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3.2. Zellkultur

3.2. Zellkultur Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes 3.2.1. Kultivierung und Differenzierung von HL-60 Zellen Kultivierung der Zellen Für chemotaktische Experimente standen HL-60 Leukämie-Zellen vom Wildtyp und transfiziert mit LifeAct-tag GFP zur Verfügung. Beide Varianten wurden in 75 cm 2 Zellkulturflaschen (roter Verschluss) mit RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin der Firma C-C Pro kultiviert. Die genaue Zusammensetzung des Mediums ist in Anhang F auf Seite 99 dargestellt. Dem Medium wurden nachträglich 10% Foetales Kälberserum (FCS) und 1% Penicilin-Streptomycin Lösung hinzugefügt. Soweit nicht anders dargestellt, kann im Folgenden davon ausgegangen werden, dass RPMI 1640 Medium immer mit den beschriebenen Zusätzen verwendet wurde. Die Zellen wurden in einer bestehenden Suspensionskultur der Passage 3 übernommen und in einem Brutschrank bei 37° C und 5% CO2 stabil auf einer Zellzahl von etwa 1x10 6 Zellen/ml gehalten. Die Zelldichte wurde dazu im 2-Tagesrythmus mit dem Phasenkontrastmikroskop überprüft. Anschließend wurden die Zellen mit einer Neubauer Kammer improved ausgezählt und abhängig von der Zelldichte in einem Verhältnis von 1:4 bis 1:6 verdünnt und mit frischem Medium versorgt. Ein Unterschied zwischen dem Wildtyp und der transfizierten Variante war dabei nicht zu erkennen. Differenzierung der Zellen HL-60 Zellen können durch Zugabe polarer Stoffe zu eingeschränkt funktionalen neutrophilen Granulozyten differenziert werden. Zur Differenzierung wurden Zellen einer Dichte von 1x10 6 Zellen/ml in 3,5 ml RPMI 1640 Medium mit 1,3% DMSO aufgenommen. Die Zellen teilen sich während der Differenzierung kaum, so dass für nachfolgende Berechnungen von einer Absolutmenge von 3,5 x 10 6 Zellen ausgegangen werden konnte. Für die Differenzierung wurden Petrischalen der Firma BD mit einem Durchmesser von 3,5 cm und der Oberflächenbeschichtung tissue culture treat verwendet. Die Beschichtung diente dazu, die Anzahl adhärenter Zellen so niedrig wie möglich zu halten, da diese beim Entnehmen der Flüssigkeit nicht erfasst wurden und dadurch nicht für die anschließenden Chemotaxis Versuche verwendet werden konnten. Die Differenzierung der Zellen lieferte die besten Ergebnisse nach einem Zeitraum von 4-6 Tagen, was sich mit den Vorgaben aus der Literatur deckt. [Collins, 1987] Der Erfolg der Differenzierung wurde anhand der 3.Material und Methoden 21

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Morphologie der Zellen und dem Anteil adhärenter Zellen an der Gesamtzellmenge überprüft. Differenzierte Neutrophilen-ähnliche Zellen sind segmentkernig, etwas kleiner als undifferenzierte Zellen und adhärent. Die Morphologischen Unterschiede zwischen differenzierten und undifferenzierten Zellen sind in Abbildung 8 dargestellt. Abbildung 8:Morphologisches Erscheinungsbild von (A) undifferenzierten HL-60 Zellen und (B) HL-60 Zellen nach 6 Tagen in 60mM DMSO. [Wright-Giemsa Färbung, Collins, 1978] Es wurden durchwegs bessere Ergebnisse erzielt, wenn die Zellen während der Differenzierung nach 2-3 Tagen durch Zentrifugieren bei 1500 RPM für 5min vom übersäuerten Medium getrennt und anschließend in frischem Medium resuspendiert wurden. Nach demselben Prinzip wurden die Zellen nach erfolgter Differenzierung vom Medium getrennt, mit 5ml PBS gewaschen und in 175 µl Hanks Buffered Salt Solution aufgenommen, um eine finale Konzentration von 1,7x10 7 Zellen zu erhalten. Ausgehend von dieser Lösung konnten Chemotaxis-Experimente an den Zellen durchgeführt werden. 3.2.2. Kultivierung von HT-1080 Zellen Für die Chemotaxisexperimente an HT-1080 Fibrosarkom-Zellen wurden anfangs Zellen vom Wildtyp verwendet. Etwa ab der Hälfte der durchgeführten Versuche wurde mit einer mit LifeAct-tag RFP transfizierten Variante gearbeitet. Hierbei ist anzumerken, dass die transfizierten Zellen etwa um den Faktor 1,5 erhöhte Generationszeiten aufweisen. Das Vorgehen bei der Kultivierung und das Verhalten in Chemotaktisexperimenten waren jedoch für beide Zellinien identisch. HT-1080 Wildtyp Zellen wurden in Passage 11 übernommen, die LifeAct-tag RFP transfizierten Zellen wurden ab Passage 2 weitergeführt. Beide Zelllinien wurden in 75 cm 2 3.Material und Methoden 22

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