Download - Fakultät 06

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes
durch einen beugungsbegrenzten Lichtfleck beleuchtet wird. Das Gesamtbild wird durch
Rasterscannung des Beobachtungsbereichs erzeugt. Durch die Verwendung eines Lasers als
Lichtquelle, lässt sich kohärentes Licht einer definierten Wellenlänge erzeugen, dass genutzt
wird, um fluoreszierende Partikel im untersuchten Medium anzuregen. Das Licht wird dabei
über ein Objektiv in die Probe hineinfokussiert. Die Partikel im Bereich des Anregungsfokus
werden zur Fluoreszenz angeregt und das emittierte Licht wird über dasselbe Objektiv
zurückgeleitet und wird über eine Lochblende (pinhole) auf einen Detektor geführt.
Anregendes und emittiertes Licht werden dabei über einen Strahlteiler aufgetrennt, so dass
nur Emissionslicht auf den Detektor trifft. Anregungsfokus und Detektionsfokus liegen nach
diesem Prinzip übereinander, also konfokal, woher sich auch der Name ableitet.
In Abbildung 10 ist das Prinzip des Verfahrens schematisch dargestellt.
Abbildung 10: Schematische Darstellung des konfokalen Prinzips. Bei der LSM wird als Lichtquelle ein
Laser verwendet.[aus: Commons: Bilder zum Funktionsweise des konfokalen Prinzips, Stand September
2011]
Das Verfahren hat den Vorteil, dass vorwiegend Partikel angeregt werden, die im
Anregungsfokus liegen. Licht von Partikeln außerhalb des Anregungsfokus wird nicht auf die
Lochblende fokussiert, so dass ein Großteil davon vom Detektor nicht erfasst wird. Dadurch
lässt sich eine sehr geringe Schärfentiefe erzielen, wodurch sich das Auflösungsvermögen in
z-Richtung deutlich erhöht. So können relativ präzise Aussagen über die ortsabhängige
Verteilung der Fluoreszenzintensität in einer Probe gewonnen werden.
3.3.2.2. Fluoreszenz-Korrelations Spektroskopie
Die Fluoreszenz-Korrelations Spektroskopie wurde in den 1970er Jahren von Watt W. Webb,
Elliot Elson und Douglas Magde als Verfahren zur Messung von Diffusionskonstanten
3.Material und Methoden 26