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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Die angehängten fluoreszierenden Proteine GFP2 und RFP besitzen Anregungsmaxima bei Wellenlängen von 483nm (GFP2) und 555nm (RFP) sowie Emissionsmaxima bei 506nm (GFP2) und 584nm (RFP). Für die Aufnahmen wurde das unter 3.3.1.1. beschriebene inverse Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse Ti mit einem Plan ApoVC 60x/1.4 Objektiv verwendet. Als Anregungsquelle wurde eine Nikon Intensilight Quecksilberhochdrucklampe verwendet. Das verwendete Filterset für Versuche mit GFP2 war FiTC mit einem Anregungsspektrum von 465-495 nm und einem Emissionsspektrum von 515-555 nm. Für RFP wurde TxRed mit einem Anregungsspektrum von 540-580 nm und einem Emissionsspektrum von 600-660 nm verwendet. Die Belichtungszeit war in allen Fällen 500ms. Die Zellen konnten nur über einen sehr begrenzten Zeitraum verfolgt werden, weil die auftretenden Bleichungseffekte sonst zu stark waren. Von HT-1080-Zellen wurden Aufnahmen in einem Intervall von 10 Minuten, für HL-60 Zellen in einem Intervall von 2 Minuten aufgezeichnet. 3.3.2. Diffusionsstudien Um die Entwicklung eines Stoffgradienten im µ-Slide Chemotaxis 3D untersuchen zu können, wurde mit fluoreszierenden Farbstoffen gearbeitet. Verwendet wurden dazu die Fluoreszenzfarbstoffe Alexa 488 (Invitrogen) und FITC-Dextran (Sigma-Aldrich). Das Molekulargewicht von Alexa entspricht mit 643 Da in etwa demjenigen von fMLP (437.55 Da), womit es stellvertretend für Chemotattraktant kleiner Molekülgröße betrachtet werden kann. FITC-Dextran soll mit einem Molekulargewicht von etwa 18 kDa stellvertretend für Experimente mit Chemoattraktant großer Molekülgröße verwendet werden. Um den Verlauf des Farbstoffgradienten über den Kanalquerschnitt unabhängig von gestreutem Licht und der Hintergrundfluoreszenz des umgebenden Materials zu gestalten, mussten dazu mikroskopische Verfahren gewählt werden, die es ermöglichen, ein horizontales Konzentrationsprofil durch einen Schnitt mit möglichst geringer z-Koordinate zu erstellen. 3.3.2.1. Konfokale Laser Scanning Mikroskopie Die Konfokale Laser Scanning Mikroskopie ist eine besondere Form der von Marvin Minsky in den 1950er Jahren entwickelten Konfokal-Mikroskopie zur Anwendung mit Fluoreszierenden Proben. Die Besonderheit der konfokalen Mikroskopie liegt darin, dass im Gegensatz zu konventionellen Mikroskopen immer nur sehr kleiner Bereich des Präparats 3.Material und Methoden 25

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes durch einen beugungsbegrenzten Lichtfleck beleuchtet wird. Das Gesamtbild wird durch Rasterscannung des Beobachtungsbereichs erzeugt. Durch die Verwendung eines Lasers als Lichtquelle, lässt sich kohärentes Licht einer definierten Wellenlänge erzeugen, dass genutzt wird, um fluoreszierende Partikel im untersuchten Medium anzuregen. Das Licht wird dabei über ein Objektiv in die Probe hineinfokussiert. Die Partikel im Bereich des Anregungsfokus werden zur Fluoreszenz angeregt und das emittierte Licht wird über dasselbe Objektiv zurückgeleitet und wird über eine Lochblende (pinhole) auf einen Detektor geführt. Anregendes und emittiertes Licht werden dabei über einen Strahlteiler aufgetrennt, so dass nur Emissionslicht auf den Detektor trifft. Anregungsfokus und Detektionsfokus liegen nach diesem Prinzip übereinander, also konfokal, woher sich auch der Name ableitet. In Abbildung 10 ist das Prinzip des Verfahrens schematisch dargestellt. Abbildung 10: Schematische Darstellung des konfokalen Prinzips. Bei der LSM wird als Lichtquelle ein Laser verwendet.[aus: Commons: Bilder zum Funktionsweise des konfokalen Prinzips, Stand September 2011] Das Verfahren hat den Vorteil, dass vorwiegend Partikel angeregt werden, die im Anregungsfokus liegen. Licht von Partikeln außerhalb des Anregungsfokus wird nicht auf die Lochblende fokussiert, so dass ein Großteil davon vom Detektor nicht erfasst wird. Dadurch lässt sich eine sehr geringe Schärfentiefe erzielen, wodurch sich das Auflösungsvermögen in z-Richtung deutlich erhöht. So können relativ präzise Aussagen über die ortsabhängige Verteilung der Fluoreszenzintensität in einer Probe gewonnen werden. 3.3.2.2. Fluoreszenz-Korrelations Spektroskopie Die Fluoreszenz-Korrelations Spektroskopie wurde in den 1970er Jahren von Watt W. Webb, Elliot Elson und Douglas Magde als Verfahren zur Messung von Diffusionskonstanten 3.Material und Methoden 26

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