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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Abbildung 18 zeigt, dass die gemessene Intensität nach drei Waschvorgängen für alle Gelkonzentrationen wieder auf, beziehungsweise teilweise sogar leicht unter der Hintergrundfluoreszenz des Collagens liegt. Die Form der beiden Graphen legt nahe, dass auch die Größe der verwendeten Sonde dabei keine Rolle spielt. Abbildung 18: Verlauf der gemessenen Fluoreszenz-Intensität während der Versuche für (A) Alexa 488 und (B) FiTC-Dextran in Collagen Matrizes unterschiedlicher Stärke. Die Messungen wurden immer unmittelbar vor den Waschvorgängen durchgeführt. Auf Grundlage der vorliegenden Messergebnisse wurde in den folgenden Versuchen davon ausgegangen, dass es zu keinen Interaktionen zwischen der Matrix und dem verwendeten Farbstoffen kommt. 4. Ergebnisse 39

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes 4.1.2. LSM - Messungen mit Alexa 488 und FITC-Dextran Bestimmung des Messprinzips: Um das Profil und die Stabilität eines Stoffgradienten im µ-Slide Chemotaxis 3D zu untersuchen, wurden definierte Konzentrationen der Fluoreszenzfarbstoffe Alexa 488 (stellvertretend für kleine Chemotaxine) und FiTC-Dextran (stellvertretend für große Chemotaxine) in die Reservoire eines Chemotaxis 3D-Slides eingebracht und die Konzentrationsentwicklung über den Kanalbereich in x-Richtung durch Messungen der Fluoreszenzintensität ermittelt. Der quadratische Bildausschnitt der Laser Scanning Mikroskops hatte mit dem verwendeten Apochromat 63x/1.4 Öl - Objektiv näherungsweise eine Seitenlänge von 146,25µm. Um den Kanal in seinem vollen Durchmesser von 1mm vermessen zu können, und zudem noch Werte für die Grenzregionen zu beiden Reservoire zu erhalten wurden 15 Bildausschnitte in x- Richtung aufgenommen und anschließend zusammengefügt. Durch die „tile scan“ Funktion der Software funktioniert das Verfahren des Tisches in passenden Schritten und das Zusammenfügen des Gesamtbildes automatisch. Dabei wird von einem festgelegten Mittelpunkt in gleichem Abstand in negativer wie positiver Richtung der jeweiligen Koordinatenachsen gemessen. Um die Statistik der Messung etwas zu erhöhen wurden in y- Richtung ebenfalls 2 Bildausschnitte aufgenommen. Die Größe des Gesamtbildes einer gemessenen Bilderserie ergab sich somit zu etwa 2193,73µm x 292,5 µm. Um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu den unterschiedlichen Zeiten zu gewährleisten wurde die Bilderreihe auf die Kanalmitte in x-Richtung und die fertigungsbedingte Fließlinie des Plastiks, die die Mitte des Kanals in y-Richtung markiert, zentriert. Obwohl das Laser Scanning Mikroskop bei dem verwendeten Pinhole-Durchmesser von 117 Å eine optische Schnittdicke von ~ 1µm ermöglicht, kommt es dennoch zu störenden Streueffekten von benachbarten fluoreszierenden Partikeln. Die Menge an unter- beziehungsweise übergelagerten Fluoreszenz-Partikeln ist abhängig von der z-Position der Betrachtungsebene. Um den durch Streueffekte entstehenden Messfehler einheitlich zu gestalten und die Vergleichbarkeit der zeitlich varianten Messungen zu gewährleisten, wurde die optische Schnittebene für alle gemessenen Proben 20µm unterhalb der oberen Grenzfläche des Kanals festgelegt. An der Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit im Kanal des Slides und dem darüber liegenden Kunststoff tritt ein Sprung im Brechungsindex auf. Der resultierende Unterschied im Interferenzmuster kann detektiert und visualisiert werden. Durch eine entsprechende 4. Ergebnisse 40

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