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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes 3.4. Verwendete Gelmatrizes 3.4.1. Collagen Bei einem Großteil der in dieser Arbeit vorgestellten Chemotaxisexperimente wurde eine Matrix aus bovinem Typ I Collagen (Sigma-Aldrich) verwendet. Die Collagen-Lösung wurde in der kommerziell erhältlichen Form einer Stammlösung mit 3mg/ml bei 4°C gelagert. Für die Chemotaxis Experimente wurden Gele nach firmeneigenem Protokoll der Firma Ibidi gefertigt. Die vorgegebene Zusammensetzung ist so eingestellt, dass der pH-Wert der Lösung mit 7.4 bis 7.6 nahe dem physiologischen pH der verwendeten Zellen liegt. In den meisten Fällen wurde eine Gelmatrix mit 1.5mg/ml und DMEM für HT-1080 Zellen und 1.0 mg/ml und RPMI 1640/MEM für HL-60 Zellen verwendet. Eine vollständige Auflistung aller zum Einsatz gekommenen Gelzusammensetzungen findet sich in Anhang D. Nach dem Pipettieren der Bestandteile wurde die Lösung gründlich vermischt, damit es trotz der hohen Viskosität des Collagens zu einer gleichmäßigen Verteilung der Zellen in der Lösung kam. Anschließend wurden 6 µl der Collagen-Lösung in die Kanäle des µ-Slides Chemotaxis 3D eingefüllt und im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 für etwa 45 Minuten polymerisiert. Abschließend wurde die Regelmäßigkeit der Faserstruktur des Collagens unter dem Phasenkontrastmikroskop überprüft. 3.4.2. Synthetische Hydrogele Die Möglichkeit zur Verwendung komplett synthetischer Matrizes in den µ-Slides Chemotaxis 3D wurde anhand von 2 kommerziell erhältlichen Hydrogelen überprüft. 3D-Matrix der Firma Qgel: Bei der 3-D Matrix der Firma Qgel handelt es sich um ein PEG Gerüst, dessen zellphysiologische Eigenschaften aus vorgefertigten Sets an Zusatzkomponenten ausgewählt werden können. Getestet wurde eine PEG-Matrix mit RGD-Peptiden als Bindungsmotive und Quervernetzungen, die von MMP-Proteasen der Zellen abgebaut werden können. Eine Migration durch das Gel ist wegen einer Maschenweite im Nanometer-Bereich nur durch die Spaltung dieser Quervernetzungen möglich. Um Qgel in den µ-Slides nutzen zu können, wurde die, vom Hersteller angegebene Verdünnung „Soft IV“ verwendet, um eine vorzeitige Polymerisation der Matrix zu 3.Material und Methoden 29

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes verhindern. Die Herstellung des Gels ist im Folgenden stichpunktartig beschrieben: - Mischen des lyophilisierten Pulvers mit 600µl des mitgeliefertern Buffer A. - Vortexen der Lösung für etwa 10 Sekunden. - Hinzufügen von 150 µl Zellsuspension mit einer Zellzahl von 1.5x10 7 /ml. - Vortexen für 10-15 Sekunden zur vollständigen Homogenisierung der Lösung. - Einfüllen von 6µl Gelsuspension in den Kanal des µ-Slide. - Polymerisation des Gels für 30-45 Minuten im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2. Die finale Zellkonzentration in den Kanälen betrug 3x10 6 Zellen/ml. Eine vollständige Tabelle zu den unterschiedlichen Verdünnungen und den mechanischen Eigenschaften des Gels findet sich in Anhang A auf Seite 95. Cellendes Maleimid-BSA 3D-Matrix: Das verwendete Hydrogel der Firma Cellendes ist eine Matrix aus BSA-Protein mit funktionellen Maleimid-Gruppen. Abbildung 12: Schematische Darstellung des BSA-Proteins mit funktionellen Maleimid-Gruppen [modifiziert aus: Cellendes – Hydrogel User Guide Version 3.0, 2011] In der untersuchten Ausführung wurden diese Maleimid-Gruppen mit Thiol-Gruppen eines Polyethylen-glycol Proteinkomplexes quervernetzt. Der Proteinkomplex enthält eine Sequenz, welche die Zellen bei der Migration durch MMP-Proteasen spalten können. Abbildung 13: Schematische Darstellung des PEG-Crosslinkers mit funktionellen Thiol-Gruppen und spaltbarer Peptidsequenz. [Cellendes – Hydrogel User Guide Version 3.0, 2011] 3.Material und Methoden 30

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