Aufrufe
vor 4 Jahren

Download - Fakultät 06

Download - Fakultät 06

Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Zellkulturflaschen (gelber Verschluss, Cell+) in DMEM-Medium (C-C-Pro) mit 10% FCS kultiviert. Die genaue Zusammensetzung des Mediums findet sich in Anhang G auf Seite 100. Im Folgenden darf davon ausgegangen werden, dass DMEM soweit nicht anders beschrieben immer mit 10% FCS verwendet wurde. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in einem Brutschrank bei 37°C und 5% CO2. Im Abstand von 2 Tagen wurde die Konfluenz der Zellen unter dem Phasenkontrastmikroskop überprüft. Das Wachstum von HT-1080 Zellen ist weitgehend unabhängig von Zell-Zell Kontakten [Collins, 1978]. Um die Zellzahl dennoch stabil zu halten, wurde versucht die Zellen stets so lange in einer Flasche zu kultivieren bis die Zellschicht zu mindestens 80% optisch konfluent war. Anschließend wurden die Zellen in den Kulturflaschen mit 10 ml PBS gewaschen Zellen und nach Absaugen des PBS durch Trypsinierung mit 2ml Trypsin-EDTA vom Flaschenboden gelöst. Die gelösten Zellen wurden mit 10 ml DMEM versetzt und anschließend, abhängig von der Zelldichte in einem Verhältnis etwa 1:4 mit frischem Medium verdünnt. Auf diese Weise wurde die Zellzahl bei etwa 1x10 5 bis 1x10 6 Zellen stabil gehalten. Die überschüssigen Zellen wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 1500 RPM wieder vom Medium getrennt und abhängig von der vorhandenen Gesamtzellmenge in etwa 500µl DMEM resuspendiert um eine finale Zellzahl von ungefähr 1,7x10 7 Zellen für Chemotaxisexperimente zu erhalten. Die mit LifeAct transfizierten Zellen wurden aufgrund des langsameren Wachstums in der Regel nur im Verhältnis 1:2 verdünnt. Zusätzlich wurde hier dem Medium noch G418-Sulphat in einer Konzentration von 375µg/ml zugefügt, um den Selektionsdruck auf die transfizierten Zellen aufrecht zu erhalten. 3.Material und Methoden 23

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes 3.3. Mikroskopietechniken 3.3.1. Zellmikroskopie 3.3.1.1. Nieder- und Hochaufgelöster Phasenkontrast Ein Großteil der Bilder, die als Rohdaten zur Auswertung der Experimente dienten, wurde nach dem Phasenkontrastverfahren aufgenommen. Dazu wurde das inverse Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse Ti mit den Objektiven Plan Fluor 4x/0.13 und Planfluor 10x/0.3 verwendet. Die Bilddaten wurden mit der 5Mhz CCD-Kamera MicroMax der Firma Princeton Instruments mit einer Farbtiefe von 16 bit generiert. Die Belichtungszeit der Aufnahmen betrug im Schnitt etwa 30ms unter einer Leistung der Dia-Lampe von 30 Watt bei 6V Spannung. Um Detailaufnahmen von Zellen zu erzeugen wurde das Objektiv Plan ApoVC 60x/1.4 mit Immersionsöl verwendet. Mikroskop und Peripherie wurden etwa 1 Stunde vor Versuchsbeginn eingeschaltet, um Einflüsse auf die Versuchsdaten durch Abwärme zu normalisieren. 3.3.1.2. Fluoreszenzmarkierung mit LifeAct-tag GFP2/RFP Um bei den chemotaktischen Experimenten einen Blick in die Vorgänge im inneren der Zelle zu ermöglichen wurden Zellen verwendet, die mit dem sogenannten LifeAct-tag GFP2/RFP transfiziert waren. Das LifeAct-tag ist ein 17 Aminosäuren langes Protein, dass es ermöglich Fluoreszenzmarker wie GFP2 oder RFP an die Aktinfilamente (F-Aktin) in Zellen anzulagern, ohne die Dynamik des Aktinmoleküls dadurch zu beeinträchtigen. [Riedl, 2008] Abbildung 9 zeigt schematisch den Aufbau eines Aktin-Filaments das mit LifeAct markiert wurde. Abbildung 9: Schematischer Aufbau von F-Aktin mit LifeAct-tag GFP2/RFP [modifiziert aus Produktflyer, Ibidi GmbH, 2011] 3.Material und Methoden 24

Das Programm zum Download - Fakultät für Elektrotechnik und ...
Download Broschüre - Fakultät für Architektur - TUM
als Download - Fakultät Rehabilitationswissenschaften - TU Dortmund
Hochschultage Istanbul 2009 Download Präsentation - Fakultät für ...
Download Ausgabe 06/2009 - Deutscher Verband für Fotografie
Download Focus Werbebarometer 06/2013 - Gewista
Download: 06 Fliesenprofile - Repac
Download: 06 Fliesenprofile - Repac
Download lag-report 06 (2004) - Landesarbeitsgemeinschaft ...
Download 06 Jun - Lokale Zeitung Memmingen
Download Heft 06 / Juni 2011 - Tutzinger Nachrichten
Artikel aus der Zeitschrift tuph 01/06 downloaden - Kilian-emmerling ...
Kostenloser Download aus unserem Online-Archiv Ausgabe 06/2012