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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Um den Zellen die notwenigen Bindungsmotive zu liefern, wurde den Gelen RGD-Peptid in einer Konzentration von 0.1mM bis 1mM beigemischt. Die Polymerisationszeit des Gele lag im Bereich weniger Minuten, weswegen zur Verwendung in den µ-Slides immer mit der niedrigsten verfügbaren Konzentration von 2.5mg/ml Maleimid-BSA gearbeitet wurde. Die Polymerisationszeit des Gels war außerdem abhängig vom pH-Wert der Lösung. Vom Hersteller wurden aus diesem Grund zwei Puffer mit den pH-Werten 5.5 und 7.4 mitgeliefert. Obwohl damit eine leichte Abweichung vom physiologischen pH-Wert der Zellen eintrat, wurde für die vorgestellten Versuche immer bei einem pH-Wert von 5.5 gepuffert, um die Polymerisationszeit zu verlängern. Aus den Pipettierschemata des Herstellers, in denen dieser Fall nicht beschrieben war, wurden die Mengenangaben für Gele der höchsten Verdünnung unter Verwendung von RGD-Peptid errechnet. Die Zusammensetzung ist für eine RGD-Konzentration von 1mM im Folgenden beispielhaft dargestellt. Maleimid-BSA 2.5mg/ml mit 1mM RGD-Peptid Wasser 6.25µl 10xCBpH5.5 2.5µl Maleimid-BSA 2.5µl RGD-Peptid (3mM) 10µl Zellsuspension 5.0µl CD-Link 3.75µl Total 30µl Um mehrere Kanäle befüllen zu können, wurde die Lösung vor Hinzufügen des CD-Link gleichmäßig aufgeteilt und einzeln fertiggestellt. Nach Einfüllen des CD-Link wurde die Lösung mit der verwendeten Pipettenspitze schnell durchmischt und unmittelbar danach in die Kanäle des µ-Slides eingefüllt. Nach etwa 5-10 Minuten im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 waren die Gele bereits vollständig polymerisiert. Die vollständigen Verdünnungstabellen des Herstellers sind in Anhang B und C auf den Seiten 95 und 96 zu finden. 3.Material und Methoden 31

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes 3.5. Chemotaxis mit HL-60 und HT-1080 3.5.1. Durchführung der Experimente Zur Chemotaxis-Analyse wurden 6 µl der jeweiligen Zellen in einer Gelmatrix in die Kanäle des µ-Slides Chemotaxis 3D gefüllt. Nach der Polymerisationszeit des Gels wurde Chemoattraktant in die Reservoire der Slides gefüllt. Das genaue Vorgehen bei dem Befüllen der Slides ist in Anhang E auf Seite 97 beschrieben. Das Befüllschema war hier jeweils abhängig davon, welche Parameter bei dem Experiment untersucht wurden. Zur Ermittlung der notwendigen Konzentration an Chemoattaktand wurden die linken Reservoire der Kammern mit einer steigenden Chemoattraktand Konzentration befüllt. Die Aufteilung der verschiedenen Chemoattraktant-Konzentrationen ist in Abbildung 14 schematisch dargestellt. Abbildung 14: Schematische Darstellung der Verteilung der Chemoattraktant Konzentrationen auf die Kammern des µ-Slides Chemotaxis 3D zur Ermittlung der einzusetzenden Dosis. Um bei einer festgelegten Konzentration von Chemoattraktant die Chemotaxis-Analyse gegen zufällig auftretende Effekte abzusichern, wurde ein Vergleich mit einer Positiv- und einer Negativkontrolle durchgeführt. Die Positivkontrolle beinhaltet die Verwendung einer Lösung mit hoher Konzentration an Chemoattraktant in beiden Reservoirs. Die Negativkontrolle wird mit chemoattraktant-freiem Medium in beiden Reservoirs durchgeführt. 3.Material und Methoden 32

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