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Jürschick, Johannes –

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes 1.4. Analytische Verfahren Die fortlaufende Veröffentlichung neuer Erkenntnisse auf dem Gebiet der Zellmigration und Chemotaxis erfordert die stetige Entwicklung neuer, dem Fokus des Interesses angepasster Methoden. Im Folgenden soll ein kurzer Überblick über die Entwicklung der Analysemethoden in den vergangenen Jahren gegeben werden. 1.4.1. Entwicklung analytischer Verfahren Eines der ersten Systeme zur Analyse des chemotaktischen Potentials verschiedener Substanzen und zugleich der Pionier einer andauernden Entwicklung sogenannter 2-Kammer Systeme, war die von Steve Boyden entwickelte Boyden-Kammer [Boyden, 1962]. Das zugrunde liegende Prinzip dieser Systeme sind 2 Flüssigkeitsreservoirs, von denen eines mit dem zu untersuchenden Stoff und das andere mit Referenzlösung gefüllt ist. Im Fall der ursprünglichen Boyden-Kammer werden die beiden Flüssigkeiten durch eine Membran getrennt, deren Porengröße so gewählt wurde, dass darauf liegende Zellen sie nur durch aktive Migration überwinden können. Später wurde das System dahingehend modifiziert, dass man die poröse Membran durch eine Gelmatrix ersetzte, welche die Zellen durchwandern mussten, um in Richtung der höheren Chemoattraktant Konzentration zu gelangen. Der Aufbau einer modifizierten Boyden-Kammer ist in Abbildung 3 schematisch dargestellt: Abbildung 3: Modifizierte Boyden-Kammer mit Gelmatrix. C0 entspricht Medium ohne Chemoattraktant, C100 Medium mit Chemoattraktant. Ausgewertet wird in beiden Verfahren rein statistisch durch die Ermittlung der Zellzahl auf der Unterseite der Membran (für adhärente Zellen) und/oder in den beiden Reservoiren (für Suspensionskulturen). 1.Einleitung und Motivation 11

Jürschick, Johannes – Chemotaxis in µ-Slides mit 3-dimensionalen Gelmatrizes Vorteile des Verfahrens liegen klar bei der Vermeidung umständlicher bildgebender Verfahren. Eine Beobachtung der Zellen während des Migrationsvorganges und damit eine Analyse von Veränderungen von Morphologie, Geschwindigkeit oder Direktionalität der Bewegung sind nach dieser Methode jedoch nicht möglich. Je nach Zelltyp muss die Porengröße der Membran neu gewählt werden. Dieser Umstand macht das Verfahren für Zellen mit wenig bekannten Parametern ungeeignet. Eine Weiterentwicklung der von Boyden eingeführten 2-Kammer Techniken und zugleich einen großen Schritt in der Entwicklung der Chemotaxis-Assays stellt die sogenannte Zigmond-Kammer dar, mit der es erstmals möglich war, die Zellen während der Migration unter dem Mikroskop zu beobachten und die Anzahl der migrierenden Zellen festzuhalten [Zigmond, 1977]. Bei der Zigmond-Kammer sind die Kammer mit Hungermedium und die Kammer mit Chemoattraktant über einen schmalen Spalt verbunden, der zwischen der Brücke der beiden Kammern und einem darüber liegenden Deckglas entsteht. Durch Diffusionsprozesse entsteht innerhalb dieses Spalts, in welchen die Zellen zur Versuchsdurchführung eingebracht werden, ein Stoffgradient, der von den Zellen detektiert werden kann. Der Aufbau der Zigmond-Kammer ist in Abbildung 4 skizziert Abbildung 4: Aufbauskizze einer Zigmond-Kammer [Zigmond, 1977] Es besteht die Möglichkeit den Spalt zwischen den Kammern mit einer Agarschicht zu füllen, durch welche sich die Zellen bei der Migration bewegen müssen und dadurch eine Art 3D- Chemotaxis-Assay durchzuführen. Daraus abgeleitete Methoden, wie die sogenannte Dunn- Kammer folgen einem ähnlichen Prinzip bei leicht unterschiedlichem Aufbau. Der Gradient zwischen beiden Kammern kann für lange Zeit stabil gehalten werden. Durch das Aufbringen des Deckglases mit den Zellen kann es jedoch bei unvorsichtiger Handhabung zu einer Durchmischung der Lösung kommen. Es bedarf daher einiger Erfahrung reproduzierbare Versuchsbedingungen bereitzustellen. 1.Einleitung und Motivation 12

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