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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes 5. Diskussion und Ausblick 5.1. Bewertung der Ergebnisse 5.1.1. Diffusionsmessungen Obwohl die LSM Messungen durch fehlende Referenzmessungen in ihrer Aussagekraft eingeschränkt wurden lassen sich daraus einige wichtige Erkenntnisse ableiten. Durch die Verwendung der Slow-method , liegt die Konzentration C100 nicht von Anfang an am linken Rand des Kanals an. In Folge interner Diffusionsvorgänge im Reservoir von C100 kommt es dadurch zu einer Schrittweisen Etablierung des Gradienten. Dieser Vorgang kann anhand der deutlich flacher verlaufenden Kurven der 1-Stunden Messungen in Abbildung 22, unter Punkt 4.1.2. auf Seite 44 abgeschätzt werden Diese Beobachtung lässt vermuten, dass die Etablierung des Gradienten schon innerhalb weniger Stunden abläuft. Alle weiteren gemessenen Konzentrationsprofile sind annähernd deckungsgleich In Folge des 2. Fick’schen Gesetzes müsste sich in Folge der Diffusion mit der Zeit ein Konzentrationsausgleich und damit ein Abflachen des linearen Bereichs der Kurvensteigungen aus Abbildung 22 um einen Drehpunkt bei etwa 50% von C100 einstellen. Damit ergibt sich für den erwarteten Verlauf der Konzentrationsprofile ein Muster, wie schematisch in Abbildung 38 dargestellt. Abbildung 38: Schematische Darstellung der erwarteten Konzentrationsverläufe. Aufgetragen sind Erwartungswerte (A) nach vollständiger Etablierung des Gradienten (t~12h) bis (D) kurz vor Einstellung des Konzentrationsgleichgewichts. 5. Diskussion und Ausblick 65

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Es ist wahrscheinlich, dass sich die Konzentration nicht exakt um den beschriebenen Drehpunkt einpendelt, weil die beiden Reservoire C0 und C100 in Folge interner Diffusionsvorgänge keine optimale Quelle beziehungsweise Senke darstellen, aber ein Abflachen der Kurvensteigung sollte zu beobachten sein. Dieser Rückgang ist im Rahmen des Messfehlers der gesammelten Daten nicht erkennbar. Referenzmessungen in allen Kammern wären für jeden Slide notwendig gewesen. Der damit verbundene zeitliche Aufwand war jedoch zu groß für das zur Verfügung stehende Zeitkontingent. Obwohl die Messungen am LSM für eine detaillierte Messung der Entwicklung des Konzentrationsprofils im zellbiologisch relevanten Zeitraum von 48 Stunden zu störanfällig sind, konnte mit ihrer Hilfe gezeigt werden, dass der Gradient im Chemotaxis 3D-Slide nach anfänglicher Etablierung für mindestens 36 Stunden konstant bleibt und unabhängig von der verwendeten Gelmatrix verläuft. Ähnlicher Ergebnisse bei der Verwendung von Farbstoffen stark unterschiedlicher Molekülgrößen legen nahe, dass der Durchmesser der diffundierenden Partikel keinen Einfluss auf die Form des Gradienten hat. Durch FCS Messungen konnten schließlich Etablierung und Verlauf des Gradienten detailliert gezeigt werden. Auch hier ist erkennbar, dass die Verwendung unterschiedlich stark vernetzter Gelmatrizes keine Rolle spielt. Es konnte gezeigt werden, dass, wie anhand der LSM Ergebnisse vermutet, die Etablierung des Gradienten zu einem Großteil schon innerhalb der ersten 1-2 Stunden stattfindet. In Folge des Konzentrationsausgleichs nach dem 2. Fick’schen Gesetz konnte eine leichte Abnahme des Gradienten nach 24 Stunden festgestellt werden, die sich aber in einem von den Zellen vermutlich nicht wahrnehmbaren Bereich abspielt. Für Chemotaxisexperimente ergibt sich damit ein Zeitraum von 1-48 Stunden, in welchem, bezogen auf den Gradienten, einheitliche Bedingungen angenommen werden können. 5.1.2. Chemotaxis-experimente mit HT-1080 und HL-60 Zellen Parallel durchgeführte Experimente mit HT-1080 Zellen zeigen deutlich und reproduzierbar, dass die Zellen fähig sind in den µ-Slides Chemotaxis 3D über einen Zeitraum von mehr als 24-Stunden, als Reaktion auf einen chemotaktischen Stimulus, durch eine Gelmatrix zu migrieren. Um bestimmten zu können, ob Unterschiede im Migrationsverhalten der Zellen im Gel im Vergleich zur 2-dimensionalen Migration auf einer Oberfläche auftreten, wurden die unter Punkt 4.2.1.1. beschriebenen Daten mit einem bestehenden Datensatz von 2d- Migrationsdaten verglichen. Abbildung 39 stellt dazu die Verlagerung des Massenschwerpunkts (COM) in x- und in y- 5. Diskussion und Ausblick 66

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