Download - Fakultät 06

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes
3.3. Mikroskopietechniken
3.3.1. Zellmikroskopie
3.3.1.1. Nieder- und Hochaufgelöster Phasenkontrast
Ein Großteil der Bilder, die als Rohdaten zur Auswertung der Experimente dienten, wurde
nach dem Phasenkontrastverfahren aufgenommen. Dazu wurde das inverse
Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse Ti mit den Objektiven Plan Fluor 4x/0.13 und Planfluor
10x/0.3 verwendet. Die Bilddaten wurden mit der 5Mhz CCD-Kamera MicroMax der Firma
Princeton Instruments mit einer Farbtiefe von 16 bit generiert. Die Belichtungszeit der
Aufnahmen betrug im Schnitt etwa 30ms unter einer Leistung der Dia-Lampe von 30 Watt bei
6V Spannung. Um Detailaufnahmen von Zellen zu erzeugen wurde das Objektiv Plan ApoVC
60x/1.4 mit Immersionsöl verwendet. Mikroskop und Peripherie wurden etwa 1 Stunde vor
Versuchsbeginn eingeschaltet, um Einflüsse auf die Versuchsdaten durch Abwärme zu
normalisieren.
3.3.1.2. Fluoreszenzmarkierung mit LifeAct-tag GFP2/RFP
Um bei den chemotaktischen Experimenten einen Blick in die Vorgänge im inneren der Zelle
zu ermöglichen wurden Zellen verwendet, die mit dem sogenannten LifeAct-tag GFP2/RFP
transfiziert waren. Das LifeAct-tag ist ein 17 Aminosäuren langes Protein, dass es ermöglich
Fluoreszenzmarker wie GFP2 oder RFP an die Aktinfilamente (F-Aktin) in Zellen anzulagern,
ohne die Dynamik des Aktinmoleküls dadurch zu beeinträchtigen. [Riedl, 2008]
Abbildung 9 zeigt schematisch den Aufbau eines Aktin-Filaments das mit LifeAct markiert
wurde.
Abbildung 9: Schematischer Aufbau von F-Aktin mit LifeAct-tag GFP2/RFP [modifiziert aus
Produktflyer, Ibidi GmbH, 2011]
3.Material und Methoden 24