärente Zellen) und/oder in den beiden Reservoiren (für 

Suspensionskulturen). 



Vorteile des Verfahrens liegen klar bei der Vermeidung umständlicher bildgebender Verfahren. 

Eine Beobachtung der Zellen während des Migrationsvorganges und damit eine Analyse von 

Veränderungen von Morphologie, Geschwindigkeit oder Direktionalität der Bewegung sind 

nach dieser Methode jedoch nicht möglich. Je nach Zelltyp muss die Porengröße der 

Membran neu gewählt werden. Dieser Umstand macht das Verfahren für Zellen mit wenig 

bekannten Parametern ungeeignet. 

Eine Weiterentwicklung der von Boyden eingeführten 2-Kammer Techniken und zugleich 

einen großen Schritt in der Entwicklung der Chemotaxis-Assays stellt die sogenannte 

Zigmond-Kammer dar, mit der es erstmals möglich war, die Zellen während der Migration 

unter dem Mikroskop zu beobachten und die Anzahl der migrierenden Zellen festzuhalten 

[Zigmond, 1977]. Bei der Zigmond-Kammer sind die Kammer mit Hungermedium und die 

Kammer mit Chemoattraktant über einen schmalen Spalt verbunden, der zwischen der Brücke 

der beiden Kammern und einem darüber liegenden Deckglas entsteht. Durch 

Diffusionsprozesse entsteht innerhalb dieses Spalts, in welchen die Zellen zur 

Versuchsdurchführung eingebracht werden, ein Stoffgradient, der von den Zellen detektiert 

werden kann. 

Der Aufbau der Zigmond-Kammer ist in Abbildung 4 skizziert 

Abbildung 4: Aufbauskizze einer Zigmond-Kammer [Zigmond, 1977] 

Es besteht die Möglichkeit den Spalt zwischen den Kammern mit einer Agarschicht zu füllen, 

durch welche sich die Zellen bei der Migration bewegen müssen und dadurch eine Art 3D- 

Chemotaxis-Assay durchzuführen. Daraus abgeleitete Methoden, wie die sogenannte Dunn- 

Kammer folgen einem ähnlichen Prinzip bei leicht unterschiedlichem Aufbau. Der Gradient 

zwischen beiden Kammern kann für lange Zeit stabil gehalten werden. Durch das Aufbringen 

des Deckglases mit den Zellen kann es jedoch bei unvorsichtiger Handhabung zu einer 

Durchmischung der Lösung kommen. Es bedarf daher einiger Erfahrung reproduzierbare 

Versuchsbedingungen bereitzustellen. 



Die moderne Kunststofftechnologie und hochpräzise Fertigungsmethoden haben es in den 

letzten Jahren ermöglicht, Kanäle mit einer Höhe von wenigen µm in Kunststoffträger zu 

prägen. Jeon et al. veröffentlichte vor einigen Jahren eine Methode, bei der in einem µ-Kanal 

durch ein Netzwerk aus verbundenen µ-Kanälen Stoffflüsse unterschiedlicher 

Chemoattraktant-Konzentrationen zu einem statischen Gradienten angeordnet werden können 

[Jeon et al., 2002]. Die Methode ist in Abbildung 5 am Beispiel von Neutrophilen 

schematisch dargestellt. 

Abbildung 5: (A) Schematische Darstellung der Kanalanordnung zur Generierung eines Stoffgradienten 

und (B) 3-Dimensionale Ansicht des Beobachtungsbereiches mit Zellen in einem Stoffgradienten. [Jeon et 

al., 2002] 

Ein großer Vorteil dieser Methode liegt darin, dass der Gradient durch den anliegenden Fluss 

von Anfang des Experiments an zur Verfügung steht und durch die fehlende Möglichkeit 

eines Konzentrationsausgleichs statisch bleibt. Das System ist jedoch relativ aufwendig und 

teuer was einer weitläufigen Verbreitung bisher im Wege steht. 

Neben den genannten Verfahren gibt es noch Untersuchungsmethoden mit Zellen in 

Agarosegelen oder unter Verwendung eines chemotaktischen Stimulus aus einer 

Mikropipettenspitze. Jede von ihnen bietet speziellen Bedürfnissen angepasste Vor- und 

Nachteile. Es lassen sich aber unabhängig davon einige Punkte hervorheben, die bei der 

Entwicklung neuer Analysemethoden heute fast immer eine Rolle spielen. 



1.4.2. Anforderungsprofil an neue Systeme. 

Das anzustrebende Eigenschaftsprofil für neue Chemotaxis-Assays setzt sich in erster Linie 

aus den Vorzügen bestehender Methoden zusammen. 

Folgende Eigenschaften sollen dabei vereint werden: 

– gute mikroskopische Eigenschaften (Live Cell Imaging) 

– kostengünstig 

– anwendungsfreundlich 

– reproduzierbar 

– stabile Versuchsbedingungen 

Der Trend zur Annäherung der in vitro Chemotaxis an die Bedingungen in vivo erfordert von 

neuen Untersuchungsmethoden außerdem, wie bereits erwähnt, die Möglichkeit zur Analyse 

von 3-dimensionaler Zellmigration in einer vernetzten Struktur unter Verwendung einer 

Gelmatrix. 

Die ibidi GmbH entwickelt seit einigen Jahren Objektträger mit integrierten µ-Kanälen auf 

Basis modernster Kunststofftechnologie. Die Systeme arbeiten mit Kanälen einer Höhe von 

wenigen µm in Objektträgern aus hochwertigem Kunststoff und bieten dadurch einige 

Vorteile: 

– stabil und bruchresistent 

– kostengünstig 

– gute optische Eigenschaften 

– geringer Einsatz an Zellen/Medien notwendig 

Vor etwa 1 Jahr wurde das µ-Slide Chemotaxis 3D vorgestellt. Das Produkt ist eine 

Weiterentwicklung des µ-Slide Chemotaxis, einem Objektträger mit einem integrierten 2- 

Kammersystem, das durch einen µ-Kanal verbunden ist und in welchem Zellen einem 

Stoffgradienten ausgesetzt werden können. (siehe auch Punkt 3.1.1.) Mit dem µ-Slide 3D ist 

es möglich, den Kanal mit einer Gelmatrix zu füllen und die Migration der Zellen damit in die 

3. Dimension zu erweitern. 



Durch die geringe Höhe der µ-Kanäle kann die Diffusion zwischen den beiden Kammern nur 

sehr langsam stattfinden und der erzeugte Gradient, in welchem sich die Zellen bewegen 

sollen, bleibt lange Zeit annähernd konstant. 

Die Betrachtung der Diffusion in den µ-Slides soll in dieser Arbeit eine zentrale Rolle spielen. 

Aus diesem Grunde soll im Folgenden kurz auf einige Zusammenhänge der Stoffdiffusion in 

Flüssigkeiten eingegangen werden. 



1.5. Diffusion in Flüssigkeiten 

Die treibende Kraft bei der Bewegung von Teilchen im Raum ist die Brownsche 

Molekularbewegung. Liegt eine ungleichmäßige Konzentrationsverteilung eines gelösten 

Stoffes in einem Flüssigkeitsvolumen vor, tritt ausgelöst durch die Brownsche 

Molekularbewegung nach einem bestimmten Zeitraum ein Konzentrationsausgleich auf. 

Die differentielle Steilheit eines vorliegenden Konzentrationsunterschieds wird als Gradient 

(gradC) bezeichnet. Der durch den Vorgang dieses Konzentrationsausgleichs auftretende 

Teilchenstrom (j) wird durch das 1. Ficksche Gesetz beschrieben: 

j = -DgradC 

Zur Beschreibung instationärer, wie zum Beispiel zeitlich veränderlicher Diffusion zwischen 

endlichen Reservoiren wird das 2. Ficksche Gesetz herangezogen, welches auch als 

Diffusionsgleichung bezeichnet wird und die zeitliche und räumliche Entwicklung des 

Gradienten beschreibt. 

. 

D bezeichnet dabei den Diffusionskoeffizienten des gelösten Stoffes in m 2 /s. Er gibt an, 

welche Fläche in einer bestimmten Zeit durchdrungen wird und ist abhängig von der Größe 

des diffundierenden Moleküls (R0), der Temperatur (T) und der dynamischen Viskosität (µ) 

der umgebenden Flüssigkeit. 

Zellen können unterschiedliche Stoffkonzentrationen über mehrere Größenordnungen hinweg 

erkennen. Die Orientierung erfolgt dabei auf Grundlage des relativen Stoffgradienten. 

Der relative Gradient wird als gradC/C beschrieben und bezieht sich auf den 

Konzentrationsunterschied unabhängig von der Absolutkonzentration. Wie sensitiv Zellen auf 

einen Gradienten reagieren können hängt davon ab, wie nahe die Absolutkonzentration des 

vorhandenen Chemoattractant an der Dissoziationskonstante des Rezeptor-Ligand Komplexes 

der Zellen liegt. Abhängig von der verwendeten Zelllinie können Zellen einen relativen 

Gradienten von etwa 1-2% über die Länge des Zellkörpers aufspüren. [Mato et al., 1975], 

[Tranquillo et al., 1988], [Fisher et al., 1989] 



2. Zielsetzung der Arbeit 

Aus dem Wissen um die Diffusionsvorgänge in Flüssigkeiten und deren Abhängigkeit von der 

Molekülgröße, leitet sich die Fragestellung ab, ob die Wahl des verwendeten Chemoattraktant 

Einfluss auf die Etablierung des Diffusionsprofils im µ-Slide Chemotaxis 3D hat. Zudem soll 

untersucht werden, ob durch die, mit Einführung des µ-Slide Chemotaxis 3D neu geschaffene 

Möglichkeit, eine Gelmatrix in den Kanalbereich des µ-Slides einzubringen, eine 

Diffusionsbarriere erzeugt. 

Durch konfokale mikroskopische Aufnahmen mit diffundierenden Fluoreszenzfarbstoffen soll 

dazu eine Analyse der Entwicklung des Diffusionsprofils abhängig von der Versuchsdauer, 

der verwendeten Matrix und der diffundierenden Stoffe durchgeführt werden. Anhand der 

gewonnenen Daten soll eine Einschätzung abgegeben werden, ob, und in welchem zeitlichen 

Rahmen sich das µ-Slide Chemotaxis 3D für Chemotaxis Experimente mit Zellen in einer 

Gelmatrix eignet. 

Parallel dazu soll versucht werden, anhand ausgewählter Zelllinien, stellvertretend für 

langsam und schnell migrierende Zellen, 3D Chemotaxis Experimente zu etablieren und die 

erzeugten Daten mit bestehenden 2D Chemotaxis Daten zu vergleichen. 

2.Zielsetzung der Arbeit 17


3. Material und Methoden 

Eine Liste aller, im Rahmen der vorliegenden Arbeit verwendeten Geräte, Chemikalien und 

Verbrauchsmaterialien befindet sich in Anhang H auf Seite 101f. 

3.1. Das µ-Slide Chemotaxis 3D 

3.1.1. Physikalische Eigenschaften 

Das Chemotaxis 3D µ-Slide der Firma ibidi ist ein, speziell für chemotaktische 

Untersuchungen in 3-dimensionaler Umgebung entwickelter Objektträger aus optisch 

hochwertigem, biokompatiblem Kunststoff. In den Objektträger mit standardmikroskopischen 

Maßen sind nummerierte 2-Kammer Systeme für 3 separate Chemotaxis Experimente 

eingebettet. Der Aufbau des Systems ist in Abbildung 6 schematisch dargestellt. 

Abbildung 6: Schematische Darstellung des µ-Slide Chemotaxis 3D in der Draufsicht. Der Nummern von 

1-3 bezeichnen die 3 unabhängigen 2-Kammer Systeme. Die Buchstaben A und B stellen die Füllstutzen 

des Mittelkanals, C-F diejenigen der seitlichen Kammern dar. [Ibidi GmbH, 2010] 

Jedes dieser 3 Module setzt sich aus 2 Reservoiren zusammen die über einen, parallel der 

Längsseiten verlaufenden, 70µm hohen und 1mm breiten Mikrokanal verbunden sind. Die 

beiden Reservoire und der dazwischenliegende Kanal können durch Einfüllstutzen an den 

äußeren Ecken beziehungsweise den beiden begrenzenden Enden des Kanals einzeln gefüllt 

werden. Nach dem Einfüllen der betreffenden Lösungen werden die Stutzen durch 

eingepasste Stöpsel steril verschlossen. Das Fassungsvermögen des Kanals beträgt 6µl das der 

beiden Reservoirs jeweils 60 µl. Die zu untersuchenden Zellen befinden sich entweder 

adhärent auf dem Boden des Kanals oder eingebettet in eine eingefüllte Gelmatrix. 

3.Material und Methoden 18


Wird eines der beiden Reservoirs mit Chemotaxin und das verbleibende mit Referenzlösung 

befüllt, so stellt sich ein definierter Stoffgradient über den Querschnitt des Kanals ein. Durch 

den geringen Querschnitt des Kanals soll der Gradient für lange Zeit konstant bleiben. Der 

Boden, der beide Reservoire sowie den Kanal nach unten abschließt besteht aus einer dünnen 

Kunststofffolie, die in ihren optischen Eigenschaften mit, in der Mikroskopie verwendeten 

Deckgläsern, vergleichbar ist. Das System wurde für die Verwendung mit inversen 

Mikroskopen konzipiert. 

A 

B 

Abbildung 7: Schematische Schnittdarstellung des µ-Slide Chemotaxis 3D entlang der x-Achse mit (A) 

Zellen in einer 3D-Gelmatrix und (B) einer 2D-Zellschicht auf der Kanaloberfläche. [Ibdi GmbH, 2010] 



3.1.2 Zellkultur in µ-Slides 

Durch die Kunststofffolie, die den Boden des Slides bildet kann Gasaustausch mit der 

Umgebungsluft beziehungsweise der CO2-angereicherten Atmossphäre eines Brutschrankes 

stattfinden. Der Kunststoff des Slides kann bei ausreichender Equilibrierung in einer 

beheizten Atmosphäre, in der eingefüllten Matrix gelöste Gase aufnehmen. Der Entstehung 

von Luftblasen und störenden Gaseinschlüssen wird somit entgegengewirkt. Während der 

chemotaktischen Untersuchungen können Zellen mit minimalem Aufwand über ein Heiz- und 

Begasungssystem mit optimierten Überlebensfaktoren versorgt werden. Dadurch können in 

den µ-Slides Bedingungen wie in einem Brutschrank eingestellt werden. Die Zellen bleiben 

länger vital und können auch über eine Zeitspanne von mehreren Tagen hinweg beobachtet 

werden. Die Höhe des Kanals entspricht mit 70µm in etwa dem Schärfebereich von häufig 

verwendeten Objektiven von 4-facher bis 10-facher Vergrößerung. Die verwendete 

extrazelluläre Matrix beeinflusst Morphologie und Migrationsverhalten der Zellen, so dass die 

Eigenschaften 3-dimensionaler Zellmigration untersucht werden können, ohne dass sich die 

Zellen dabei aus der Schärfeebene gängiger Objektive (10x/20x) bewegen. Die hydrophobe 

Oberfläche des Kunststoffes wurde mit einer Beschichtung aus Collagen, Fibronektin oder 

Poly-L-Lysin versehen, um adhärenten Zellen eine Kontaktfläche bereitzustellen. 

Im Bezug auf Biokompatibilität und Eignung zur Zellkultur zeichnet sich das µ-Slides 

Chemotaxis 3D durch folgende Eigenschaften aus. 

– Gasaustausch möglich 

– geringe Volumina nötig 

– beschichtbar und biokompatibel 


3.2. Zellkultur 


3.2.1. Kultivierung und Differenzierung von HL-60 Zellen 

Kultivierung der Zellen 

Für chemotaktische Experimente standen HL-60 Leukämie-Zellen vom Wildtyp und 

transfiziert mit LifeAct-tag GFP zur Verfügung. Beide Varianten wurden in 75 cm 2 

Zellkulturflaschen (roter Verschluss) mit RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin der Firma C-C 

Pro kultiviert. Die genaue Zusammensetzung des Mediums ist in Anhang F auf Seite 99 

dargestellt. Dem Medium wurden nachträglich 10% Foetales Kälberserum (FCS) und 1% 

Penicilin-Streptomycin Lösung hinzugefügt. Soweit nicht anders dargestellt, kann im 

Folgenden davon ausgegangen werden, dass RPMI 1640 Medium immer mit den 

beschriebenen Zusätzen verwendet wurde. Die Zellen wurden in einer bestehenden 

Suspensionskultur der Passage 3 übernommen und in einem Brutschrank bei 37° C und 5% 

CO2 stabil auf einer Zellzahl von etwa 1x10 6 Zellen/ml gehalten. Die Zelldichte wurde dazu 

im 2-Tagesrythmus mit dem Phasenkontrastmikroskop überprüft. Anschließend wurden die 

Zellen mit einer Neubauer Kammer improved ausgezählt und abhängig von der Zelldichte in 

einem Verhältnis von 1:4 bis 1:6 verdünnt und mit frischem Medium versorgt. Ein 

Unterschied zwischen dem Wildtyp und der transfizierten Variante war dabei nicht zu 

erkennen. 

Differenzierung der Zellen 

HL-60 Zellen können durch Zugabe polarer Stoffe zu eingeschränkt funktionalen 

neutrophilen Granulozyten differenziert werden. Zur Differenzierung wurden Zellen einer 

Dichte von 1x10 6 Zellen/ml in 3,5 ml RPMI 1640 Medium mit 1,3% DMSO aufgenommen. 

Die Zellen teilen sich während der Differenzierung kaum, so dass für nachfolgende 

Berechnungen von einer Absolutmenge von 3,5 x 10 6 Zellen ausgegangen werden konnte. 

Für die Differenzierung wurden Petrischalen der Firma BD mit einem Durchmesser von 3,5 

cm und der Oberflächenbeschichtung tissue culture treat verwendet. Die Beschichtung diente 

dazu, die Anzahl adhärenter Zellen so niedrig wie möglich zu halten, da diese beim 

Entnehmen der Flüssigkeit nicht erfasst wurden und dadurch nicht für die anschließenden 

Chemotaxis Versuche verwendet werden konnten. Die Differenzierung der Zellen lieferte die 

besten Ergebnisse nach einem Zeitraum von 4-6 Tagen, was sich mit den Vorgaben aus der 

Literatur deckt. [Collins, 1987] Der Erfolg der Differenzierung wurde anhand der 



Morphologie der Zellen und dem Anteil adhärenter Zellen an der Gesamtzellmenge überprüft. 

Differenzierte Neutrophilen-ähnliche Zellen sind segmentkernig, etwas kleiner als 

undifferenzierte Zellen und adhärent. Die Morphologischen Unterschiede zwischen 

differenzierten und undifferenzierten Zellen sind in Abbildung 8 dargestellt. 

Abbildung 8:Morphologisches Erscheinungsbild von (A) undifferenzierten HL-60 Zellen und (B) HL-60 

Zellen nach 6 Tagen in 60mM DMSO. [Wright-Giemsa Färbung, Collins, 1978] 

Es wurden durchwegs bessere Ergebnisse erzielt, wenn die Zellen während der 

Differenzierung nach 2-3 Tagen durch Zentrifugieren bei 1500 RPM für 5min vom 

übersäuerten Medium getrennt und anschließend in frischem Medium resuspendiert wurden. 

Nach demselben Prinzip wurden die Zellen nach erfolgter Differenzierung vom Medium 

getrennt, mit 5ml PBS gewaschen und in 175 µl Hanks Buffered Salt Solution aufgenommen, 

um eine finale Konzentration von 1,7x10 7 Zellen zu erhalten. Ausgehend von dieser Lösung 

konnten Chemotaxis-Experimente an den Zellen durchgeführt werden. 

3.2.2. Kultivierung von HT-1080 Zellen 

Für die Chemotaxisexperimente an HT-1080 Fibrosarkom-Zellen wurden anfangs Zellen vom 

Wildtyp verwendet. Etwa ab der Hälfte der durchgeführten Versuche wurde mit einer mit 

LifeAct-tag RFP transfizierten Variante gearbeitet. Hierbei ist anzumerken, dass die 

transfizierten Zellen etwa um den Faktor 1,5 erhöhte Generationszeiten aufweisen. Das 

Vorgehen bei der Kultivierung und das Verhalten in Chemotaktisexperimenten waren jedoch 

für beide Zellinien identisch. 

HT-1080 Wildtyp Zellen wurden in Passage 11 übernommen, die LifeAct-tag RFP 

transfizierten Zellen wurden ab Passage 2 weitergeführt. Beide Zelllinien wurden in 75 cm 2 



Zellkulturflaschen (gelber Verschluss, Cell+) in DMEM-Medium (C-C-Pro) mit 10% FCS 

kultiviert. 

Die genaue Zusammensetzung des Mediums findet sich in Anhang G auf Seite 100. Im 

Folgenden darf davon ausgegangen werden, dass DMEM soweit nicht anders beschrieben 

immer mit 10% FCS verwendet wurde. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem 

Brutschrank bei 37°C und 5% CO2. Im Abstand von 2 Tagen wurde die Konfluenz der Zellen 

unter dem Phasenkontrastmikroskop überprüft. Das Wachstum von HT-1080 Zellen ist 

weitgehend unabhängig von Zell-Zell Kontakten [Collins, 1978]. Um die Zellzahl dennoch 

stabil zu halten, wurde versucht die Zellen stets so lange in einer Flasche zu kultivieren bis 

die Zellschicht zu mindestens 80% optisch konfluent war. Anschließend wurden die Zellen in 

den Kulturflaschen mit 10 ml PBS gewaschen Zellen und nach Absaugen des PBS durch 

Trypsinierung mit 2ml Trypsin-EDTA vom Flaschenboden gelöst. Die gelösten Zellen wurden 

mit 10 ml DMEM versetzt und anschließend, abhängig von der Zelldichte in einem Verhältnis 

etwa 1:4 mit frischem Medium verdünnt. Auf diese Weise wurde die Zellzahl bei etwa 1x10 5 

bis 1x10 6 Zellen stabil gehalten. 

Die überschüssigen Zellen wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 1500 RPM wieder 

vom Medium getrennt und abhängig von der vorhandenen Gesamtzellmenge in etwa 500µl 

DMEM resuspendiert um eine finale Zellzahl von ungefähr 1,7x10 7 Zellen für 

Chemotaxisexperimente zu erhalten. 

Die mit LifeAct transfizierten Zellen wurden aufgrund des langsameren Wachstums in der 

Regel nur im Verhältnis 1:2 verdünnt. Zusätzlich wurde hier dem Medium noch G418-Sulphat 

in einer Konzentration von 375µg/ml zugefügt, um den Selektionsdruck auf die transfizierten 

Zellen aufrecht zu erhalten. 



3.3. Mikroskopietechniken 

3.3.1. Zellmikroskopie 

3.3.1.1. Nieder- und Hochaufgelöster Phasenkontrast 

Ein Großteil der Bilder, die als Rohdaten zur Auswertung der Experimente dienten, wurde 

nach dem Phasenkontrastverfahren aufgenommen. Dazu wurde das inverse 

Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse Ti mit den Objektiven Plan Fluor 4x/0.13 und Planfluor 

10x/0.3 verwendet. Die Bilddaten wurden mit der 5Mhz CCD-Kamera MicroMax der Firma 

Princeton Instruments mit einer Farbtiefe von 16 bit generiert. Die Belichtungszeit der 

Aufnahmen betrug im Schnitt etwa 30ms unter einer Leistung der Dia-Lampe von 30 Watt bei 

6V Spannung. Um Detailaufnahmen von Zellen zu erzeugen wurde das Objektiv Plan ApoVC 

60x/1.4 mit Immersionsöl verwendet. Mikroskop und Peripherie wurden etwa 1 Stunde vor 

Versuchsbeginn eingeschaltet, um Einflüsse auf die Versuchsdaten durch Abwärme zu 

normalisieren. 

3.3.1.2. Fluoreszenzmarkierung mit LifeAct-tag GFP2/RFP 

Um bei den chemotaktischen Experimenten einen Blick in die Vorgänge im inneren der Zelle 

zu ermöglichen wurden Zellen verwendet, die mit dem sogenannten LifeAct-tag GFP2/RFP 

transfiziert waren. Das LifeAct-tag ist ein 17 Aminosäuren langes Protein, dass es ermöglich 

Fluoreszenzmarker wie GFP2 oder RFP an die Aktinfilamente (F-Aktin) in Zellen anzulagern, 

ohne die Dynamik des Aktinmoleküls dadurch zu beeinträchtigen. [Riedl, 2008] 

Abbildung 9 zeigt schematisch den Aufbau eines Aktin-Filaments das mit LifeAct markiert 

wurde. 

Abbildung 9: Schematischer Aufbau von F-Aktin mit LifeAct-tag GFP2/RFP [modifiziert aus 

Produktflyer, Ibidi GmbH, 2011] 



Die angehängten fluoreszierenden Proteine GFP2 und RFP besitzen Anregungsmaxima bei 

Wellenlängen von 483nm (GFP2) und 555nm (RFP) sowie Emissionsmaxima bei 506nm 

(GFP2) und 584nm (RFP). 

Für die Aufnahmen wurde das unter 3.3.1.1. beschriebene inverse Fluoreszenzmikroskop 

Nikon Eclipse Ti mit einem Plan ApoVC 60x/1.4 Objektiv verwendet. Als Anregungsquelle 

wurde eine Nikon Intensilight Quecksilberhochdrucklampe verwendet. Das verwendete 

Filterset für Versuche mit GFP2 war FiTC mit einem Anregungsspektrum von 465-495 nm 

und einem Emissionsspektrum von 515-555 nm. Für RFP wurde TxRed mit einem 

Anregungsspektrum von 540-580 nm und einem Emissionsspektrum von 600-660 nm 

verwendet. Die Belichtungszeit war in allen Fällen 500ms. Die Zellen konnten nur über einen 

sehr begrenzten Zeitraum verfolgt werden, weil die auftretenden Bleichungseffekte sonst zu 

stark waren. Von HT-1080-Zellen wurden Aufnahmen in einem Intervall von 10 Minuten, für 

HL-60 Zellen in einem Intervall von 2 Minuten aufgezeichnet. 

3.3.2. Diffusionsstudien 

Um die Entwicklung eines Stoffgradienten im µ-Slide Chemotaxis 3D untersuchen zu 

können, wurde mit fluoreszierenden Farbstoffen gearbeitet. 

Verwendet wurden dazu die Fluoreszenzfarbstoffe Alexa 488 (Invitrogen) und FITC-Dextran 

(Sigma-Aldrich). Das Molekulargewicht von Alexa entspricht mit 643 Da in etwa demjenigen 

von fMLP (437.55 Da), womit es stellvertretend für Chemotattraktant kleiner Molekülgröße 

betrachtet werden kann. 

FITC-Dextran soll mit einem Molekulargewicht von etwa 18 kDa stellvertretend für 

Experimente mit Chemoattraktant großer Molekülgröße verwendet werden. 

Um den Verlauf des Farbstoffgradienten über den Kanalquerschnitt unabhängig von 

gestreutem Licht und der Hintergrundfluoreszenz des umgebenden Materials zu gestalten, 

mussten dazu mikroskopische Verfahren gewählt werden, die es ermöglichen, ein horizontales 

Konzentrationsprofil durch einen Schnitt mit möglichst geringer z-Koordinate zu erstellen. 

3.3.2.1. Konfokale Laser Scanning Mikroskopie 

Die Konfokale Laser Scanning Mikroskopie ist eine besondere Form der von Marvin Minsky 

in den 1950er Jahren entwickelten Konfokal-Mikroskopie zur Anwendung mit 

Fluoreszierenden Proben. Die Besonderheit der konfokalen Mikroskopie liegt darin, dass im 

Gegensatz zu konventionellen Mikroskopen immer nur sehr kleiner Bereich des Präparats 



durch einen beugungsbegrenzten Lichtfleck beleuchtet wird. Das Gesamtbild wird durch 

Rasterscannung des Beobachtungsbereichs erzeugt. Durch die Verwendung eines Lasers als 

Lichtquelle, lässt sich kohärentes Licht einer definierten Wellenlänge erzeugen, dass genutzt 

wird, um fluoreszierende Partikel im untersuchten Medium anzuregen. Das Licht wird dabei 

über ein Objektiv in die Probe hineinfokussiert. Die Partikel im Bereich des Anregungsfokus 

werden zur Fluoreszenz angeregt und das emittierte Licht wird über dasselbe Objektiv 

zurückgeleitet und wird über eine Lochblende (pinhole) auf einen Detektor geführt. 

Anregendes und emittiertes Licht werden dabei über einen Strahlteiler aufgetrennt, so dass 

nur Emissionslicht auf den Detektor trifft. Anregungsfokus und Detektionsfokus liegen nach 

diesem Prinzip übereinander, also konfokal, woher sich auch der Name ableitet. 

In Abbildung 10 ist das Prinzip des Verfahrens schematisch dargestellt. 

Abbildung 10: Schematische Darstellung des konfokalen Prinzips. Bei der LSM wird als Lichtquelle ein 

Laser verwendet.[aus: Commons: Bilder zum Funktionsweise des konfokalen Prinzips, Stand September 

2011] 

Das Verfahren hat den Vorteil, dass vorwiegend Partikel angeregt werden, die im 

Anregungsfokus liegen. Licht von Partikeln außerhalb des Anregungsfokus wird nicht auf die 

Lochblende fokussiert, so dass ein Großteil davon vom Detektor nicht erfasst wird. Dadurch 

lässt sich eine sehr geringe Schärfentiefe erzielen, wodurch sich das Auflösungsvermögen in 

z-Richtung deutlich erhöht. So können relativ präzise Aussagen über die ortsabhängige 

Verteilung der Fluoreszenzintensität in einer Probe gewonnen werden. 

3.3.2.2. Fluoreszenz-Korrelations Spektroskopie 

Die Fluoreszenz-Korrelations Spektroskopie wurde in den 1970er Jahren von Watt W. Webb, 

Elliot Elson und Douglas Magde als Verfahren zur Messung von Diffusionskonstanten 



entwickelt. In einem sehr kleinen Volumen, meist realisiert durch ein konfokales Mikroskop, 

wird die Fluktuation der Fluoreszenzintensität gemessen. Durch Laserlicht werden dabei 

einzelne fluoreszierende Partikel, die in das Beobachtungsvolumen eindiffundieren angeregt. 

Als Detektoren werden hier heute zumeist Avalanche-Photodioden eingesetzt, mit denen es 

möglich ist, einzelne Photonen zu erfassen. Die Abtastrate der Detektoren liegt in der Regel 

deutlich unter der Zeit, welche die Partikel zum durchqueren des Beobachtungsvolumens 

benötigen, so dass Signale einzelner Partikel bei aufeinanderfolgenden Abtastvorgängen 

mehrfach erfasst werden. Die durch FCS generierten Daten erfassen dadurch die 

Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit. Die gemessenen Intensitäten sind zeitlich 

korreliert, woher sich auch der Name des Verfahrens ableitet. Um die Mehrfachdetektion 

einzelner Teilchen in die Funktion einzubeziehen, wird sie nach einer festgelegten Formel mit 

sich selbst korreliert, man spricht hier von sogenannter Autokorrelation. 

Gibt man der zugehörigen Software die Diffusionskonstante und den Strukturparameter der 

diffundierenden Partikel als bereits definierte Werte an, kann durch die Messung die absolute 

Fluoreszenzintensität am Messpunkt zum vorliegenden Zeitpunkt bestimmt werden. Über 

einen Proportionalitätsfaktor lässt sich daraus die Molarität der Lösung am Messpunkt 

berechnen. Im Gegensatz zur Laser Scanning Mikroskopie kann der Beobachtungsbereich 

durch die FCS nicht gerastert werden und die Messung erfolgt an einzelnen Punkten. Die 

Aussagekraft der FCS-Messungen bleibt allerdings auf einen bestimmten 

Konzentrationsbereich fluoreszierender Partikel beschränkt, weshalb der 

Konzentrationsbereich der verwendeten Farbstoffe vor Beginn der Experimente eingegrenzt 

werden muss. 

Für die unter Punkt 4.1.3 beschriebenen Versuche wurde die Farbstoffkonzentration anhand 

eines bestehenden Verdünnungsgraphen so festgelegt, dass sowohl die Lösung für die hohe 

Konzentration C100, wie auch die Lösung für die niedrige Konzentration C0 in einem 

Konzentrationsbereich liegen, in dem ein linearer Zusammenhang zwischen der Anzahl der 

Fluoreszenzsignale der FCS-Messung [N] und der Molarität der Lösung [M] angenommen 

werden kann. 



Abbildung 11 zeigt die verwendeten Verdünnungsgraphen, die durch Messungen an 

Verdünnungsreihen einzelner wichtiger Fluoreszenzfarbstoffe durch Mitarbeiter des 

Lehrstuhls für Biophysik von Herrn Prof. Dr. Joachim Rädler an der Ludwig Maximilians 

Universität München entstanden sind. 

Abbildung 11: Verdünnungsgraphen verschiedener Fluorophore. Der Bereich zwischen den beiden 

gestrichelten Linien deutet das Spektrum zwischen C0 [1nM] und C100 [50nM] des verwendeten 

Farbstoffes Alexa 488 an. [zur Verfügung gestellt vom Lehrstuhl für Biophysik, Dr. J. Raedler, LMU- 

München, 2011] 

Die Konzentration für C100 wurde auf 50nM festgelegt, die Konzentration für C0 auf 1nM, um 

eine klare Abhebung von der Autofluoreszenz der zur Verdünnung verwendeten PBS zu 

erhalten. Der lineare Verlauf des Verdünnungsgraphen für Alexa 488 für den Bereich 

zwischen den beiden verwendeten Konzentrationen ist in Abbildung 11 durch die 

gestrichelten roten Linien dargestellt. 



3.4. Verwendete Gelmatrizes 

3.4.1. Collagen 

Bei einem Großteil der in dieser Arbeit vorgestellten Chemotaxisexperimente wurde eine 

Matrix aus bovinem Typ I Collagen (Sigma-Aldrich) verwendet. Die Collagen-Lösung wurde 

in der kommerziell erhältlichen Form einer Stammlösung mit 3mg/ml bei 4°C gelagert. Für 

die Chemotaxis Experimente wurden Gele nach firmeneigenem Protokoll der Firma Ibidi 

gefertigt. Die vorgegebene Zusammensetzung ist so eingestellt, dass der pH-Wert der Lösung 

mit 7.4 bis 7.6 nahe dem physiologischen pH der verwendeten Zellen liegt. In den meisten 

Fällen wurde eine Gelmatrix mit 1.5mg/ml und DMEM für HT-1080 Zellen und 1.0 mg/ml 

und RPMI 1640/MEM für HL-60 Zellen verwendet. Eine vollständige Auflistung aller zum 

Einsatz gekommenen Gelzusammensetzungen findet sich in Anhang D. 

Nach dem Pipettieren der Bestandteile wurde die Lösung gründlich vermischt, damit es trotz 

der hohen Viskosität des Collagens zu einer gleichmäßigen Verteilung der Zellen in der 

Lösung kam. Anschließend wurden 6 µl der Collagen-Lösung in die Kanäle des µ-Slides 

Chemotaxis 3D eingefüllt und im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 für etwa 45 Minuten 

polymerisiert. Abschließend wurde die Regelmäßigkeit der Faserstruktur des Collagens unter 

dem Phasenkontrastmikroskop überprüft. 

3.4.2. Synthetische Hydrogele 

Die Möglichkeit zur Verwendung komplett synthetischer Matrizes in den µ-Slides 

Chemotaxis 3D wurde anhand von 2 kommerziell erhältlichen Hydrogelen überprüft. 

3D-Matrix der Firma Qgel: 

Bei der 3-D Matrix der Firma Qgel handelt es sich um ein PEG Gerüst, dessen 

zellphysiologische Eigenschaften aus vorgefertigten Sets an Zusatzkomponenten ausgewählt 

werden können. 

Getestet wurde eine PEG-Matrix mit RGD-Peptiden als Bindungsmotive und 

Quervernetzungen, die von MMP-Proteasen der Zellen abgebaut werden können. 

Eine Migration durch das Gel ist wegen einer Maschenweite im Nanometer-Bereich nur durch 

die Spaltung dieser Quervernetzungen möglich. 

Um Qgel in den µ-Slides nutzen zu können, wurde die, vom Hersteller angegebene 

Verdünnung „Soft IV“ verwendet, um eine vorzeitige Polymerisation der Matrix zu 



verhindern. Die Herstellung des Gels ist im Folgenden stichpunktartig beschrieben: 

- Mischen des lyophilisierten Pulvers mit 600µl des mitgeliefertern Buffer A. 

- Vortexen der Lösung für etwa 10 Sekunden. 

- Hinzufügen von 150 µl Zellsuspension mit einer Zellzahl von 1.5x10 7 /ml. 

- Vortexen für 10-15 Sekunden zur vollständigen Homogenisierung der Lösung. 

- Einfüllen von 6µl Gelsuspension in den Kanal des µ-Slide. 

- Polymerisation des Gels für 30-45 Minuten im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2. 

Die finale Zellkonzentration in den Kanälen betrug 3x10 6 Zellen/ml. Eine vollständige 

Tabelle zu den unterschiedlichen Verdünnungen und den mechanischen Eigenschaften des 

Gels findet sich in Anhang A auf Seite 95. 

Cellendes Maleimid-BSA 3D-Matrix: 

Das verwendete Hydrogel der Firma Cellendes ist eine Matrix aus BSA-Protein mit 

funktionellen Maleimid-Gruppen. 

Abbildung 12: Schematische Darstellung des BSA-Proteins mit funktionellen Maleimid-Gruppen 

[modifiziert aus: Cellendes – Hydrogel User Guide Version 3.0, 2011] 

In der untersuchten Ausführung wurden diese Maleimid-Gruppen mit Thiol-Gruppen eines 

Polyethylen-glycol Proteinkomplexes quervernetzt. Der Proteinkomplex enthält eine Sequenz, 

welche die Zellen bei der Migration durch MMP-Proteasen spalten können. 

Abbildung 13: Schematische Darstellung des PEG-Crosslinkers mit funktionellen Thiol-Gruppen und 

spaltbarer Peptidsequenz. [Cellendes – Hydrogel User Guide Version 3.0, 2011] 



Um den Zellen die notwenigen Bindungsmotive zu liefern, wurde den Gelen RGD-Peptid in 

einer Konzentration von 0.1mM bis 1mM beigemischt. Die Polymerisationszeit des Gele lag 

im Bereich weniger Minuten, weswegen zur Verwendung in den µ-Slides immer mit der 

niedrigsten verfügbaren Konzentration von 2.5mg/ml Maleimid-BSA gearbeitet wurde. Die 

Polymerisationszeit des Gels war außerdem abhängig vom pH-Wert der Lösung. Vom 

Hersteller wurden aus diesem Grund zwei Puffer mit den pH-Werten 5.5 und 7.4 mitgeliefert. 

Obwohl damit eine leichte Abweichung vom physiologischen pH-Wert der Zellen eintrat, 

wurde für die vorgestellten Versuche immer bei einem pH-Wert von 5.5 gepuffert, um die 

Polymerisationszeit zu verlängern. 

Aus den Pipettierschemata des Herstellers, in denen dieser Fall nicht beschrieben war, wurden 

die Mengenangaben für Gele der höchsten Verdünnung unter Verwendung von RGD-Peptid 

errechnet. Die Zusammensetzung ist für eine RGD-Konzentration von 1mM im Folgenden 

beispielhaft dargestellt. 

Maleimid-BSA 2.5mg/ml mit 1mM RGD-Peptid 

Wasser 6.25µl 

10xCBpH5.5 2.5µl 

Maleimid-BSA 2.5µl 

RGD-Peptid (3mM) 10µl 

Zellsuspension 5.0µl 

CD-Link 3.75µl 

Total 30µl 

Um mehrere Kanäle befüllen zu können, wurde die Lösung vor Hinzufügen des CD-Link 

gleichmäßig aufgeteilt und einzeln fertiggestellt. Nach Einfüllen des CD-Link wurde die 

Lösung mit der verwendeten Pipettenspitze schnell durchmischt und unmittelbar danach in 

die Kanäle des µ-Slides eingefüllt. Nach etwa 5-10 Minuten im Brutschrank bei 37°C und 5% 

CO2 waren die Gele bereits vollständig polymerisiert. Die vollständigen Verdünnungstabellen 

des Herstellers sind in Anhang B und C auf den Seiten 95 und 96 zu finden. 



3.5. Chemotaxis mit HL-60 und HT-1080 

3.5.1. Durchführung der Experimente 

Zur Chemotaxis-Analyse wurden 6 µl der jeweiligen Zellen in einer Gelmatrix in die Kanäle 

des µ-Slides Chemotaxis 3D gefüllt. Nach der Polymerisationszeit des Gels wurde 

Chemoattraktant in die Reservoire der Slides gefüllt. Das genaue Vorgehen bei dem Befüllen 

der Slides ist in Anhang E auf Seite 97 beschrieben. Das Befüllschema war hier jeweils 

abhängig davon, welche Parameter bei dem Experiment untersucht wurden. 

Zur Ermittlung der notwendigen Konzentration an Chemoattaktand wurden die linken 

Reservoire der Kammern mit einer steigenden Chemoattraktand Konzentration befüllt. Die 

Aufteilung der verschiedenen Chemoattraktant-Konzentrationen ist in Abbildung 14 

schematisch dargestellt. 

Abbildung 14: Schematische Darstellung der Verteilung der Chemoattraktant Konzentrationen auf die 

Kammern des µ-Slides Chemotaxis 3D zur Ermittlung der einzusetzenden Dosis. 

Um bei einer festgelegten Konzentration von Chemoattraktant die Chemotaxis-Analyse gegen 

zufällig auftretende Effekte abzusichern, wurde ein Vergleich mit einer Positiv- und einer 

Negativkontrolle durchgeführt. Die Positivkontrolle beinhaltet die Verwendung einer Lösung 

mit hoher Konzentration an Chemoattraktant in beiden Reservoirs. Die Negativkontrolle wird 

mit chemoattraktant-freiem Medium in beiden Reservoirs durchgeführt. 



Das Füllschema der Slides für Experimente mit Positiv- und Negativkontrolle ist in 

Abbildung 15 dargestellt. 

Abbildung 15: Schematische Darstellung der Verteilung der Chemoattraktand-Konzentrationen für 

Chemotaxis Versuche mit Kontrollexperimenten. 

Für HT-1080 Zellen wurde bei der Zusammenstellung der Gele für das Chemotaxis- 

Experiment und die Negativkontrolle DMEM ohne FCS verwendet. Die Positiv-Kontrolle 

enthielt DMEM mit 60% FCS, um nach einer Verdünnung im Rahmen des, in Anhang D 

gezeigten Pipettierschemas, auch im Kanalbereich an eine finale Konzentration von 10% FCS 

zu erhalten. 

Die verwendete Gelmatrix schließt Konvektionsströmungen zwischen den Reservoirs aus. 

Dadurch kann unmittelbar nach Aushärten des Gels ein Reservoir mit Chemoattraktant gefüllt 

werden ohne dass es zu Vermischung im Kanalbereich kommt. Dieses Vorgehen wird als „fast 

Method“ bezeichnet. 

In einem Großteil der beschriebenen Versuche wurden jedoch zuerst beide Reservoirs mit 

60µl des Hungermediums C0 gefüllt. Anschließend wurden 30µl einer Chemoattraktant- 

Lösung mit doppelter Konzentration auf einen der beiden Einfüllstutzen des linken Reservoirs 

pipettiert. Durch Absaugen von 30µl Flüssigkeit aus dem anderen Stutzen mit einer 

Pipettenspitze wurde das Chemoattraktant in das Reservoir gesaugt. Der Gradient sollte so 

schonender und mit geringer zeitlicher Verzögerung etabliert werden. Das Vorgehen nach 

dieser Methode wird als „slow method“ bezeichnet. Ausführliche Beschreibungen der beiden 

Methoden finden sich in Anhang E, auf Seite 82f. 

Um die Bedingungen für die Zellen während der Experimente möglichst optimal zu halten, 

wurden die Slides während der Laufzeit des Experimentes unter dem Mikroskop in eine, von 

der Firma Ibidi eigens dafür entwickelte Heizplatte mit ebenfalls beheizbarer Abdeckhaube 

gelegt. Die Temperatur der Bodenplatte war auf 41.5°C die Temperatur der Abdeckhaube auf 

43.5°C eingestellt, was einer Temperatur der Atmosphäre innerhalb dieser Kammer von etwa 



37°C entsprach. Durch einen Gasmischer kombiniert mit einem System zur Erhöhung der 

Luftfeuchte, wurde Luft mit 5% CO2 in die Heizkammern geleitet. Die Bilddaten wurden auf 

dem unter 3.3.1.1. beschriebenen Phasenkontrastmikroskop generiert. 

Zur genauen Positionierung der Kammern und um Daten für Experimente in mehreren 

Kammern parallel erzeugen zu können, wurde ein software-gesteuerter automatischer Tisch 

mit programmierbarer Positionsliste genutzt. Die Zeitrafferaufnahmen wurden unter 

Verwendung der, auf dem Programm ImageJ basierenden Software, Micromanager Version 

1.4 erzeugt. Für HT-1080 Zellen war der Beobachtungszeitraum in der Regel über 24 

Stunden, bei einem Aufnahmeintervall von 10 Minuten. HL-60 Zellen wurden 3 Stunden lang 

bei einem Aufnahmeintervall von 1 Minute beobachtet. 

3.5.2. Auswertung und Datenanalyse 

Zell-Tracking 

Die Bilddaten aus den Versuchen wurden mit dem Manual-Tracking Plugin des Programms 

ImageJ ausgewertet. Dazu wurde die Bilderserie des Experiments in den Zwischenspeicher 

des Programms geladen. Bei Verwendung des Manual-Tracking Plugin wurden für jedes Bild 

nacheinander die Zentren der einzelnen Zellen mit dem Cursor markiert, so dass die Software 

nach Abschluss einer Bilderserie daraus die Spur der Zellbewegungen darstellen konnte. 

Das Ergebnis des Manual Tracking ist in Abbildung 16 beispielhaft dargestellt. 

Abbildung 16: Vergleich der Phasenkontrastbilder unmittelbar nach Start des Experiments und nach 50 

Minuten mit farbig markierten Zellspuren. 


4. Ergebnisse 


4.1. Errichtung und Messung von definierten Konzentrationsprofilen 

im µ-Slide Chemotaxis 3D. 

Die Aussagekraft von Zellmigrationsdaten ist stark von der Entwicklung des zur Verfügung 

stehenden Lockstoffgradienten abhängig. Die Untersuchung der zeitlichen Veränderung des 

Gradienten beziehungsweise dessen Langzeitstabilität ist daher von maßgeblicher Bedeutung. 

Anhand einer Versuchsreihe soll untersucht werden, ob sich das Diffusionsprofil im µ-Slide 

Chemotaxis unabhängig von der Größe der diffundierenden Partikel sowie dem 

Vernetzungsgrad der verwendeten Matrix verhält. Die Ermittlung des Konzentrationsprofils 

wurde durch ortsabhängige Integration und graphische Aufbereitung der Fluoreszenz-Signale 

realisiert. 

4.1.1. Untersuchung von Sonden-Matrix Interaktionen 

Bevor Untersuchungen an den Diffusionsprofilen durchgeführt wurden, wurden die 

verwendeten Farbstoffe auf mögliche Wechselwirkungen mit den verwendeten Collagen 

Matrizes und dem Kunststoff der Slides geprüft. Auf diese Weise sollte ausgeschlossen 

werden, dass andere Faktoren als eine physische Diffusionsbarriere in Form der 

Strukturfasern der verwendeten Gelmatrix eine Einschränkung der Diffusion bewirken 

können. Zu diesem Zweck wurde untersucht, ob sich die verwendeten Fluoreszenz-Sonden, 

nach Eindiffusion in Collagen-Matrizes unterschiedlicher Vernetzungsgrade, wieder 

rückstandslos aus den Gelen waschen lassen. 

Im Folgenden werden Durchführung und Ergebnisse dieses Vorexperimentes kurz 

beschrieben. 

Für den Versuch wurden Collagen-Gele der Stärken 0,5mg/ml, 1mg/ml und 1,5mg/ml nach 

dem unter Punkt 3.4.1. beschriebenen Pipettierschema hergestellt und in Angiogenese-Slides 

der Firma Ibidi gefüllt. Die Gele wurden in die, in den Boden der Probenkammern des 

Angiogeneseslides eingebetteten 10µl Reservoirs eingebracht. Zur Polymerisation des 

Collagens wurden die Gele etwa 15 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubiert und 

anschließend mit 50µl PBS in den darüber liegenden Reservoiren überschichtet, um ein 

Austrocknen der Matrix zu vermeiden. 

4. Ergebnisse 36


Zur vollständigen Vernetzung des Collagens wurden die Slides anschließend wieder für 30 

Minuten in den Inkubator gestellt. 

Die auszuwertenden Bilddaten wurden mit dem EVOS fl. Fluoreszenz-Mikroskop der Firma 

AMG generiert. Die Wellenlänge des anregenden Lichts betrug 470nm, die des detektierten 

emittierten Lichts 525nm. Als Referenzwert für die anschließenden Messungen wurde die 

Hintergrundfluoreszenz des Collagen-Gels festgelegt. Zur Bestimmung der 

Hintergrundfluoreszenz wurde die Detektionszeit und die Intensität des anregenden Lichtes 

variiert bis unter dem integrierten Fluorit-Objektiv (10x/0.3) ein deutlicher Unterschied der 

Emissionsintensität zwischen der Messung im Collagen-Gel und einer Referenzmessung in 

einem leeren Reservoir erkennbar war. Die Werte betrugen im untersuchten Fall 500ms 

Belichtungszeit bei 50% der, zur Verfügung stehenden Anregungsintensität des Mikroskops. 

Über Verdünnungsreihen der beiden verwendeten Fluoreszenz-Farbstoffe wurden diejenigen 

Konzentrationen ermittelt, bei denen die, als 8-bit Grauwert auf einer Skala von 0 (Schwarz) 

bis 255 (Weiß) dargestellte Emissionsintensität etwa im mittleren Bereich lag. 

Für FiTC-Dextran ergab sich in Folge dessen eine Konzentration von 1µg/ml, für Alexa 488 

wurde eine 100nM Lösung gewählt. 

4. Ergebnisse 37


Die Entwicklung der Fluoreszenzfarbstoffkonzentration im Gel wurde im Anschluss an die 

Referenzmessung in 3 Schritten bestimmt: 

1.Schritt: Überschichten der Gele mit Fluoreszenz-Farbstoff und anschließender 

30-minütiger Diffusionszeit. 

2.Schritt: Erste Messung unmittelbar nach Austausch der Farbstofflösung mit PBS. 

3.Schritt: Drei weitere Messungen nach jeweils 15-minütiger Diffusionszeit und 

Austausch des PBS. 

Abbildung 17: Schematische Darstellung der Versuchsdurchführung in einer Kammer des 

Angiogeneseslide. Die schwarzen Pfeile deuten die Farbstoffdiffusion in das und aus dem Gel (brauner 

Bereich) an. 

Durch den Austausch lediglich der überschichteten Flüssigkeit kann der Farbstoff nur durch 

erneute Diffusion wieder aus dem Gel gelöst werden. Ein Auslösen oder Ausbrechen von 

gebundenen Molekülen durch mechanische Scherkräfte oder Konvektionsströme kann somit 

ausgeschlossen werden. 

Die Fokusebene wurde anhand der Bilddarstellung im Phasenkontrast so positioniert, dass die 

Struktur der Collagenfasern zu erkennen war. Auf diese Weise wurde sichergestellt, dass die 

Messungen der Fluoreszenzintensität innerhalb der Gelmatrix durchgeführt wurden. Die 

Grauwerte der gemessenen Bilder wurden über das jeweilige Gesamtbild gemittelt und 

tabellarisch aufgetragen. 

4. Ergebnisse 38


Abbildung 18 zeigt, dass die gemessene Intensität nach drei Waschvorgängen für alle 

Gelkonzentrationen wieder auf, beziehungsweise teilweise sogar leicht unter der 

Hintergrundfluoreszenz des Collagens liegt. 

Die Form der beiden Graphen legt nahe, dass auch die Größe der verwendeten Sonde dabei 

keine Rolle spielt. 

Abbildung 18: Verlauf der gemessenen Fluoreszenz-Intensität während der Versuche für (A) Alexa 488 

und (B) FiTC-Dextran in Collagen Matrizes unterschiedlicher Stärke. Die Messungen wurden immer 

unmittelbar vor den Waschvorgängen durchgeführt. 

Auf Grundlage der vorliegenden Messergebnisse wurde in den folgenden Versuchen davon 

ausgegangen, dass es zu keinen Interaktionen zwischen der Matrix und dem verwendeten 

Farbstoffen kommt. 

4. Ergebnisse 39


4.1.2. LSM - Messungen mit Alexa 488 und FITC-Dextran 

Bestimmung des Messprinzips: 

Um das Profil und die Stabilität eines Stoffgradienten im µ-Slide Chemotaxis 3D zu 

untersuchen, wurden definierte Konzentrationen der Fluoreszenzfarbstoffe Alexa 488 

(stellvertretend für kleine Chemotaxine) und FiTC-Dextran (stellvertretend für große 

Chemotaxine) in die Reservoire eines Chemotaxis 3D-Slides eingebracht und die 

Konzentrationsentwicklung über den Kanalbereich in x-Richtung durch Messungen der 

Fluoreszenzintensität ermittelt. 

Der quadratische Bildausschnitt der Laser Scanning Mikroskops hatte mit dem verwendeten 

Apochromat 63x/1.4 Öl - Objektiv näherungsweise eine Seitenlänge von 146,25µm. Um den 

Kanal in seinem vollen Durchmesser von 1mm vermessen zu können, und zudem noch Werte 

für die Grenzregionen zu beiden Reservoire zu erhalten wurden 15 Bildausschnitte in x- 

Richtung aufgenommen und anschließend zusammengefügt. Durch die „tile scan“ Funktion 

der Software funktioniert das Verfahren des Tisches in passenden Schritten und das 

Zusammenfügen des Gesamtbildes automatisch. Dabei wird von einem festgelegten 

Mittelpunkt in gleichem Abstand in negativer wie positiver Richtung der jeweiligen 

Koordinatenachsen gemessen. Um die Statistik der Messung etwas zu erhöhen wurden in y- 

Richtung ebenfalls 2 Bildausschnitte aufgenommen. Die Größe des Gesamtbildes einer 

gemessenen Bilderserie ergab sich somit zu etwa 2193,73µm x 292,5 µm. 

Um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu den unterschiedlichen Zeiten zu gewährleisten 

wurde die Bilderreihe auf die Kanalmitte in x-Richtung und die fertigungsbedingte Fließlinie 

des Plastiks, die die Mitte des Kanals in y-Richtung markiert, zentriert. Obwohl das Laser 

Scanning Mikroskop bei dem verwendeten Pinhole-Durchmesser von 117 Å eine optische 

Schnittdicke von ~ 1µm ermöglicht, kommt es dennoch zu störenden Streueffekten von 

benachbarten fluoreszierenden Partikeln. Die Menge an unter- beziehungsweise 

übergelagerten Fluoreszenz-Partikeln ist abhängig von der z-Position der Betrachtungsebene. 

Um den durch Streueffekte entstehenden Messfehler einheitlich zu gestalten und die 

Vergleichbarkeit der zeitlich varianten Messungen zu gewährleisten, wurde die optische 

Schnittebene für alle gemessenen Proben 20µm unterhalb der oberen Grenzfläche des Kanals 

festgelegt. An der Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit im Kanal des Slides und dem darüber 

liegenden Kunststoff tritt ein Sprung im Brechungsindex auf. Der resultierende Unterschied 

im Interferenzmuster kann detektiert und visualisiert werden. Durch eine entsprechende 

4. Ergebnisse 40


Veränderung der z-Koordinate kann die Betrachtungsebene auf die Grenzfläche zwischen den 

Materialien eingestellt werden. Ein programmierbarer definierter Schritt von 20 µm in den 

Innenbereich des Kanals stellt, bei einer Gesamthöhe des Kanals von 70 µm, die Lage der 

Messebene im mittleren Kanalbereich sicher. 

Abbildung 19: Lage der konfokalen Schnittebene in einer Kammer der Chemotaxis 3D µ-Slide. Im 

Querschnitt des Kanals ist die Platzierung der Gelmatrix (braune Struktur) angedeutet. 

C100 steht stellvertretend für eine hohe Konzentration an Fluoreszenzfarbstoff, C0 für eine geringe. 

Die Konzentration der Fluoreszenz-Farbstoffe wurde nach Anhaltspunkten bestimmt wie im 

Vorexperiment unter 4.1.1. beschrieben. Die Grauwertdarstellung der Fluoreszenzintensität 

sollte möglichst wenige unter- beziehungsweise überbelichtete Pixel enthalten, um einen 

Informationsverlust zu vermeiden. Für FITC-Dextran wurde C100 auf 0.1mg/ml und C0 auf 

0.01mg/ml festgelegt. Alexa 488 wurde unter C100 auf 1µM verdünnt und unter C0 

entsprechend auf 0.1µM. 

Die Proben wurden mit kohärentem Licht von 488nm Wellenlänge aus einem Argon/2 Laser 

mit 25% Output einer Maximalleistung von 30mW und einem Tube Current von 4.9 A 

angeregt. Der Lichtquelle war ein Transmissionsfilter mit 50% Durchgang nachgestellt. Nach 

Anregung des Farbstoffes wurde das emittierte Licht durch einen Emissionsfilter auf 505nm 

Wellenlänge gefiltert und anschließend detektiert. Das Bildfeld wurde mit einer Pixelzeit von 

6.4µs zeilenweise 2-fach abgetastet. Einem Gesamtprofil von 30 Bildern steht mit den 

Fahrzeiten des automatischen Tisches ein Zeitaufwand von etwa 4 Minuten entgegen. Wird 

der Wechsel des Slides und die nachfolgende Kalibrierung der Messposition beaufschlagt, 

ergibt sich eine Zeitauflösung von etwa 15 Minuten für parallele Messungen in mehreren 

Slides. 

4. Ergebnisse 41


Ein Beispiel für die gewonnenen Rohdaten und einen von ImageJ daraus erstellten Plot des 

Intensitätsverlaufes ist in Abbildung 20 gezeigt. 

Abbildung 20: (A) Bilddaten einer LSM-Profilmessung bestehend aus 15*2 Einzelbildern und (B) 

zugehöriges Intensitätsprofil. Das Wellenmuster entsteht durch die Beugung des Lichts am Pinhole. 

Um das in Abbildung 20 erkennbare Wellenmuster auszugleichen wurde im Anschluss an die 

Messungen durch die Mittelwert-Funktion in ImageJ der durchschnittliche Grauwert der 

beiden in y-Richtung übereinanderliegenden Bildsegmente bestimmt, für jedes der 15 

Segmente in x-Richtung tabellarisch aufgetragen und graphisch als Funktion von Grauwert 

und x-Position relativ zur Kanalmitte dargestellt. 

4. Ergebnisse 42


In Abbildung 21 ist das Messprinzip zusammengefasst schematisch dargestellt. 

Abbildung 21: Schematische Darstellung der Datenanalyse durch LSM-Messungen. Die kurz-gestrichelten 

Linien deuten die Dimension des Mittelkanals an. Die einzelnen Graphen bezeichnen den Verlauf des 

Gradienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten an einer festgelegten Messposition. Ref. low und Ref. high 

stellen Referenzmessungen in Kammern mit C100 und C0 dar. In der Grafik dargestellt sind beispielhaft die 

Messdaten des Alexa 488 Farbstoffes in einem 1.0mg/ml Collagen-Gel. (vgl. Abb.22 auf Seite 44) 

4. Ergebnisse 43

Messergebnisse: 


Für beide vewendeten Farbstoffe wurden Messungen mit einer Collagenmatrix von 1,5mg/ml 

und 1,0 mg/ml sowie ohne Gelmatrix durchgeführt. 

Die Ergebnisse der Messungen sind in Abbildung 21 dargestellt: 

Abbildung 22: Konzentrationsprofile der Farbstoffe Alexa 488 in (A) 0mg/ml, (B) 1.0mg/ml, (C) 1.5mg/ml 

und FITC-Dextran in (D) 0mg/ml, (E) 1.0mg/ml und (F) 1.5mg/ml CollagenI – Matrix. 

4. Ergebnisse 44


Für jeden der beiden Farbstoffe wurde jeweils nur eine Referenzmessung zu C100 

beziehungsweise C0 durchgeführt. Durch Pipettierungenauigkeit und eine leicht variable 

Messposition in den jeweiligen Slides ist die Aussagekraft der Referenzlösung allerdings auf 

die Kammer beschränkt in welcher die zugehörige Messung unternommen wurde. Es hätten 

Referenzmessungen für jeden Slide und für jede seiner 3 Kammern durchgeführt werden 

müssen. Aussagen über den Zeitraum der Etablierung wie über den genauen Ablauf konnten 

deshalb mit dieser Methode nur ungenau und qualitativ getroffen werden. 

Erkennbar ist, dass sich die Konzentrationsprofile ausgehend von der 2-Stunden Messung im 

Beobachtungsbereich weitestgehend linear verlaufen. Unterschiede zwischen den 

unterschiedlichen Ansätzen sind kaum vorhanden. Das zeigt sich auch an der Analyse der 

Entwicklung des Gradienten über die Zeit. 

Die in Abbildung 23 gezeigten Werte wurden über eine Anpassung der Steigung der 

Konzentrationsprofile aus Abbildung 22 im linear abfallenden Bereich zwischen -500µm und 

+500µm von der Kanalmitte ermittelt. 

Abbildung 23: Die Gradienten von (A) Alexa 488 und (B) FiTC-Dextran aufgetragen über die Zeit von 0- 

36h. 

Nach anfänglichem steilem Anstieg und einem leichten „Einschwingen“ bleiben die 

4. Ergebnisse 45


Gradienten nahezu konstant. Auch die Analyse des Gradienten zeigt einen, im Rahmen des 

Messfehlers vergleichbaren Verlauf der Ansätze unterschiedlicher Gelkonzentration. 

Um detaillierte Informationen über Etablierung und Verlauf des Gradienten zu erhalten 

wurden auf ein anderes Verfahren mit geringerer Fehleranfälligkeit zurückgegriffen das 

bezüglich der notwenigen Referenzmessungen einfacher zu handhaben ist und dadurch auch 

eine höhere Zeitauflösung erlaubt. 

4.1.3. FCS-Messungen 

Durch die Fluoreszenz-Korrelations Spektroskopie (FCS) lassen sich die Fluoreszenzsignale 

einzelner fluoreszierender Moleküle an Messpunkten mit ~ 1 µm Schichtdicke bestimmen. 

Durch die Integration der Signale in Abhängigkeit von der Diffusionszeit, die bestimmt, wie 

lange einzelne Moleküle im Durchschnitt im Beobachtungsfenster der laufenden Messung 

verbleiben, lässt sich eine sehr präzise Aussage über die Konzentration eines fluoreszierenden 

Stoffes an einem bestimmten Punkt im Untersuchungsbereich formulieren. Die Messungen 

sollen bei minimaler Fehleranfälligkeit detailliert Auskunft über den zeitlichen Verlauf und 

die Etablierung des Gradienten geben. 

Bestimmung des Messprinzips: 

Der verwendete Farbstoff war in allem Ansätzen Alexa 488 mit den in Punkt 3.3.2.2. 

beschriebenen Konzentrationen. 

Den folgenden Messungen von Konzentrationsprofilen wurde ein eigens erstellter 

Verdünnungsgraph zugrunde gelegt, um für Messkurven und Kalibrierungswerte gleiche 

Voraussetzungen bezüglich eventuell auftretender Messfehler oder Alterungsprozesse des 

Fluoreszenzfarbstoffes zu schaffen. Dafür wurde der Konzentrationsgradient zwischen C100 

und C0 in 11 Stufen zu Schritten von je 5nM Konzentrationsunterschied unterteilt. Alle 

Verdünnungen wurden aus der Stammlösung zu C100 erstellt und in eine Kammer eines 

Chemotaxis 3D µ-Slides gefüllt. Gemessen wurde in der Kanalmitte bei einer z-Verschiebung 

von 35µm relativ zur Kanaldecke. 

4. Ergebnisse 46


Abbildung 24: Verdünnungsgraph für Alexa 488 zwischen C0 und C100 der eingesetzten 

Konzentrationen. Aufgetragen sind die eingesetzte Molarität gegen die Anzahl der gemessenen 

Fluoreszenz Signale. 

Der in Abbildung 24 dargestellte Verdünnungsgraph zeigt im Bereich des gesamten 

verwendeten Konzentrationsspektrums einen linearen Zusammenhang zwischen dem 

gemessenen FCS-Signal und der eingesetzten Molarität. Der ebenfalls linear ansteigende 

Fehleraufschlag resultiert aus dem erzwungenen Nulldurchgang des Graphen, der 

Abweichung in der zugrunde gelegten Steigung auslöst. Auf Grundlage dieser Messungen 

wird im Folgenden aus den FCS-Messwerten auf die Molarität der Lösung in Abhängigkeit 

der x-Position im Slide geschlossen. 

Für alle unternommenen Messungen wurden 5% Maximaloutput des unter 4.1.2. 

beschriebenen Argon/2 Lasers mit einer Wellenlänge von 488 nm verwendet. Als 

Fixparameter wurden eine Diffusionszeit von 46µs und ein Struktur-Parameter von 10.2 

angenommen. Der verwendete Einstellungsparameter Datensatz „AC-Standard_488 BP 505- 

550“ enthielt als Vorgabe außerdem einen Emissionsfilter für Wellenlängen zwischen 505 und 

550 nm. Analog zu den LSM-Messungen wurde die Messebene wieder anhand des 

Unterschiedes im Brechungsindex zwischen Flüssigkeit im Slide und der Kunststoffschicht 

darüber ermittelt. Der definierte Schritt in z-Richtung betrug 35µm in den Innenraum des 

Kanalbereiches, so dass sich die Messebene in etwa in der Mitte des 70µm hohen Kanals 

4. Ergebnisse 47


befand. Obwohl für die FCS-Messungen nur Signale einzelnen Moleküle integriert werden 

und die punktförmigen Messungen mit ihrer geringen Schichtdicke kaum anfällig für 

Störgrößen sind, spielt eine standardisierteGeben Sie hier eine Formel ein. und 

reproduzierbare Messposition eine wichtige Rolle. Durch auftretende physikalische Druck- 

oder Temperaturunterschiede der Lösungen während des Einfüllens oder nach dem Verschluss 

der Stöpsel kann es zu Konvektionseinflüssen kommen. Einflüsse durch lokale 

Konzentrationsverschiebungen in y- oder z-Richtung wurden durch die festgelegte 

Messposition ausgeschlossen. 

Die y-Position der Messpunkte wurde erneut auf die Fließlinie des Plastiks gelegt, die in der 

Draufsicht die horizontale Mitte des Kanals darstellt. In x-Richtung wurden die Messpunkte 

ausgehend von der Kanalmitte festgelegt, die bei einer Kanalbreite von 1mm durch einen 

definierten 500µm-Schritt vom rechten Rand bestimmt wurde. 

Gemessen wurde an Punkten 7 verschiedener x-Koordinaten von +/- 1000, +/-500 und +/-250 

µm Entfernung, sowie am Kanalmittelpunkt, wie in Abbildung 25 dargestellt. 

Abbildung 25: Positionierung der FCS – Messpunkte in einer Kammer des µ-Slide. Innerhalb des 

vergrößerten Ausschnittes ist eine Bilderserie zu sehen, die aus 7 x 2 Einzelbildern einer LSM-Messung 

besteht und die Fließlinie des Plastiks in der horizontalen Kanalmitte zeigt. (horizontaler Streifen). Die 

äußeren Bilder zeigen den Grenzverlauf zwischen dem Kanal (heller Bereich) und den angrenzenden 

Reservoirs (dunkler Bereich). Die roten Querstriche deuten die Position der Messpunkte an. 

4. Ergebnisse 48

Messergebnisse: 


Zur Untersuchung der Einflussnahme einer verwendeten Gelmatrix, wurden die Messungen 

unter standardisierten Bedingungen für eine im Chemotaxis 3D µ-Slide eingebettete Matrix 

mit 1.5mg/ml Collagen beziehungsweise einem 2.5mg/ml Maleimid-Polymer der Firma 

Cellendes, sowie ohne Gelmatrix durchgeführt. Die Ergebnisse der Messungen sind in 

Abbildung 26 dargestellt. 

Abbildung 26: Graphen der FCS-Messungen für die Ansätze (A) ohne Gel, (B) mit 1,5mg/ml Collagen I 

und (C) 2,5mg/ml Maleimid-BSA Matrix der Firma Cellendes über einen Zeitrahmen von 15 min bis 48h. 

4. Ergebnisse 49


Verlauf über. Nach 24 Stunden ist ein Rückgang des Gradienten in Folge des 

Konzentrationsausgleichs zu beobachten. Trotz leichter Unterschiede in der Steigung der 

Graphen innerhalb der ersten Stunden, gleicht sich der Verlauf der Gradienten über den 

gesamten Zeitraum zu beobachten. 

4. Ergebnisse 51


4.2. Zellkultur und Migration im Chemotaxis 3D µ-Slide 

4.2.1. HT-1080 Zellen in Gelmatrizes 

HT-1080 Zellen wurden schon erfolgreich zur Gewinnung von 2-dimensionalen 

Migrationsdaten langsam migrierender Zellen in µ-Slides eingesetzt. Im Folgenden soll 

gezeigt werden, dass sie sich ebenfalls zur Gewinnung von 3D-Migrationsdaten im 

Chemotaxis 3D µ-Slide eignen und ein Vergleich zwischen den vorhandenen 2D-Daten dem 

neu erstellten 3D-Datensatz durchgeführt werden. Anschließend soll untersucht werden, ob 

sich hochvernetzte synthetische Gelmatrizes zur Verwendung mit HT-1080 Zellen eignen. 

4.2.1.1. Chemotaxis in Collagen I Matrizes: 

Für die Versuche mit Matrizes aus bovinem Collagen I wurden HT-1080 Zellen vom Wildtyp 

zwischen der 30. und 50. Passage verwendet. Die verwendete Matrix enthielt 1,5mg/ml 

Collagen und wurde nach dem unter Punkt 3.4.1. beschriebenen Standard-Protokoll erstellt. 

Die Zellen wurden zu einer finalen Konzentration von 3x10 6 der Collagen Lösung 

beigemischt und wie in Punkt 3.5.1 beschrieben in die Mittelkanäle der Slides gefüllt. 

Während der etwa 45-Minütigen Polymerisationszeit des Collagens wurden die Slides in 10 

Minütigen Intervallen um 180° um die x-Achse gedreht, um ein Absinken der Zellen auf den 

Kanalboden und dadurch die Adhäsion der Zellen an feste Oberflächen zu vermeiden. 

Adhärente Zellen bewegen sich nur entlang einer Oberfläche und erlauben keine Aussage 

über Zellmigration durch Gelmatrizes. 

Nach dem Aushärten der Gelmatrix wurde dem linken Reservoir des Chemotaxis 3D-Slides 

DMEM mit 10% Foetalem Kälber Serum (FCS) als Chemoattraktant hinzugefügt. Das rechte 

Reservoir wurde als Referenz genutzt und mit DMEM ohne FCS gefüllt (+/-). Um die 

Signifikanz des Versuches zu erhöhen, wurden die beiden anderen Kammern der jeweiligen 

Slides ebenfalls mit Zellen in einer Gelmatrix gefüllt. 

Die Reservoirs einer Kammer wurden hier als sogenannte Positivkontrolle auf beiden Seiten 

mit DMEM gefüllt, dass 10% FCS enthielt (+/+). Die Reservoirs der verbleibenden Kammer 

enthielten als Negativkontrolle entsprechend nur DMEM (-/-). 

4. Ergebnisse 52


Anschließend wurden die Zellen unter einem Nikon Eclipse Ti Phasenkontrastmikroskop in 

einer Zeitraffer Aufnahme für 24 Stunden aufgezeichnet. Die Aufnahmen wurden wie unter 

Punkt 3.5.2. beschrieben ausgewertet. Abbildung 28 zeigt beispielhaft den 

Chemotaxisversuch (+/-), sowie die Positiv (+/+) und Negativkontrolle (-/-) eines 

Experiments. 

Abbildung 28: Mit dem Chemotaxis and Migration Tool erstellter Plot der Zellbewegungen des 

Chemotaxis-Experiments (A), der negativ-Kontrolle (B) und der positiv-Kontrolle (C). 

Zellen deren Position sich im Vergleich zur Ausgangsposition nach links verlagert hat sind grün 

eingefärbt, Zellen die nach rechts gewandert sind rot. 

4. Ergebnisse 53


Dabei wurden nur Zellen berücksichtigt, deren längliche, kompaktere Morphologie ohne 

sichtbaren Adhäsionsfilm auf eine Bewegung durch das Gel und nicht entlang der Oberfläche 

hindeutete. Aus den in Abbildung 28 dargestellten Migrationsmustern lässt sich für das 

Chemotaxis-Experiment (+/-) im Vergleich zu den Kontrollexperimenten schon eine starke 

linksgerichtete Tendenz der Zellbewegung erkennen. Aus den gemessenen Daten wurden im 

Chemotaxis und Migration Tool der Firma Ibidi rechnerisch einige Parameter ermittelt, die 

eine genauere Abschätzung erlauben, in wie weit es sich bei dem aufgetretenen 

Bewegungsmuster um Chemotaxis handelt. 

Tabelle 1 zeigt einen Auszug der Wertetabelle zu dem in Abbildung 28 dargestellten 

Chemotaxis Versuch. Die Beschreibung der Parameter findet sich unter Punkt 3.5.2. 

Konz. Chemoattraktant p-Value x-FMI Y-FMI Directionality Velocity [µm/min] Tracks 

10 % FCS 2,1079*10 -8 -0,3384 0,058 0.3947 0,455 29 

Tabelle 1: Auszug der gemessenen Chemotaxis Parameter des in Abbildung 29 dargestellten Experiments. 

Anhand dieser Parameter können die durchgeführten Versuche gut untereinander verglichen 

und auf ihre Reproduzierbarkeit geprüft werden. In Abbildung 29 sind die FMI von drei 

Chemotaxis Experimenten mit HT-1080 Zellen in1,5 mg/ml Collagen Gelen parallel (x-FMI) 

und senkrecht (y-FMI) zum Chemoattraktant-Gradienten gezeigt. 

Abbildung 29: Schematischer Vergleich der gemessenen FMI parallel und senkrecht zum 

Konzentrationsgradienten für den Chemotaxisversuch (+/-) aus drei Experimenten, sowie Negativ- (-/-) 

und Positiv-Kontrolle (+/+) zu je zwei Experimenten. 

Für alle 3 durchgeführten Experimente waren die Werte für den x-FMI deutlich negativ 

während y-FMI immer nahe 0 war. Die an zwei Experimenten durchgeführten Negativ- und 

Positiv-kontrollen zeigen sowohl für den x-FMI wie auch den y-FMI sehr kleine Werte an. 

4. Ergebnisse 54


4.2.1.3. Chemotaxis in synthetischen Gelmatrizes 

Durch Matrix-Metalloproteasen (MMP) auf ihrer Oberfläche sind HT-1080 Zellen fähig, sich 

durch vernetzte Strukturen mit definierten Verbindungsmolekülen zu schneiden, deren 

Maschenweite ansonsten zu klein für eine Bewegung der Zelle durch das Gel wäre. Vor 

diesem Hintergrund sollen im Folgenden kurz die Migrationseigenschaften dieser Zellen 

durch hochvernetzte Hydrogele getestet werden, deren gute optische Eigenschaften eine 

Qualitätsverbesserung mikroskopischer Aufnahmen versprechen. In Anbetracht der 

Parameter-Entkopplung kann eine Zusammensetzung der Matrix aus komplett synthetischen 

Materialen mit bekannten Mengenangaben auch helfen, die Abhängigkeit der Zellmigration 

von einzelnen Matrixparametern besser zu verstehen. 

Getestet wurden zwei kommerziell erhältliche Hydrogele unterschiedlicher Hersteller, deren 

Zusammensetzung und Eigenschaften, soweit bekannt, in Punkt 3.4.2.beschrieben sind. Als 

Chemoattraktant wurde in allen Fällen 10% FCS in DMEM verwendet. Zum Einfüllen der 

Chemoattraktant-Lösung wurden in allen Fällen die unter Punkt 3.5.2. auf Seite 33 

beschriebene Slow method verwendet. 

3D-Matrix der Firma Qgel 

Wie unter Punkt 3.4.2. auf Seite 29 beschrieben, wurden 3x10 6 HT-1080 Zellen der Qgel 3D- 

Matrix hinzugefügt und in die Mittelkanäle von Chemotaxis 3D-Slides gefüllt. Das Aushärten 

der Gelmatrix nahm etwa 10 Minuten in Anspruch. Die Zusammensetzung des Gels war 

größtenteils vom Hersteller vorgegeben. Getestet wurden die Varianten mit und ohne RGD- 

Peptid in der höchst möglichen Verdünnung. 

4. Ergebnisse 55


Abbildung 30 zeigt Zellen im Qgel Hydrogel im Vergleich zu einer 1,5mg/ml Collagen I 

Matrix. 

Abbildung 30: Vergleich der Morphologie von HT-1080 Zellen in (A) einem Hydrogel der Firma Qgel und 

(B) einem Collagen I Gel. 

In der Aufnahme des Hydrogels sind keine Fasern zu erkennen und der Hintergrund erscheint 

einheitlicher. Die Zellen im Hydrogel zeigen eine rundlichere Morphologie und bilden 

deutlich weniger beziehungsweise kürzere Fortsätze aus. Die Zellen migrieren durch das 

Hydrogel, zeigen aber keine Vorzugsrichtung in Reaktion auf einen Lockstoffgradienten wie 

nachfolgende Wertetabelle zeigt. 

Chemoattraktant p-Value ǁ(x)-FMI ⊥(y)-FMI Directness Velocity [µm/min] Tracks 

10% FCS 0.5738 -0.060 0.019 0.2936 0.429 29 

40 % FCS 0.2258 0.058 0.024 0.1617 0.486 26 

Tabelle 2: Migrationsparameter von HT-1080 Zellen in Qgel. 

Alle gezeigten Parameter deuten darauf hin, dass die Bewegung der Zellen nicht 

chemotaktisch erfolgt. Die Geschwindigkeit der Zellen entspricht mit einem mittleren Wert 

von 27.45 µm/h in etwa der Geschwindigkeit, die bei der Migration durch Collagen-Matrizes 

erreicht werden konnte. Es war mit der zur Verfügung stehenden Menge der Gelmatrix jedoch 

nicht möglich, genug Versuche durchzuführen, um Zellen in diesem Gel zur gerichteten 

Migration zu bringen. 

4. Ergebnisse 56

Cellendes-Hydrogele: 


Getestet wurde hier ein Hydrogel mit 2,5mg/ml einer Maleimid-BSA Matrix. Die Versuche 

wurden ebenfalls mit 3x10 6 Zellen durchgeführt, wie unter Punkt 3.5.1. auf Seite 33ff 

beschrieben. RGD-Peptid musste manuell hinzugefügt werden, um den Zellen 

Bindungsmotive für zur Migration zur Verfügung zu stellen. Das Aushärten der Matrix 

erfolgte innerhalb weniger Minuten, so dass es nicht möglich war, das Gel ohne mechanische 

Verformungen in die Kanäle der Chemotaxis 3D Slides zu füllen. 

Abbildung 31: HT-1080 Zellen in einer 2,5mg/ml Maleimid-BSA Matrix der Firma Cellendes. 

In dem rot eingekreisten Bereich sind deutlich mechanische Verformungen der Matrix in Folge der 

Eintretenden Polymerisation während des Einfüllvorgangs in den Slide zu sehen. 

Zwischen der Konzentration an RGD Peptid und der Beweglichkeit der Zellen konnte eine 

positive Proportionalität bis zur möglichen Maximalkonzentration festgestellt werden, wie 

Tabelle 3 zeigt. 

RGD-Konz. Gesamt Beweglich Unbeweglich Tot 

0.2mM 26 4 22 5 

0.5mM 74 15 59 4 

1.0mM 60 24 36 6 

Tabelle 3: Zellzahlen geordnet nach Vitalität in Maleimid-BSA Matrizes der Firma Cellendes mit 

unterschiedlichen RGD-Konzentrationen. 

4. Ergebnisse 57


Die Morphologie der Zellen in der Maleimid-BSA Matrix der Firma Cellendes gleicht in etwa 

derjenigen, die in Qgel beobachtet wurde. Die wenigen Ausläufer sind relativ kurz und die 

allgemeine Form der Zellen ist tendenziell eher rundlich. Die Zellen zeigen auch hier 

ungerichtete Bewegung durch das Gel ohne erkennbare Vorzugsrichtung in Reaktion auf 

einen chemotaktischen Stimulus. Die Bewegung durch das Gel unter Einsatz von MMP 

scheint aber möglich. 

4.2.2. HL-60 Zellen in Gelmatrizes 

Anhand der schnellen HL-60 Zellen soll die Eignung des µ-Slide für Chemotaxisexperimente 

getestet werden, die sich im Bereich weniger Stunden abspielen. Es soll ermittelt werden, ob 

die Zeit bis zur vollständigen Etablierung des Gradienten (vgl. 4.1.3. Seite 50f) erkennbare 

Auswirkungen auf das Migrationsverhalten der Zellen hat. Im Anschluss soll daraus ein 

angemessener Beobachtungzeitraum für Chemotaxis-Assays mit schnellen Zellen bestimmt 

werden. 

Im Vorfeld der Experimente mit HL-60 Zellen stand die Optimierung der 

Migrationsparameter für diese Zellen in Gelmatrizes. Die unter 3.2.1. beschriebene 

Differenzierung der Zellen gestaltete sich mit wechselhaftem Erfolg und in Abhängigkeit der 

Sorgfalt mit der das Differenzierungsmedium gewechselt wurde. Standardisierte 

Voraussetzungen sind folglich nicht für jedes unternommene Experiment als gegeben 

anzunehmen. 

Die Migration von HL-60 Zellen läuft der Literatur zu Folge hauptsächlich durch plastische 

Verformung der umgebenden Matrixfasern und Ausnutzung von Hohlräumen in der Matrix ab 

[Friedl et al., 2000]. Zur Migration von Neutrophilen finden sich Konzentrationen von 

1,8mg/ml Collagen in den verwendeten Matrizes [Grinell, 1982]. Für HL-60 Zellen in 

Rattenschwanz Collagen I Gelen wurden die besten Ergebnisse allerdings für eine 

Konzentration von 1mg/ml erzielt. An Zellen in stärker vernetzten Matrizes konnte in den 

meisten Fällen nur ein Zittern der Zelle innerhalb eines bestimmten Radius beobachtet 

werden. Bewegungen über Strecken, die das Maß einer Zelllänge [~15µm] überschreiten 

konnten kaum beobachtet werden. 

Die im Folgenden dargestellten Experimente wurden ausnahmslos mit einer Konzentration 

von 1mg/ml Collagen durchgeführt. 

4. Ergebnisse 58


Als Chemoattraktant wurde in allen untersuchten Fällen N-Formylmethionyl-Lencyl- 

Phenylalanin (fMLP) verwendet. Zur Menge des verwendeten Chemoattraktant variieren die 

Literaturangaben stark in Abhängigkeit der verwendeten Untersuchungsmethode. Zur 

Ermittlung der idealen Konzentration wurden für C100 verschiedene Konzentrationen getestet. 

Tabelle 4 soll auf die wichtigsten kurz Bezug nehmen. 

Für alle aufgeführten chemotaktischen Untersuchungen wurde das Chemoattraktant in das 

links vom Mittelkanal gelegene Reservoir eingefüllt. 

Eine dadurch ausgelöste gerichtete Zellbewegung ist folglich in Form einer Wanderung in 

negativer x-Richtung zu erwarten. 

Die Bewegung von Einzelzellen wurden wie in Punkt 3.5.2. beschrieben mit Hilfe des 

„manual tracking“ Plugins der Software ImageJ verfolgt und in Tabelle 4 dargestellte Werte 

anschließend durch das Chemotaxis and Migration Tool der Firma Ibidi generiert. 

Konzentration p-Value ǁ(x)-FMI ⊥(y)-FMI Directness Velocity[µm/min] Tracks 

1µM 0,763 -0,014 0,026 0,153 4,85 21 

200nM 0,024 -0,048 -0,035 0,148 5,46 24 

10nM 0,092 -0,038 -0,013 0,139 4,39 22 

5nM 0,022 -0,097 -0,013 0,192 1,68 7 

Tabelle 4: Gemessene Chemotaxis-Parameter einer Versuchsreihe mit unterschiedlichen Chemoattraktant 

Konzentrationen. 

Tracks bezeichnet hier die Anzahl verfolgter Zellen. Diese dient auch als Maß für die 

statistische Signifikanz der Werte. 

Die gemessenen Werte zeigen tendenziell eine Zunahme des Verhältnisses der Beträge von x 

und y-FMI. Die Konzentration von 1µM ausgenommen, überschreitet der p-wert bei keinem 

der Experimente den Wert 0.01. Die Direktionalität der Zellenmigration ist für alle Ansätze 

weitestgehend einheitlich. Die Geschwindigkeit der Zellen liegt in dem Versuch mit 5nM 

fMLP um den Faktor 15, mit höheren fMLP-Konzentrationen in etwa um den Faktor 5 

unterhalb des Erwartungswertes von 22-27µm/min für vergleichbare neutrophile 

Granulozyten. [Foxman et al. 1999] 

4. Ergebnisse 59


Die Entwicklung der FMI spricht für einen ansteigenden chemotaktischen Effekt mit 

Rückgang der Chemoattraktant Konzentration. (Tendenz in negative x-Richtung zu wandern 

nimmt zu) Die Geschwindigkeit und allgemeine Beweglichkeit der Zellen bei Zugabe von nur 

5nM fMLP waren zu gering um verwertbare Daten zu produzieren. Für weiterführende 

Untersuchungen wurde deshalb eine fMLP-Konzentration von 10nM als Chemoattraktant 

gewählt. 

An dieser Stelle sei angemerkt, dass die in der Tabelle 4 gelisteten Werte chemotaktische 

Stimuli andeuten, aber weit hinter einer erwarteten Reaktion zurückbleiben. 

Es war im Rahmen des praktischen Zeitkontingents dieser Arbeit leider nur möglich ein 

einziges Chemotaxis Experiment an HL-60-Zellen durchzuführen, dessen Ergebnisse deutlich 

genug ausfallen, um daraus die andeutungsweise weiterführende Zusammenhänge abzuleiten. 

Es ist vor Abschluss der Versuchsreihen nicht gelungen, dessen Reproduzierbarkeit zu 

gewährleisten. Im Folgenden soll es unabhängig davon einer kurzen Analyse und einer 

Abschätzung der Zusammenhänge zum Diffusionsprofil im µ-Slide unterzogen werden. 

HL-60 Zellen wurden nach einem Differenzierungszeitraum von 5 Tagen in einer Collagen 

Matrix in Chemotaxis 3D µ-Slides eingebettet und etwa 30 Minuten nach Befüllen der 

Reservoire mit Chemoattraktant über einen Zeitraum von 3 Stunden beobachtet. Die 

Schrittweite der Zeitraffer Aufnahmen wurde auf 1 Minute festgelegt. Als Chemoattraktant 

wurde fMLP mit einer Konzentration von 10nM verwendet. 

Die ermittelten Parameter sind in Tabelle 5 aufgelistet. 

Chemoattraktant p-Value ǁ(x)-FMI ⊥(y)-FMI Directness Velocity [µm/min] Tracks 

10nM fMLP 2.2542*10 -7 -0.189 0.040 0.2471 7.243 26 

Tabelle 5: Chemotaxis Parameter des zum Vergleich mit den Diffusionsmessungen herangezogenen 

Experiments. 

Um festzustellen, ob sich die untersuchten Zellen innerhalb der Gelmatrix bewegen, muss die 

Morphologie während der Migration betrachtet werden. Die Form der Zellen ist im ruhenden 

Zustand meist rundlich und während der Bewegung langgezogen und spindelförmig. 

4. Ergebnisse 60


Abbildung 32 zeigt eine Zelle während der Bewegung in Richtung des chemotaktischen 

Stimulus aus dem linken Reservoir des Slides. 

Abbildung 32: Bilderreihe von Phasenkontrastaufnahmen zur Darstellung der morphologischen 

Anpassung der Zelle während der Migration durch eine Gelmatrix. 

Die Anfangs rundliche Form des Zellkörpers zieht sich während des Bewegungsschrittes in 

die Länge und nimmt eine spindelförmige Form an. Nach der Bewegung ist der Zellkörper 

wieder komprimiert und rundlich. Die dunkleren Fortsätze an dem Zellkörper sind Ausläufer 

der Zelle, mit welchen Adhäsionspunkte zur Matrix hergestellt oder gelöst werden. In 

Abbildung 33 sind die Wegstrecken zu sehen, welche die Zellen über den 

Beobachtungszeitraum zurückgelegt haben. Die schwarzen Punkte stellen die Endpositionen 

der Zellkörper dar. 

Abbildung 33: Bewegungsmuster von HL-60 Zellen in einem Collagen I Gel mit 1,0mg/ml als Reaktion 

auf einen Stimulus mit 10nM fMLP. 

4. Ergebnisse 61


Um die Vorzugsrichtung zu verdeutlichen, sind Zellen deren Position sich relativ zum Start 

des Experiments in positiver x-Richtung verschoben hat rot gefärbt, Zellen mit negativer 

x-Verschiebung schwarz. Der gemittelte Massenschwerpunkt der Kreise, welche die 

Endpositionen der Zellen darstellen, ist als blaues Kreuz dargestellt. Anhand der 

Farbmarkierung der Spuren ist eine eindeutige Vorzugsrichtung erkennbar, was auch die 

Positionierung des Massenschwerpunktes unterstreicht, der eine deutliche Auslenkung in 

negativer x-Richtung erfahren hat. 

In Abbildung 34 ist die Entwicklung der x und y Koordinaten des Massenschwerpunkts aller 

Zellen über die Zeit gezeigt. 

Abbildung 34: Verlagerung der Position des Massenschwerpunkts in x und in y Richtung in Abhängigkeit 

der Zeit. 

Während die y-Koordinate trotz des Anstiegs innerhalb der letzten Stunde weitestgehend 

konstant um den Nullpunkt verläuft, zeigt sich für die x-Koordinate ein linearer Abfall in den 

negativen Bereich über das gesamte Zeitfenster. Bezogen auf die Zellen stehen diese Werte 

für eine Bewegung die gleichermaßen in positive wie negative y-Richtung aber mit einer 

eindeutigen Vorzugsrichtung in negativer x-Richtung abläuft, die die Wahrscheinlichkeit eines 

zufällig auftretenden Effekts minimiert. 

4. Ergebnisse 62


4.2.3. Migrationsanalyse durch Aktinfärbung mit LifeAct-tag GFP2/RFP 

Neben Wildtyp Zellen wurden von den jeweiligen Zellkulturen auch LifeAct-tag GFP2/RFP 

transfizierte Stämme kultiviert und in Chemotaxis-Experimenten untersucht. Das LifeAct-tag 

lagert Moleküle des Green fluorescent protein (GFP) beziehungsweise des Red fluorescent 

protein (RFP) an die Aktinmoleküle der Zellen an. Die Migration der Zellen findet, wie in 

Punkt 1.3. beschrieben, durch Umlagerungen des Aktingerüsts innerhalb der Zelle statt. 

Durch den Einsatz fluoreszenzmarkierten Aktins ist es möglich die Umlagerung und 

Ausrichtung des Aktins während der Migration zu beobachten. 

Abbildung 35 zeigt die Aktinstrukturen einer HT-1080 Zelle mit LifeAct-tag RFP. 

Abbildung 35: HT-1080-Zelle mit LifeAct-tag RFP. 

In der Abbildung 35 ist eine Anhäufung des gefärbten Aktins im Zentrum des Zellkörpers zu 

erkennen. Die Fortsätze mit denen sich die Zelle in dem umgebenden Gel orientiert und 

festhält sind ebenfalls deutlich erkennbar. 

Für HT-1080 Zellen war während der durchgeführten Chemotaxisversuche keine Verlagerung 

der Fluoreszenzintensität in Bewegungsrichtung zu erkennen, obwohl die Zellen in ihrem 

Migrationsverhalten und der Reaktion auf den chemotaktischen Stimulus der Wildtyp- 

Variante gleichen. 

Erkennbar waren nur eine permanente dynamische Umlagerung der Aktinstrukturen im 

Inneren der Zelle während der Bewegung und eine deutliche Intensitätsanreicherung an dem 

hinteren Ende der Zellen beim Lösen von Verankerungen aus dem Gel. 

4. Ergebnisse 63


Abbildung 36 zeigt Bilddaten eines HT-1080 Chemotaxis-Experiments im Phasenkontrast 

und als Fluoreszenzaufnahme. 

Abbildung 36: Vergleich zwischen (A) Phasenkonstrast und (B) Fluoreszenzaufnahme von HT-1080 mit 

Life Act-tag RFP in einer Collagenmatrix. 

Für HL-60 Zellen konnten wegen der undefinierten Migrationsparameter keine 

Fluoreszenzdaten von gerichteter Migration generiert werden. 

Man erkennt aber eine deutliche Anreicherung markierter Strukturen am Frontende der Zelle 

in Richtung einer zufälligen, ungerichteten Bewegung, wie in Abbildung 37 zu erkennen ist. 

Abbildung 37: Fluoreszenzaufnahme einer HL-60 Zelle mit LifeAct-tag GFP2 während einer 

ungerichteten Bewegung. 

Die Fortsätze mit denen das Gel durchdrungen wird (rote Pfeile), um Adhäsionspunkte für die 

folgende Bewegung zu schaffen weisen ebenfalls eine starke Fluoreszenzintensität auf. 

4. Ergebnisse 64


5. Diskussion und Ausblick 

5.1. Bewertung der Ergebnisse 

5.1.1. Diffusionsmessungen 

Obwohl die LSM Messungen durch fehlende Referenzmessungen in ihrer Aussagekraft 

eingeschränkt wurden lassen sich daraus einige wichtige Erkenntnisse ableiten. 

Durch die Verwendung der Slow-method , liegt die Konzentration C100 nicht von Anfang an 

am linken Rand des Kanals an. In Folge interner Diffusionsvorgänge im Reservoir von C100 

kommt es dadurch zu einer Schrittweisen Etablierung des Gradienten. Dieser Vorgang kann 

anhand der deutlich flacher verlaufenden Kurven der 1-Stunden Messungen in Abbildung 22, 

unter Punkt 4.1.2. auf Seite 44 abgeschätzt werden Diese Beobachtung lässt vermuten, dass 

die Etablierung des Gradienten schon innerhalb weniger Stunden abläuft. Alle weiteren 

gemessenen Konzentrationsprofile sind annähernd deckungsgleich In Folge des 2. Fick’schen 

Gesetzes müsste sich in Folge der Diffusion mit der Zeit ein Konzentrationsausgleich und 

damit ein Abflachen des linearen Bereichs der Kurvensteigungen aus Abbildung 22 um einen 

Drehpunkt bei etwa 50% von C100 einstellen. Damit ergibt sich für den erwarteten Verlauf der 

Konzentrationsprofile ein Muster, wie schematisch in Abbildung 38 dargestellt. 

Abbildung 38: Schematische Darstellung der erwarteten Konzentrationsverläufe. 

Aufgetragen sind Erwartungswerte (A) nach vollständiger Etablierung des Gradienten (t~12h) bis (D) 

kurz vor Einstellung des Konzentrationsgleichgewichts. 

5. Diskussion und Ausblick 65


Es ist wahrscheinlich, dass sich die Konzentration nicht exakt um den beschriebenen 

Drehpunkt einpendelt, weil die beiden Reservoire C0 und C100 in Folge interner 

Diffusionsvorgänge keine optimale Quelle beziehungsweise Senke darstellen, aber ein 

Abflachen der Kurvensteigung sollte zu beobachten sein. Dieser Rückgang ist im Rahmen des 

Messfehlers der gesammelten Daten nicht erkennbar. Referenzmessungen in allen Kammern 

wären für jeden Slide notwendig gewesen. Der damit verbundene zeitliche Aufwand war 

jedoch zu groß für das zur Verfügung stehende Zeitkontingent. 

Obwohl die Messungen am LSM für eine detaillierte Messung der Entwicklung des 

Konzentrationsprofils im zellbiologisch relevanten Zeitraum von 48 Stunden zu störanfällig 

sind, konnte mit ihrer Hilfe gezeigt werden, dass der Gradient im Chemotaxis 3D-Slide nach 

anfänglicher Etablierung für mindestens 36 Stunden konstant bleibt und unabhängig von der 

verwendeten Gelmatrix verläuft. Ähnlicher Ergebnisse bei der Verwendung von Farbstoffen 

stark unterschiedlicher Molekülgrößen legen nahe, dass der Durchmesser der diffundierenden 

Partikel keinen Einfluss auf die Form des Gradienten hat. 

Durch FCS Messungen konnten schließlich Etablierung und Verlauf des Gradienten detailliert 

gezeigt werden. Auch hier ist erkennbar, dass die Verwendung unterschiedlich stark vernetzter 

Gelmatrizes keine Rolle spielt. Es konnte gezeigt werden, dass, wie anhand der LSM 

Ergebnisse vermutet, die Etablierung des Gradienten zu einem Großteil schon innerhalb der 

ersten 1-2 Stunden stattfindet. In Folge des Konzentrationsausgleichs nach dem 2. Fick’schen 

Gesetz konnte eine leichte Abnahme des Gradienten nach 24 Stunden festgestellt werden, die 

sich aber in einem von den Zellen vermutlich nicht wahrnehmbaren Bereich abspielt. 

Für Chemotaxisexperimente ergibt sich damit ein Zeitraum von 1-48 Stunden, in welchem, 

bezogen auf den Gradienten, einheitliche Bedingungen angenommen werden können. 

5.1.2. Chemotaxis-experimente mit HT-1080 und HL-60 Zellen 

Parallel durchgeführte Experimente mit HT-1080 Zellen zeigen deutlich und reproduzierbar, 

dass die Zellen fähig sind in den µ-Slides Chemotaxis 3D über einen Zeitraum von mehr als 

24-Stunden, als Reaktion auf einen chemotaktischen Stimulus, durch eine Gelmatrix zu 

migrieren. Um bestimmten zu können, ob Unterschiede im Migrationsverhalten der Zellen im 

Gel im Vergleich zur 2-dimensionalen Migration auf einer Oberfläche auftreten, wurden die 

unter Punkt 4.2.1.1. beschriebenen Daten mit einem bestehenden Datensatz von 2d- 

Migrationsdaten verglichen. 

Abbildung 39 stellt dazu die Verlagerung des Massenschwerpunkts (COM) in x- und in y- 



Richtung, den FMI in x- und in y- Richtung und die Migrationsgeschwindigkeit von jeweils 3 

Experimenten in 2D und in 3D gegenüber. Die Werte für die Verschiebung des 

Massenschwerpunkts in den 3D-Migrationsexperimenten wurden mit dem Faktor -1 

multipliziert, um eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu erhalten. 

Abbildung 39: Schematischer Vergleich von (A,B) FMI, (C,D) p-Value (Rayleigh Test), (E,F) Verschiebung 

des Massenschwerpunkts und (G,H) Geschwindigkeit der Zellen in (A,C,E,G) 2-dimensionalen und 

(B,D,F,H) 3-dimensionalen Chemotaxisexperimenten. 

Für alle Versuche wurden zusätzlich die Kontrollexperimente mit aufgenommen. 



Die FMI parallel zum Gradienten sind für alle Chemotaxis Experimente (+/-) betragsmäßig in 

einem Bereich um 0,3. Die FMI senkrecht zum Gradienten sowie alle Kontrollmessungen 

bewegen sich im weitesten Sinne um den Nullpunkt. Zwischen 2D und 3D Versuchsansätzen 

bestehen hier keine nennenswerten Unterschiede. Die Verlagerung des Massenschwerpunkts 

weist für die Versuche in 3D leicht höhere Werte, aber auch eine höhere Streuung der 

Ergebnisse auf. Die unterschiedlichen Migrationsmodi scheinen auch hier keinen 

entscheidenden Einfluss zu haben. Die Geschwindigkeit der Zellen war in 2D und 3D 

Experimenten annähernd exakt gleich. Nur die Zellen der Positivkontrolle in 2D bewegen 

sich merklich schneller. Die Negativkontrolle weist in beiden Fällen leicht niedrigere 

Migrationsgeschwindigkeiten auf. Der Mittelwert der Geschwindigkeit aus allen betrachteten 

Experimenten entspricht mit ~25,7µm/h in etwa dem in der Literatur angegebenen 

Wertebereich für Fibroblasten von 30-40 µm/h. [Even-Ram, 2005] 

Die Verwendung von synthetischen Hydrogelen im µ-Slide Chemotaxis 3D ist möglich. 

Eine gerichtete Migration der Zellen in den Gelen hängt aber von zu vielen Parametern ab, als 

dass sie im Rahmen dieser Arbeit noch hätte erfolgreich gezeigt hätte werden können. 

Die optische Qualität der Ergebnisse ist gut und spricht weiteren Experimenten mit 

synthetischen Matrizes eine nicht unbedeutende Rolle zu. 

Obwohl für HL-60 Zellen mit Abschluss der Versuchsreihen noch keine reproduzierbaren 

Chemotaxis-Daten vorlagen, konnte anhand von Einzelergebnissen angedeutet werden, dass 

die Etablierung des Gradienten keinen Einfluss auf das Migrationsverhalten der Zellen 

ausübt. Bei Analyse des FMI in Abhängigkeit von der Zeitkoordinate, wie in Abbildung 34 

dargestellt, zeigt sich ein konstant hoher Wert für den Betrag des ǁ(x)-FMI und ein Wert nahe 

0 bezogen auf den ⊥(y)-FMI. Dabei fällt ein stark verrauschter Bereich während der ersten 30 

Minuten der Messung auf. 



Interessant stellt sich diese Beobachtung im Vergleich mit dem in Abbildung 27 unter Punkt 

4.1.3 auf Seite 50 gezeigten Verlauf der Steigung des Konzentrationsprofils in den ersten 

Stunden während der Etablierung dar. 

Abbildung 40: Vergleich zwischen (A) der Entwicklung des Gradienten über die Zeit während der 

Etablierung und (B) dem Verlauf der FMI der HL-60 Zellen während dieser Zeit. 

Nach dem anfänglichen Rauschen, das in etwa der Zeitspanne des steilen Anstiegs des 

Gradienten entspricht, bleibt das Verhalten des FMI, ähnlich wie der Verlauf des Gradienten 

tendenziell konstant. 

Analysiert man die Entwicklung des FMI anhand des Gradientenverlaufes, ist es möglich, 

zwischen dem steilen Anstieg des Chemoattraktant-Gradienten innerhalb der ersten Stunden 

und dem anfänglichen „Rauschen“ des FMI einen Zusammenhang zu sehen. Ein gesicherte 

Behauptung lässt sich hier aber nicht aufstellen, weil das auftretende Rauschen auch durch 

eine hohe Varianz der akkumulierten Migrationsstrecke der Zellen innerhalb der ersten 



Minuten zustande kommt, die in die Formel für die Berechnung des FMI mit einfließt. Nach 

etwa 30 Minuten gestaltet sich der Verlauf des FMI aber konstant, was darauf schließen lässt, 

dass auch Experimente mit schnellen Zellen und über einen kurzen Zeitraum keiner 

anfänglichen Wartezeit bedürfen. 

Anhand der Morphologie der Zellen kann geschlossen werden, dass die Migration der Zellen 

innerhalb der Matrix stattfindet und nicht entlang der Kanaldecke oder des Bodens. 

Die spindelförmige Form während der Bewegung und der rundliche Zellkörper ohne den, bei 

adhärenten Zellen sichtbaren Adhäsionsfilm um die Zelle, sind Zeichen dafür, dass die 

Bewegung der Zellen durch Anpassung an die Gelmatrix erfolgt. 

Obwohl es bis zum Ende des Versuchszeitraumes nicht gelungen ist, Migrationsexperimente 

von HL-60 in Gelmatrizes mit durchwegs eindeutigen Ergebnissen zu reproduzieren, 

gestaltete sich die Arbeit mit dieser Zellinie vielversprechend. Es ist zu erwarten, dass durch 

die gewonnenen Erkenntnisse die Möglichkeit besteht, mit etwas zusätzlichem Aufwand 

reproduzierbare Chemotaxis-Assays mit HL-60 Zellen zu entwerfen, die stellvertretend für 

Versuche mit schnellen Zellen gesehen werden können. 

Die Versuche mit dem LifeAct-tag haben einen ersten Blick in die Vorgänge im Inneren der 

Zellen während der gerichteten Migration ermöglicht. Dabei scheint sich die Dynamik der 

Umlagerung des Aktingerüsts zwischen HT-1080 Zellen und HL-60 Zellen merklich zu 

unterscheiden, wie die Betrachtung der unterschiedlich starken Polarisation der Zellen zeigt. 

Es wäre möglich, dass dieser Effekt auf die, unter Punkt 1.3. beschriebenen, unterschiedlichen 

Migrationsmodi der beiden Zelllinien zurückzuführen ist, wonach langsame, integrin- 

vermittelt migrierende Zellen wie HT-1080, weit weniger polarisieren, als schnelle, 

vermutlich Integrin-unabhängig agierende Zellen wie HL-60 [Even-Ram, 2005]. Das geringe 

Volumen der vorhandenen Daten erlaubt allerdings keine weitere Einschätzung dieser 

Beobachtung. 

Die Probleme bei der Bereitstellung der richtigen Migrationsparameter für HL-60 Zellen und 

der kurze Zeitraum, in welchem transfizierte HT-1080 Zellen für Versuche zur Verfügung 

standen, führten dazu, dass das Potential dieser Methode im Rahmen dieser Arbeit nicht 

annähernd ausgeschöpft werden konnte. Die unter Punkt 4.2.3. vorgestellten Ergebnisse 

vermitteln jedoch einen ungefähren Eindruck, auf welcher Ebene Chemotaxis Experimente in 

naher Zukunft ausgewertet werden können. 



Zusammenfassend lässt sich aussagen, dass die Daten der Chemotaxis-Experimente mit 

HT-1080 und HL-60 Zellen die Daten aus den Diffusionsmessungen bestätigen. Die schnelle 

Etablierung und der anschließend über mehrere Stunden konstante Verlauf des Gradienten 

erfüllen die Anforderungen für Chemotaxisexperimente mit schnellen und mit langsamen 

Zellen. Das µ-Slide Chemotaxis 3D liefert die Grundlage dafür, neue Erkenntnisse im Bereich 

der Chemotaxisforschung zu gewinnen, die sich aus der Arbeit mit Zellen in Gelmatrizes 

ergeben. 



5.2 Weiterführende Ansätze 

Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden weiterhin einige Methoden untersucht, die ebenfalls 

Verbesserungspotential für zukünftige Chemotaxis-Experimente in sich tragen. 

Softwaregestütztes Zell-tracking: 

So wurde unter anderem eine auf Math-Lab basierende Software zum automatischen Tracking 

der Zellen bei der Auswertung der Bilddaten von Migrationsexperimenten getestet. 

Das Time Lapse Analyser (TLA) getaufte Programm der Arbeitsgruppe um H.Kestler aus der 

Fakultät für Informatik der Universität Ulm, erkennt anhand der Kontraste zum Hintergrund 

die Position der Zellkörper und erstellt daraus für alle vorhandenen Zellen ein 

Bewegungsprofil. Der mühsame, sehr zeitaufwändige Prozess des manuellen Zell-tracking 

könnte dadurch überflüssig werden. Genauere Aussagen über die Funktionalität der Software 

können allerdings mangels Rechnerleistung und der notwenigen Einarbeitungszeit hier nicht 

getroffen werden. 

Digitalholographische Mikroskopie: 

Bei einem Besuch am Lehrstuhl für Biophysik der Universität Münster wurde durch die 

Arbeitsgruppe von Herrn Dr. Björn Kemper zur Gewinnung realistischer 3D-Bilddaten ein 

Verfahren der Digitalholographischen Mikroskopie vorgestellt. In Kombination mit dem µ- 

Slide Chemotaxis 3D kann 3-dimensionale Struktur der Zellen während der Migration 

dadurch erstaunlich genau dargestellt werden. 

3-dimensionales Zell-tracking: 

Der Trend zu Chemotaxis-Experimenten in Gelmatrizes legt es des Weiteren nahe sich mit 

möglichen Verfahren zu Zell-Tracking in 3D auseinanderzusetzen. Durch die geringe z- 

Komponente des Mittelkanals im µ-Slide Chemotaxis 3D ist die Bewegung der Zellen in z- 

Richtung stark eingeschränkt. Die Analyse der Migration erfolgt aber trotzdem ausschließlich 

in 2 Dimensionen und berücksichtigt Bewegungen entlang der z-Achse nicht. Durch 

sogenanntes z-stacking ist es möglich zu einem Zeitpunkt mehrere Bilder unterschiedlicher z- 

Ebenen aufzunehmen. Die Wanderung der Zelle über einen bestimmten Bereich der z-Achse 

entspricht einem Übertritt in eine andere Schärfeebene des verwendeten Objektivs. Analysiert 

man anschließend die gewonnenen Bilddaten, kann die z-Position der Zelle anhand der 

Schärfe der Einzelaufnahmen in den Bildstapeln gefolgert werden. 



6. Zusammenfassung 

Anhand der Ergebnisse der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie-Techniken konnte gezeigt 

werden, dass sich ein Stoffgradient im µ-Slide Chemotaxis 3D innerhalb kurzer Zeit etabliert 

und anschließend mindestens 48 Stunden annähernd konstant bleibt. 

Die Wahl der verwendeten Gelmatrix, genau wie die Größe des diffundierenden Stoffes 

spielen dabei keine Rolle, so lange die Größe der Stoffpartikel deutlich kleiner ist, als die 

Maschenweite der Matrix. 

Dies ist für die meisten Chemotaxine in Verbindung mit kommerziell erhältlichen Hydrogelen 

der Fall. 

Anhand mehrerer Experimente an HT-1080-Zellen konnte gezeigt werden, dass sich der µ- 

Slide Chemotaxis 3D gut zur Gewinnung 3-dimensionaler Migrationsdaten an langsamen 

Zelllinien eignet. 

Der Vergleich der HT-1080 3D-Daten mit vorhandenen 2D-Chemotaxis Daten und den aus 

der Literatur bekannten Werten liefern, abgesehen von der Migrationsgeschwindigkeit der 

Zellen in der Positivkontrolle keine nennenswerten Unterschiede. 

HL-60 Zellen konnte Chemotaxis in GelMatrizes im Rahmen dieser Arbeit nicht 

reproduzierbar nachgewiesen werden. Daten aus Einzelexperimenten weisen jedoch darauf 

hin, dass dies möglich ist und legen eine Eignung des µ-Slide Chemotaxis 3D für 

Experimente mit schnellen Zellen nahe. 

Versuche mit LifeAct-tag RFP/GFP2 ermöglichten leider nur wenige Einblicke in die 

Aktindynamik der Zellen während der Migration, zeigen aber das Potential der Methode in 

Kombination mit den guten optischen Eigenschaften der µ-Slides. 

6.Zusammenfassung 73


7. Abbildungsverzeichnis: 

Abbildung 1: Die verschiedenen Arten stimulierter Zellbewegungen eukaryontischer Zellen 

in schematischer Darstellung [Kőhidai L., 2006] ...................................................................... 7 

Abbildung 2: Polarisation eines neutrophilen Granulozyten. [Weiner et al., 1999] ................. 8 

Abbildung 3: Modifizierte Boyden-Kammer mit Gelmatrix. ................................................. 11 

Abbildung 4: Aufbauskizze einer Zigmond-Kammer [Zigmond, 1977] ................................ 12 

Abbildung 5: Schematische Darstellung eines µ-fluidischen Chemotaxis-Systems [Jeon et 

al., 2002] ................................................................................................................................... 13 

Abbildung 6: Schematische Darstellung des µ-Slide Chemotaxis 3D in der Draufsicht. [Ibidi 

GmbH, 2010]............................................................................................................................ 18 

Abbildung 7: Schematische Schnittdarstellung des µ-Slide Chemotaxis 3D entlang der x- 

Achse. [Ibdi GmbH, 2010] ....................................................................................................... 19 

Abbildung 8:Morphologisches Erscheinungsbild von undifferenzierten HL-60 Zellen und 

HL-60 Zellen nach 6 Tagen in 60mM DMSO. [Wright-Giemsa Färbung, Collins, 1978] ...... 22 

Abbildung 9: Schematischer Aufbau von F-Aktin mit LifeAct-tag GFP2/RFP [modifiziert 

aus Produktflyer, Ibidi GmbH, 2011] ....................................................................................... 24 

Abbildung 10: Schematische Darstellung des konfokalen Prinzips.[aus: Commons: Bilder 

zum Funktionsweise des konfokalen Prinzips, Stand September 2011] .................................. 26 

Abbildung 11: Verdünnungsgraphen verschiedener Fluorophore. [zur Verfügung gestellt vom 

Lehrstuhl für Biophysik, Dr. J. Raedler, LMU-München, 2011] ............................................. 28 

Abbildung 12: Schematische Darstellung des BSA-Proteins mit funktionellen Maleimid- 

Gruppen [modifiziert aus: Cellendes – Hydrogel User Guide Version 3.0, 2011] ................... 30 

Abbildung 13: Schematische Darstellung des PEG-Crosslinkers mit funktionellen Thiol- 

Gruppen und spaltbarer Peptidsequenz. [Cellendes – Hydrogel User Guide Version 3.0, 2011] 

.................................................................................................................................................. 30 

7.Abbildungsverzeichnis: 74


Abbildung 14: Schematische Darstellung der Verteilung der Chemoattraktant 

Konzentrationen auf die Kammern des µ-Slides Chemotaxis 3D zur Ermittlung der 

einzusetzenden Dosis. .............................................................................................................. 32 

Abbildung 15: Schematische Darstellung der Verteilung der Chemoattraktand- 

Konzentrationen für Chemotaxis Versuche mit Kontrollexperimenten. .................................. 33 

Abbildung 16: Vergleich der Phasenkontrastbilder unmittelbar nach Start eines 

Chemotaxisexperiments und nach 50 Minuten mit farbig markierten Zellspuren. .................. 34 

Abbildung 17: Schematische Darstellung der Versuchsdurchführung zur Matrix-Interaktion 

von Fluoreszenzfarbstoffen in einer Kammer des Angiogeneseslide ...................................... 38 

Abbildung 18: Verlauf der gemessenen Fluoreszenz-Intensität während der Versuche für 

Alexa 488 und FiTC-Dextran in Collagen Matrizes unterschiedlicher Stärke. ....................... 39 

Abbildung 19: Lage der konfokalen Schnittebene in einer Kammer der Chemotaxis 3D µ- 

Slide.......................................................................................................................................... 41 

Abbildung 20: Bilddaten einer LSM-Profilmessung bestehend aus 15*2 Einzelbildern und 

zugehöriges Intensitätsprofil. ................................................................................................... 42 

Abbildung 21: Schematische Darstellung der Datenanalyse durch LSM-Messungen ........... 43 

Abbildung 22: Konzentrationsprofile der Farbstoffe Alexa 488 und FITC-Dextran in einer 

CollagenI – Matrix. .................................................................................................................. 44 

Abbildung 23: Die Gradienten von Alexa 488 und FiTC-Dextran aufgetragen über die Zeit 

von 0-36h. ................................................................................................................................ 45 

Abbildung 24: Verdünnungsgraph für Alexa 488 zwischen C0 und C100 der eingesetzten 

Konzentrationen. ...................................................................................................................... 47 

Abbildung 25: Positionierung der FCS – Messpunkte in einer Kammer des µ-Slide. ........... 48 

Abbildung 26: Graphen der FCS-Messungen über einen Zeitrahmen von 15 min bis 48h.... 49 



Abbildung 27: Entwicklung des Gradienten aus den FCS-Messungen .................................. 50 

Abbildung 28: Mit dem Chemotaxis and Migration Tool erstellter Plot von Zellbewegungen 

.................................................................................................................................................. 53 

Abbildung 29: Schematischer Vergleich der gemessenen FMI parallel und senkrecht zum 

Konzentrationsgradienten für den Chemotaxisversuch (+/-) aus drei Experimenten, sowie 

Negativ- (-/-) und Positiv-Kontrolle (+/+) zu je zwei Experimenten. ...................................... 54 

Abbildung 30: Vergleich der Morphologie von HT-1080 Zellen in einem Hydrogel der Firma 

Qgel und einem Collagen I Gel. ............................................................................................... 56 

Abbildung 31: HT-1080 Zellen in einer 2,5mg/ml Maleimid-BSA Matrix der Firma 

Cellendes. ................................................................................................................................. 57 

Abbildung 32: Bilderreihe von Phasenkontrastaufnahmen zur Darstellung der 

morphologischen Anpassung der Zelle während der Migration durch eine Gelmatrix. .......... 61 

Abbildung 33: Bewegungsmuster von HL-60 Zellen in einem Collagen I Gel mit 1,0mg/ml 

als Reaktion auf einen Stimulus mit 10nM fMLP. ................................................................... 61 

Abbildung 34: Verlagerung der Position des Massenschwerpunkts in x und in y Richtung in 

Abhängigkeit der Zeit. ............................................................................................................. 62 

Abbildung 35: HT-1080-Zelle mit LifeAct-tag RFP. ............................................................. 63 

Abbildung 36: Vergleich zwischen Phasenkonstrast und Fluoreszenzaufnahme von HT-1080 

mit Life Act-tag RFP in einer Collagenmatrix. ........................................................................ 64 

Abbildung 37: Fluoreszenzaufnahme einer HL-60 Zelle mit LifeAct-tag GFP2 während einer 

ungerichteten Bewegung. ......................................................................................................... 64 

Abbildung 38: Schematische Darstellung der erwarteten Konzentrationsverläufe. ............... 65 

Abbildung 39: Schematischer Vergleich von FMI, p-Value (Rayleigh Test), Verschiebung des 

Massenschwerpunkts und Geschwindigkeit der Zellen in 2-dimensionalen und 3- 

dimensionalen Chemotaxisexperimenten. ................................................................................ 67 



Abbildung 40: Vergleich zwischen der Entwicklung des Gradienten über die Zeit während 

der Etablierung und dem Verlauf der FMI der HL-60 Zellen während dieser Zeit. ................ 69 



8. Tabellenverzeichnis 

Tabelle 1: Auszug der gemessenen Chemotaxis Parameter des in Abbildung 29 dargestellten 

Experiments. ............................................................................................................................. 54 

Tabelle 2: Tabelle: Migrationsparameter von HT-1080 Zellen in Qgel. ................................. 56 

Tabelle 3: Tabelle: Migrationsparameter von HT-1080 Zellen einer Maleimid-BSA Matrix der 

Firma Cellendes. ...................................................................................................................... 57 

Tabelle 4: Gemessene Chemotaxis-Parameter von HL- 60 Zellen in einer Versuchsreihe mit 

unterschiedlichen Chemoattraktant Konzentrationen. ............................................................. 59 

Tabelle 5: Chemotaxis Parameter von HL 60 Zellen des zum Vergleich mit den 

Diffusionsmessungen herangezogenen Experiments. .............................................................. 60 

8.Tabellenverzeichnis 78


9. Abkürzungsverzeichnis 

BSA Bovines Serum Albumin 

CCD charged coupled device 

COM center of mass 

DMEM Dulbeccos’ Modified Eagle Medium 

DMSO Dimethyl Sulfoxid 

EDTA Ethylendiamintetraacetat 

FCS Foetales Kälber Serum 

FCS Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie 

FITC fluorescein isothiocyanate 

FMI forward migration index 

fMLP N-Formylmethionyl-Lencyl-Phenylalanin 

GFP green fluorescent protein 

HUVEC human umbilical cord vascular endothelial cell 

LSM Laser Scanning Mikroskop 

MMP Matrix-Metallo Protease 

PBS phosphate buffered saline 

PMN Polymorphonukleare Neutrophile 

RFP red fluorescent protein 

RGD Einheitsbuchstabencode für: Arginin-Glycin-Asparaginsäure 

RPM revolutions per minute (entspricht U/min) 

RPMI Roswell Park Memorial Institute 

9.Abkürzungsverzeichnis 79

10. Anhang 


Anhang A: Verdünnungstabelle Qgel mit Angabe physikalischer Parameter (Ref 1001) 

[Qgel, 3D-Matrix Produkt Information, p03v00, April 2010] 

Anhang B: Pipettierschema der Cellendes 3D-Matrix nach Gelstärke 

[Cellendes, Hydrogel Userguide, v3.0, 2011] 

10. Anhang 80


Anhang C: Pipettierschema der Cellendes 3D-Matrix in Abhängigkeit der 

Zusatzpeptidkonzentration. [Cellendes, Hydrogel Userguide, v3.0, 2011] 

Anhang D: Pipettierschemata für unterschiedliche Medien aus dem Standardprotokoll zum 

Erstellen von Gelmatrizes unterschiedlicher Dichte aus Collagen bovine. 

[Ibidi GmbH, Application Note 26, 2011] 

10. Anhang 81


Anhang E: Standardprotokoll zur Vorbereitung von Chemotaxis Experimenten im µ-Slide 

Chemotaxis 3D. [Ibidi GmbH, Application Note 17, 2011] 

Standardprotokoll zum Befüllen des µ-Slide Chemotaxis 3D: 

- Slides und Medium sollten zur Gas Equillibrierung 

am Vortag schon in den Brutschrank mit einer 

Atmosphäre von etwa 37 °C und 5% CO2 gestellt 

werden. 

Verschlossene Gefäße sollten dazu leicht geöffnet 

werden. 

- Zuerst wird die Gelmatrix in den Slide gefüllt (vgl. 

Anhang D). 

Dazu werden die Einfüllstutzen C,D,E und F jeweils 

mit den mitgelieferten Stöpsel verschlossen 

- Anschließend werden 6µl der Gelsuspension auf 

Reservoir A des Kanals pipettiert 

- Die Pipettenspitze muss dann so auf Reservoir B 

gesetzt werden, dass eine schlüssige Verbindung 

besteht. Von dort werden 6 µl Volumen abgesaugt, 

so dass sich der ganze Kanal mit Flüssigkeit füllt. 

- Nach Einfüllen des Gels werden die Stöpsel aus den 

Stutzen C-E entfernt und die Reservoirs A und B 

verschlossen 

- Die Polymerisation des Gels im System erfolgt 

druckentlastet ohne Stöpsel auf den seitlichen 

Reservoirs. 

Um die Verdunstung von Flüssigkeit zu vermeiden 

müssen die Slides während dieser Zeit in eine 

feuchte Umgebung, wie zum Beispiel eine 

Petrischale mit angefeuchteten Tüchern gelegt 

werden. 

- Nach der matrixabhängigen Polymerisationszeit 

werden die seitlichen Reservoirs mit 

Chemoattraktant – Lösung befüllt. 

Dabei wird je nach Bedarf zwischen zwei 

Vorgehensweisen unterschieden: 

10. Anhang 82

Fast method: 


- Chemoattraktant-Lösung wird direkt in eines der 

beiden Reservoirs und Referenzlösung in das Andere 

gefüllt. 

- Dabei wird zuerst das Reservoir mit Hungermedium 

befüllt und mit Stöpseln verschlossen und 

anschließend das Reservoir mit Chemoattraktant, um 

ein Eindringen von Chemoattraktant-Lösung ins Gel 

durch Druckunterschiede zu verhindern. 

Slow method: 

- Zuerst werden beide Reservoirs mit Chemoattraktantfreier 

Lösung gefüllt und die Stutzen E und F 

anschließend verschlossen. 

- 30 µl Chemoattraktant-Lösung mit der doppelten 

Konzentration der gewünschten Endkonzentration 

werden auf Reservoir C pipettiert. 

- Mit einer geeigneten Pipettenspitze werden 30 µl 

Flüssigkeit aus Reservoir D gesaugt, um eine 

langsame Verteilung des Chemoattraktant innerhalb 

der Kammer zu erreichen. 

10. Anhang 83


Anhang F: Zusammensetzung des RPMI 1640 Mediums (FM-32L,C-C-Pro) 

10. Anhang 84


Anhang G: Zusammensetzung des DMEM Mediums (FM-58L,C-C-Pro) 

10. Anhang 85


Anhang H: Tabelle der verwendeten Geräte, Chemikalien und Verbrauchsmaterialien. 

Geräte 

Brutschrank, Modell Nr. 3336 Forma Scientific 

Brutschrank, HERAcell Heraeus 

Fluoreszenzmikroskop, Evos fl. Advanced Microscopy Group 

Fluoreszenzmikroskop, Eclipse Ti Nikon Co. 

Gasmischer, The Brick 

Kolbenhubpipetten, 10µl/20µl/100µl/200µl/1000µl Gilson Inc. 

Laser Scanning Mikroskop LSM 510 an Axiovert 200 Carl Zeiss 

Objektträgerheizsystem, TC02 ibidi GmbH 

Sterilbank HERAsafe HS12 Heraeus 

Zählkammer (Neubauer improved) Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 

Zellkulturmikroskop LSM 40 Carl Zeiss 

Zentrifuge, Universal 320 Andreas Hettich GmbH & Co. KG 

Chemikalien 

Collagen I (3mg/ml), PurCol Advanced Biomatrix Inc. 

Dimethylsulfoxid Sigma-Aldrich 

Dulbeccos' modified Eagle Medium, FM 58L C-C-Pro 

FiTC-Dextran Sigma-Aldrich 

Fluoreszenzfarbstoff, Alexa 488 Invitrogen 

fMLP Sigma-Aldrich 

G418 Sulfat PAA Laboratories GmbH 

Reinstwasser, MilliQ EMD Millipore Co. 

Minimal Essential Medium Sigma-Aldrich 

Maleimid-BSA, 3D-Life Cellendes GmbH 

Natriumkarbonat (7.5%) Sigma-Aldrich 

Natronlauge 1M Sigma-Aldrich 

Phosphat buffered saline C-C-Pro 

Polyethylenglycol, 3D-Life Cellendes GmbH 

Qgel, Ref. 1001 Qgel SA 

Qgel, Buffer A Qgel SA 

RGD-Peptid, 3D-Life Cellendes GmbH 

RPMI 1640 Medium, FM 32L C-C-Pro 

Thioglycerol, 3D-Life Cellendes GmbH 

Trypsin-EDTA Invitrogen 

Verbrauchsmaterialien 

µ-Slide Angiogenese ibidi GmbH 

µ-Slide Chemotaxis 3D ibidi GmbH 

Gewebekulturflaschen 75cm^2 Sarstedt AG & Co. 

Pipettenspitzen, Eppendorf Greiner Bio One GmbH 

Serotologische Einmalpipetten Sarstedt AG & Co. 

Zellkultur-Petrischalen 3,5cm, tissue culture treat Falcon, Becton-Dickinson 

10. Anhang 86


Zellkultur-Petrischalen 10cm Sarstedt AG & Co. 

Zentrifugenröhrchen 1,5ml Eppendorf AG 

Zentrifugenröhrchen 15ml/50ml Falcon, Becton-Dickinson 

10. Anhang 87


11. Literaturverzeichnis 

Adler, J. 1975. Chemotaxis in bacteria. Annu Rev Biochem 44: 341-56 

Becker, EL. 1977. Stimulated neutrophil locomotion: chemokinesis and chemotaxis. Arch 

Pathol Lab Med 101(10): 509-13. 

Bretscher, M. S. Moving membrane up to the front of 

migrating cells. Cell 85: 465–467 

Bray, D., White, J.G. Cortical flow in animal cells. Science 239: 883-88. 

Carter, S.B. 1967. Haptotaxis and the mechanism of cell motility. Nature 213: 256-60. 

Collins, S.J., Gallo, R., Gallager R. 1977. Continous growth and differentiation of human 

myeloid leukemic cells in suspension culture. Nature 270: 347 

Collins,S.J. , Ruscetti, F.W., Gallager, R.E., Gallo R.C. 1978. Terminal differentiation of 

human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar 

compounds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 2458-62. 

Collins, S.J. 1987. The HL-60 promyelocytic leukemia cell line: proliferation, differentiation 

and cellular oncogene expression. Blood 70: 1233-1244 

Engelmann, T.W. 1881. Pfüger's Arch. Gesamte Physiol. Menschen Tiere 25. 

Even-Ram, S., Yamada, K.M. 2005. Cell migration in 3D matrix . Current Opinion in Cell 

Biology 17:524–532 

Foxman, E.F., E.J. Kunkel und E.C. Butcher. 1999. Integration conflicting chemotactic 

signals. The role of memory in leukocyte navigation. J Cell Biol 147: 577-88. 

Friedl, P., Bröcker, E.-B. 2000. The biology of cell locomotion within 3-dimensional 

extracellular Matrix. Cell Mol Life Sci 57: 41–64. 

11.Literaturverzeichnis 88


Fisher, P.R., Merkl, R. und Gerisch, G. 1989. Quantitative analysis of cell motility and 

chemotaxis in Dictyostelium discoideum by using an image processing system and a 

novel chemotaxis chamber providing stationary chemical gradients. 

J cell Biol 108: 973-84 

Grinell, F. 1982. Migration of human neutrophils 

in hydrated Collagen lattices J. Cell Sci. 58, 95-108 

Jeon, N.L., Baskaran, H., Dertinger, S.K.W., Whitesides, G.M., Van de Water, L. and 

Toner, M. 2002. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin- 

8 formed in a microfabricated device. Nature biotechnology 20: 826-30. 

Kirkman-Brown, J.C., Sutton K.A. und H.M. Florman. 2003. How to attract sperm. Nat Cell 

Biol 5: 93-6 

Kőhidai L. 1995. Method for determination of chemoattraction in Tetrahymena pyriformis. 

Curr Microbiol 30: 251–3. 

Lefort, C. T., Kim, M. 2010. Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of 

Migration In Vitro. J. Vis. Exp. 40, e2017, DOI: 10.3791/2017 

Mato, J.M., Losada, A., Nanjundiah, V., Konijn, T. 1975. Signal input for a chemotactic 

response in the cellular slime mold Dictyostelium discoideum. Procl. Nat. Acad. Sci. 

USA 72: 4991-93. 

Martin, T.A., R. Mansel und W.G. Jiang 2001. Hepatocyte growth factor modulates vascular 

endothelial-cadherin expression in human endothelial cells. Clin cancer Res 7: 734-7. 

Pfeffer, W. 1884/1888. Untersuch. Bot. Inst. Tübingen 1+2. 363-482/582-661. 

Rasheed, S., W. A. Nelson-Rees, et al. 1974. Characterization of a newly derived human sar- 

coma cell line (HT-1080). Cancer 33: 1027-33. 



Riedl, J., Crevenna, A.H., Kessenbrock, K., Haochen, Yu, J., Neukirchen, D., Bista, M., 

Bradke, F., Jenne, D., A Holak, T., Werb Z., Sixt, M. and Wedlich-Soldne, R. 2008. 

Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods 5: 605-7. 

Roussos, ET.,Condeelis, JS., Patsialou A. 2011. Chemotaxis in Cancer. Nat Rev Cancer 11(8): 

573-87. 

Schiffman, E. 1982. Leukocyte chemotaxis. Ann Rev Physiol 44: 553-68. 

Singer, S. J., Kupfer, A. 1986. The directed migration of eukaryotic cells. Ann Rev Cell Biol. 

2: 337-65. 

Tranquillo, R.T., Lauffenburger, T.A., Zigmond, S.H. 1988. A stochastic model for leukocyte 

random motility and chemotaxis based on receptor binding fluctuations. J. Cell Biol. 

106: 303-9 

Weiner, O.D.,Servant G, Welch MD, Mitchison TJ, Sedat JW, Bourne HR. 1999. Spatial 

control of actin polymerization during neutrophil chemotaxis. Nat Cell Biol 1:75- 

81. 

Weiner, O.D. 2002. Regulation of cell polarity during eukaryotic chemotaxis: the 

chemotactic compass . Current Opinion in Cell Biology 14:196–202 . 

Zigmond, S.H. et al. 1981. Cell Polarity : An examination of its behavioral expression and its 

consequences for polymorphonuclear leukocyte chemotaxis . The journal of cell 

biology 89: 585-92. 

Devreotes, P.N., Zigmond, SH, 1988. Chemotaxis in eucaryotic cells: A focus on leukocytes 

and dictyostelium. Ann Rev Cell Biol. 4: 649-86 

Zigmond, S.H. 1977. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of 

chemotactic factors. J Cell Biol 75: 606-16. 



Selbstständigkeitserklärung 

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbsständig und nur unter Verwendung 

der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt habe: 

Ort, Datum Unterschrift 

Selbstständigkeitserklärung 91

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