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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes entwickelt. In einem sehr kleinen Volumen, meist realisiert durch ein konfokales Mikroskop, wird die Fluktuation der Fluoreszenzintensität gemessen. Durch Laserlicht werden dabei einzelne fluoreszierende Partikel, die in das Beobachtungsvolumen eindiffundieren angeregt. Als Detektoren werden hier heute zumeist Avalanche-Photodioden eingesetzt, mit denen es möglich ist, einzelne Photonen zu erfassen. Die Abtastrate der Detektoren liegt in der Regel deutlich unter der Zeit, welche die Partikel zum durchqueren des Beobachtungsvolumens benötigen, so dass Signale einzelner Partikel bei aufeinanderfolgenden Abtastvorgängen mehrfach erfasst werden. Die durch FCS generierten Daten erfassen dadurch die Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit. Die gemessenen Intensitäten sind zeitlich korreliert, woher sich auch der Name des Verfahrens ableitet. Um die Mehrfachdetektion einzelner Teilchen in die Funktion einzubeziehen, wird sie nach einer festgelegten Formel mit sich selbst korreliert, man spricht hier von sogenannter Autokorrelation. Gibt man der zugehörigen Software die Diffusionskonstante und den Strukturparameter der diffundierenden Partikel als bereits definierte Werte an, kann durch die Messung die absolute Fluoreszenzintensität am Messpunkt zum vorliegenden Zeitpunkt bestimmt werden. Über einen Proportionalitätsfaktor lässt sich daraus die Molarität der Lösung am Messpunkt berechnen. Im Gegensatz zur Laser Scanning Mikroskopie kann der Beobachtungsbereich durch die FCS nicht gerastert werden und die Messung erfolgt an einzelnen Punkten. Die Aussagekraft der FCS-Messungen bleibt allerdings auf einen bestimmten Konzentrationsbereich fluoreszierender Partikel beschränkt, weshalb der Konzentrationsbereich der verwendeten Farbstoffe vor Beginn der Experimente eingegrenzt werden muss. Für die unter Punkt 4.1.3 beschriebenen Versuche wurde die Farbstoffkonzentration anhand eines bestehenden Verdünnungsgraphen so festgelegt, dass sowohl die Lösung für die hohe Konzentration C100, wie auch die Lösung für die niedrige Konzentration C0 in einem Konzentrationsbereich liegen, in dem ein linearer Zusammenhang zwischen der Anzahl der Fluoreszenzsignale der FCS-Messung [N] und der Molarität der Lösung [M] angenommen werden kann. 3.Material und Methoden 27

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Abbildung 11 zeigt die verwendeten Verdünnungsgraphen, die durch Messungen an Verdünnungsreihen einzelner wichtiger Fluoreszenzfarbstoffe durch Mitarbeiter des Lehrstuhls für Biophysik von Herrn Prof. Dr. Joachim Rädler an der Ludwig Maximilians Universität München entstanden sind. Abbildung 11: Verdünnungsgraphen verschiedener Fluorophore. Der Bereich zwischen den beiden gestrichelten Linien deutet das Spektrum zwischen C0 [1nM] und C100 [50nM] des verwendeten Farbstoffes Alexa 488 an. [zur Verfügung gestellt vom Lehrstuhl für Biophysik, Dr. J. Raedler, LMU- München, 2011] Die Konzentration für C100 wurde auf 50nM festgelegt, die Konzentration für C0 auf 1nM, um eine klare Abhebung von der Autofluoreszenz der zur Verdünnung verwendeten PBS zu erhalten. Der lineare Verlauf des Verdünnungsgraphen für Alexa 488 für den Bereich zwischen den beiden verwendeten Konzentrationen ist in Abbildung 11 durch die gestrichelten roten Linien dargestellt. 3.Material und Methoden 28

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