Download - Fakultät 06

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes
4.1.2. LSM - Messungen mit Alexa 488 und FITC-Dextran
Bestimmung des Messprinzips:
Um das Profil und die Stabilität eines Stoffgradienten im µ-Slide Chemotaxis 3D zu
untersuchen, wurden definierte Konzentrationen der Fluoreszenzfarbstoffe Alexa 488
(stellvertretend für kleine Chemotaxine) und FiTC-Dextran (stellvertretend für große
Chemotaxine) in die Reservoire eines Chemotaxis 3D-Slides eingebracht und die
Konzentrationsentwicklung über den Kanalbereich in x-Richtung durch Messungen der
Fluoreszenzintensität ermittelt.
Der quadratische Bildausschnitt der Laser Scanning Mikroskops hatte mit dem verwendeten
Apochromat 63x/1.4 Öl - Objektiv näherungsweise eine Seitenlänge von 146,25µm. Um den
Kanal in seinem vollen Durchmesser von 1mm vermessen zu können, und zudem noch Werte
für die Grenzregionen zu beiden Reservoire zu erhalten wurden 15 Bildausschnitte in x-
Richtung aufgenommen und anschließend zusammengefügt. Durch die „tile scan“ Funktion
der Software funktioniert das Verfahren des Tisches in passenden Schritten und das
Zusammenfügen des Gesamtbildes automatisch. Dabei wird von einem festgelegten
Mittelpunkt in gleichem Abstand in negativer wie positiver Richtung der jeweiligen
Koordinatenachsen gemessen. Um die Statistik der Messung etwas zu erhöhen wurden in y-
Richtung ebenfalls 2 Bildausschnitte aufgenommen. Die Größe des Gesamtbildes einer
gemessenen Bilderserie ergab sich somit zu etwa 2193,73µm x 292,5 µm.
Um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu den unterschiedlichen Zeiten zu gewährleisten
wurde die Bilderreihe auf die Kanalmitte in x-Richtung und die fertigungsbedingte Fließlinie
des Plastiks, die die Mitte des Kanals in y-Richtung markiert, zentriert. Obwohl das Laser
Scanning Mikroskop bei dem verwendeten Pinhole-Durchmesser von 117 Å eine optische
Schnittdicke von ~ 1µm ermöglicht, kommt es dennoch zu störenden Streueffekten von
benachbarten fluoreszierenden Partikeln. Die Menge an unter- beziehungsweise
übergelagerten Fluoreszenz-Partikeln ist abhängig von der z-Position der Betrachtungsebene.
Um den durch Streueffekte entstehenden Messfehler einheitlich zu gestalten und die
Vergleichbarkeit der zeitlich varianten Messungen zu gewährleisten, wurde die optische
Schnittebene für alle gemessenen Proben 20µm unterhalb der oberen Grenzfläche des Kanals
festgelegt. An der Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit im Kanal des Slides und dem darüber
liegenden Kunststoff tritt ein Sprung im Brechungsindex auf. Der resultierende Unterschied
im Interferenzmuster kann detektiert und visualisiert werden. Durch eine entsprechende
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