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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Das Füllschema der Slides für Experimente mit Positiv- und Negativkontrolle ist in Abbildung 15 dargestellt. Abbildung 15: Schematische Darstellung der Verteilung der Chemoattraktand-Konzentrationen für Chemotaxis Versuche mit Kontrollexperimenten. Für HT-1080 Zellen wurde bei der Zusammenstellung der Gele für das Chemotaxis- Experiment und die Negativkontrolle DMEM ohne FCS verwendet. Die Positiv-Kontrolle enthielt DMEM mit 60% FCS, um nach einer Verdünnung im Rahmen des, in Anhang D gezeigten Pipettierschemas, auch im Kanalbereich an eine finale Konzentration von 10% FCS zu erhalten. Die verwendete Gelmatrix schließt Konvektionsströmungen zwischen den Reservoirs aus. Dadurch kann unmittelbar nach Aushärten des Gels ein Reservoir mit Chemoattraktant gefüllt werden ohne dass es zu Vermischung im Kanalbereich kommt. Dieses Vorgehen wird als „fast Method“ bezeichnet. In einem Großteil der beschriebenen Versuche wurden jedoch zuerst beide Reservoirs mit 60µl des Hungermediums C0 gefüllt. Anschließend wurden 30µl einer Chemoattraktant- Lösung mit doppelter Konzentration auf einen der beiden Einfüllstutzen des linken Reservoirs pipettiert. Durch Absaugen von 30µl Flüssigkeit aus dem anderen Stutzen mit einer Pipettenspitze wurde das Chemoattraktant in das Reservoir gesaugt. Der Gradient sollte so schonender und mit geringer zeitlicher Verzögerung etabliert werden. Das Vorgehen nach dieser Methode wird als „slow method“ bezeichnet. Ausführliche Beschreibungen der beiden Methoden finden sich in Anhang E, auf Seite 82f. Um die Bedingungen für die Zellen während der Experimente möglichst optimal zu halten, wurden die Slides während der Laufzeit des Experimentes unter dem Mikroskop in eine, von der Firma Ibidi eigens dafür entwickelte Heizplatte mit ebenfalls beheizbarer Abdeckhaube gelegt. Die Temperatur der Bodenplatte war auf 41.5°C die Temperatur der Abdeckhaube auf 43.5°C eingestellt, was einer Temperatur der Atmosphäre innerhalb dieser Kammer von etwa 3.Material und Methoden 33

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes 37°C entsprach. Durch einen Gasmischer kombiniert mit einem System zur Erhöhung der Luftfeuchte, wurde Luft mit 5% CO2 in die Heizkammern geleitet. Die Bilddaten wurden auf dem unter 3.3.1.1. beschriebenen Phasenkontrastmikroskop generiert. Zur genauen Positionierung der Kammern und um Daten für Experimente in mehreren Kammern parallel erzeugen zu können, wurde ein software-gesteuerter automatischer Tisch mit programmierbarer Positionsliste genutzt. Die Zeitrafferaufnahmen wurden unter Verwendung der, auf dem Programm ImageJ basierenden Software, Micromanager Version 1.4 erzeugt. Für HT-1080 Zellen war der Beobachtungszeitraum in der Regel über 24 Stunden, bei einem Aufnahmeintervall von 10 Minuten. HL-60 Zellen wurden 3 Stunden lang bei einem Aufnahmeintervall von 1 Minute beobachtet. 3.5.2. Auswertung und Datenanalyse Zell-Tracking Die Bilddaten aus den Versuchen wurden mit dem Manual-Tracking Plugin des Programms ImageJ ausgewertet. Dazu wurde die Bilderserie des Experiments in den Zwischenspeicher des Programms geladen. Bei Verwendung des Manual-Tracking Plugin wurden für jedes Bild nacheinander die Zentren der einzelnen Zellen mit dem Cursor markiert, so dass die Software nach Abschluss einer Bilderserie daraus die Spur der Zellbewegungen darstellen konnte. Das Ergebnis des Manual Tracking ist in Abbildung 16 beispielhaft dargestellt. Abbildung 16: Vergleich der Phasenkontrastbilder unmittelbar nach Start des Experiments und nach 50 Minuten mit farbig markierten Zellspuren. 3.Material und Methoden 34

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