Versuchsprotokoll Spektroskopie

Skriptversion 21.12.04
Versuchsprotokoll
Versuchsdatum: 28.10.04
Zweitabgabe:
Sttempell
Durchgeführt von:
Spektroskopie
1. Inhaltsangabe
1..Inhaltsangabe--------------------------------------------------------------------------------- 1
2..Aufgabenstellung----------------------------------------------------------------------------- 2
3..Einleitung ------------------------------------------------------------------------------------ 2
4..Versuchsaufbau ------------------------------------------------------------------------------ 4
4.1. Absorptionsspektroskopie ---------------------------------------------------------------4
4.2. Spectrofluorophotometer ----------------------------------------------------------------5
5..Beschreibung der Versuchsdurchführung---------------------------------------------------- 5
5.1. Geräteeinsatz ----------------------------------------------------------------------------5
5.1.1 Absorptionsspektroskopie----------------------------------------------------------5
5.1.2 Fluoreszenzspektroskopie ----------------------------------------------------------5
6..Versuchsdurchführung ----------------------------------------------------------------------- 6
6.1. Vorbereitung-----------------------------------------------------------------------------6
6.2. Küvettenvergleich -----------------------------------------------------------------------6
6.3. Vergleich der Mess- und Vergleichsküvette --------------------------------------------6
6.4. Aufnahme einer Konzentrationsreihe ---------------------------------------------------6
6.4.1 Bestimmung des Absorptionsmaximums ------------------------------------------6
6.4.2 Aufnahme der Konzentrationsreihe------------------------------------------------6
6.4.3 Bestimmung der Extinktionskoeffizienten-----------------------------------------7
6.4.4 Rechnerische Bestimmung der Nachweisgrenze ----------------------------------7
6.4.5 Bestimmung der Transmissionswerte----------------------------------------------8
6.5. Aufnahme des Fluoreszenzspektrums von Anthracen ----------------------------------8
6.6. Konzentrationsabhängigkeit der Fluoreszenz von Anthracen---------------------------9
7..Diskussion-----------------------------------------------------------------------------------10
7.1. Küvettenvergleich --------------------------------------------------------------------- 10
7.2. Aufnahme einer Konzentrationsreihe ------------------------------------------------- 10
7.3. Bestimmung der Extinktionskoeffizienten-------------------------------------------- 11
7.4. Rechnerische Bestimmung der Nachweisgrenze -------------------------------------- 11
7.5. Aufnahme des Absorptionsspektrums von Anthracen -------------------------------- 12
1

Skriptversion 21.12.04
7.6. Aufnahme der Fluoreszenzspektren von Anthracen ---------------------------------- 13
7.7. Konzentrationsabhängigkeit der Fluoreszenz ----------------------------------------- 13
8..Anhang --------------------------------------------------------------------------------------14
8.1. Diagramm 1: Küvettenvergleich ------------------------------------------------------ 14
8.2. Diagramm 3: Absorptionsspektrum von Anthracen----------------------------------- 15
8.3. Diagramm 4: Konzentrationsabhängigkeit der Absorption von Anthracen----------- 16
8.4. Diagramm 6: Transmissionsspektrum von Anthracen(EtOH) ------------------------ 17
8.5. Berechnungsgrundlage für die Bestimmung der Nachweisgrenze -------------------- 18
8.6. Diagramm 8: Fluoreszenzspektrum1 von Anthracen in (EtOH) ---------------------- 20
8.7. Diagramm 9: Fluoreszenzspektrum2 von Anthracen(EtOH) Konzentrationsreihe --- 21
8.8. Diagramm9: Emissionsspektrum der Xe-Lampe-------------------------------------- 22
8.9. Berechnungsgrundlagen--------------------------------------------------------------- 22
2. Aufgabenstellung
• Überprüfen der Auswahlkriterien für Küvetten
• Aufnahme einer Konzentrationsreihe und Bestimmung der Nachweisgrenze
• Vergleich von Absorption und Transmissionsspektren
• Aufnahme des Absorptionsspektrums von Anthracen
• Vergleich der Fluoreszenzspektren von Anthracen bei verschiedenen Anregungswellenlängen
• Vergleich der Konzentrationsreihe in Absorption mit der Konzentrationsreihe in Fluoreszenz
3. Einleitung
Organische und anorganische Moleküle absorbieren elektromagnetische Strahlung insbesondere
im IR-Bereich (Anregung von Schwingungen) und im UV/VIS-Bereich (Anregung von
Elektronenübergängen), d.h. die Strahlung wird beim Durchlaufen des Mediums geschwächt.
Nach der Quantenmechanik besitzen Atome bzw. Moleküle bevorzugte Dichteverteilungen
der Elektronenwolke, die jeweils einer bestimmten Energie entsprechen (genannt Orbitale,
Energieniveaus, Energieterme). Entspricht die Frequenz bzw. Energie der in das Medium einfallenden
Strahlung, genau der Energiedifferenz zweier solcher Orbitale, so kann das Wechselfeld
(der Strahlung) Atome bzw. Moleküle aus dem Grundzustand (unteren Energieniveau)
in den angeregter Zustand (das höhere Energieniveau), anheben. Durch das elektrische
Wechselfeld des Lichtes wird eine neue Ladungsverteilung Kern-Elektronenhülle erzeugt,
z.B. wird ein Elektron aus einem s-Orbital in ein neues p-Orbital angehoben (Elektronenanregung).
Die durch Lichtabsorption angeregten Moleküle stehen mit ihrer Umgebung nicht im thermodynamischen
Gleichgewicht. Kehren die Moleküle unter Energieabgabe in Form von Licht
wieder in den Grundzustand zurück, so spricht man von Fluoreszenz. Die Fähigkeit zu fluo-
2

Skriptversion 21.12.04
reszieren ist eng mit der Struktur des Moleküls verknüpft. Daher fluoreszieren, entgegen der
Absorption, nur wenige Moleküle. Hauptsächlich aber wird der Grundzustand durch stufenweiser
Energieabgabe in Form von Stößen und Schwingungsänderung erreicht; auch den zur
fluoreszenz fähigen Molekülen ist diese sogenannte strahlungslose Desaktivierung des angeregten
Zustandes die Konkurrenzreaktion zur Emission (siehe Energieterm-Schema)
Energie
v 4
*
v 3
*
v 2
*
v 1
*
v 0
*
, e 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
v 4
v 3
v 2
v 1
v 0, e 0
Abbildung 1 Energietermschema für Absorption und Fluoreszenz
............ strahlungslose Desaktivierung
______ Übergänge unter Absorption bzw. Emission d. Strahlung
v = 0 - 4: Schwingungsniveaus (*: im angeregten Zustand)
Die der Absorption (Übergangsdauer 10 -15 s, entspricht der Frequenz elektromagnetischer
Strahlung im UV/VIS-Bereich) entgegengesetzten Emissionsübergänge erfolgen nicht unmittelbar
von den, durch die Anregung erreichten Schwingungsniveaus, sondern vom untersten
Schwingungszustand des angeregten Elektronenzustandes. Da die "Lebensdauer" im angeregten
Zustand 10 -8 s beträgt reicht die Zeit von 10 -13 bis 10 -12 s aus, um das thermische Schwingungsgleichgewicht
im angeregten Zustand zu erreichen. Dies geschieht durch abführen von
Schwingungsenergie beim Zusammenstoß mit anderen Molekülen. Die Abgabe der Energie
kann stufenweise erfolgen, d.h. erst in obere Schwingungsniveaus und von da aus dann in die
darunter liegenden (so wie ein Ball einige Treppenstufen auf ein mal hinunterspringen kann,
oder auch indem er auf jeder Stufe auftritt).
Aus diesem Grund liegen die Fluoreszenzspektren immer langweiliger als die zugehörigen
Absorptionsspektren.
3

4. Versuchsaufbau
Skriptversion 21.12.04
4.1. Absorptionsspektroskopie
K P
S
S
S
P
L
M
S S
K V
S
Abbildung 2: Spektrophotometer
Von der Lichtquelle L (Wolframlampe bzw. Deuteriumlampe) fällt der polychromatische
Strahl auf den Monochromator M. Das resultierende Licht einer bestimmten Wellenlänge
trifft auf den rotierenden Sektorspiegel und wird durch einen weiteren Spiegel S durch die
Proben-Küvette K P , geleitet , wobei die Intensität der Strahlung geschwächt wird. Über weitere
Spiegel gelangt der Strahl auf den Photomultiplier P. Das resultierende Signal kann danach
entsprechend weiterverarbeitet werden (Schreiber, Drucker, Daten). In der gleichen Frequenz
in der die elektrische Signalaufnahme arbeitet, ändert der Schwingspiegel seine Richtung und
lässt den monochromatischen Strahl auf die Küvette K V fallen. In diesen Zeittakt wird die
Differenz zwischen der Intensität des Probestrahles und des Vergleichstrahles gebildet.
Auf diesen Wege lässt sich die Transmission des gelösten Stoffes bestimmen ohne Einfluss
des Lösungsmittels bzw. Reflexionen an der Küvette oder wellenlängenabhängige Intensitätsänderungen
der Lichtquelle.
4

Skriptversion 21.12.04
4.2. Spectrofluorophotometer
P
Signal
M 2
Sp 2
L
M 1
Sp 1
K P
L: Lichtquelle
M 1 : Monochromator
Sp 1 : Spalt
1: Anregungsseite
M 2 : Monochromator
Sp 2 : Spalt
2: Emissionsseite
K P : Küvette mit Probe
P: Photomultiplier
Abbildung 3: Spectrofluorophotometer
5. Beschreibung der Versuchsdurchführung
5.1. Geräteeinsatz
5.1.1 Absorptionsspektroskopie
Spectrophotometer Lambda2 (Fa. Perkin-Elmer)
Auswertesoftware PECSS (Fa. Perkin-Elmer)
Küvetten 1 cm Quarzglas bzw. optisches Spezialglas
5.1.2 Fluoreszenzspektroskopie
Spectrofluorophotometer RF-540 (Fa. Shimadzu)
Fluoreszenzküvette 1 cm Quarzglas
5

Skriptversion 21.12.04
6. Versuchsdurchführung
6.1. Vorbereitung
Spektrometer einschalten und warmlaufen lassen. Angeschlossenen PC starten. Programm
PECSS über DOS-Befehl starten. Über den später benützten spektralen Messbereich (400 bis
190 nm) einen Nullabgleich beider Strahlengänge durchführen.
Die Rohdaten jeder Messung werden in einem geeigneten Format gespeichert und über Excel
als Diagramm dargestellt (siehe Anhang).
6.2. Küvettenvergleich
Es werden die Durchlässigkeiten für den UV-Bereich der Küvetten aus optischen Spezialglas
und Quarzglas verglichen. Die Küvetten werden gegen Luft gemessen. Der Vergleichsstrahl
bleibt leer (Diagramm 8.1).
6.3. Vergleich der Mess- und Vergleichsküvette
2 Quarzküvetten werden eingesetzt. Über den gewünschten Messbereich wird mit den leeren
Küvetten ein Spektrum aufgenommen. Küvette II gegen Küvette I, Messbereich E: -0.01 bis +
0.01 (Diagramm 8.2).
6.4. Aufnahme einer Konzentrationsreihe
6.4.2 Aufnahme der Konzentrationsreihe
Ausgehend von der Stammlösung wird jeweils um den Faktor 2:3 verdünnt und jeweils ein
Absorptionsspektrum aufgenommen (die Küvette wird anschließend auch zur Fluoreszenzmessung
verwendet bevor die nächste Verdünnung hergestellt wird).
Die Verdünnungen werden hergestellt indem mit 2 Messküvetten im Wechsel gearbeitet
wird.1,0 ml Lösungsmittel wird in einer Küvette vorgelegt und 2,0 ml Probelösung der Küvette
entnommen, die zur vorangegangenen Messung benutzt wurde. Letztere Küvette wird da-
6.4.1 Bestimmung des Absorptionsmaximums
Hier: Anthracen in EtOH
Die Probelösung wird in die Messküvette gefüllt. Die Vergleichsküvette enthält das reine Lösungsmittel
(Ethanol). Als Probelösung wird eine Lösung verwendet, die ein Absorptionsmaximum
nicht über 2,0 besitzt. Da die Extinktionkoeffizienten für p → p -Übergänge übli-
∗
cherweise ca. 10 4 l·mol -1·cm -1 betragen sind Lösungskonzentrationen zwischen 10 -5 bis 10 -4
mol·l -1 zu verwenden.
Eine Stammlösung von Anthracen(ETOH) von 1,00·10 -5 mol·l -1 wird im Wellenlängenbereich
von 400 bis 200 nm gegen reines ETOH gemessen.
An Hand des Spektrums lassen sich zwei Wellenlängen festlegen bei denen die Absorption
sehr hoch ist.
Ausgesuchte Extinktionswerte der Stammlösung:
l / nm
E
250 1,947
356 0,119
6

Skriptversion 21.12.04
nach entleert und mit Lösungsmittel gespült. Nachdem spülen wird in dieser gespülten Küvette
1,0 ml Lösungsmittel vorgelegt, usw.
6.4.3 Bestimmung der Extinktionskoeffizienten
Es wird ausgehend von einer Stammlösung jeweils um den Faktor 2 auf 3 verdünnt und von
dieser Lösung ein Spektrum aufgenommen. An Hand der Messwerttabellen wird der Extinktionswert
bei unter 6.4.1 ermittelter Messwellenlänge ermittelt.
Zum Abschluss der Messreihe wird das Spektrum des reinen Lösungmittels aufgenommen.
Messwerttabelle
c / mol·l -1 E 250 E 250korr
ε 250 /
l·mol -1·cm -1 E 356 E 356korr
ε 356 /
-1
l·mol
-1·cm
1,00E-05 1,947 1,886 1,89E+05 0,119 0,113 1,13E+04
6,67E-06 1,331 1,270 1,90E+05 0,081 0,075 1,12E+04
4,44E-06 0,942 0,881 1,98E+05 0,082 0,076 1,71E+04
2,96E-06 0,602 0,541 1,83E+05 0,039 0,033 1,11E+04
1,98E-06 0,418 0,357 1,80E+05 0,033 0,027 1,36E+04
1,32E-06 0,279 0,218 1,65E+05 0,022 0,016 1,21E+04
8,78E-07 0,186 0,125 1,42E+05 0,013 0,007 7,97E+03
5,85E-07 0,142 0,081 1,38E+05 0,016 0,01 1,71E+04
0,00E+00 0,061 0,000 0,006 0
Mittelwert 0,656 1,73E+05 1,27E+04
Standardabweichung 2,25E+04 3,14E+03
Standardabweichung / % 12,96 24,69
Der molare dekadische Extinktionskoeffizient bei 250 nm beträgt : 1,73E+05 l·mol -1·cm -1 .
-1
Die graf. Auswertung ergab 1,94E+05 l·mol
-1·cm mit einem Bestimmtheitsmaß von
0,9988.
Der molare dekadische Extinktionskoeffizient bei 356 nm beträgt : 1,27E+04 l·mol -1·cm -1 .
-1
Die graf. Auswertung ergab 1,14E+04 l·mol
-1·cm mit einem Bestimmtheitsmaß von
0,9438.
6.4.4 Rechnerische Bestimmung der Nachweisgrenze
Bestimmung bei 250nm
Für ein 95%-Konfidenzintervall ist:
E = (193 626 ± 6677,2)·c – 0,028 ± 0,034
Die Schwankung des Y-Achsenabschnitts beträgt für das 95% Konfidenzintervall 0,034
Das entspricht einer Schwankung des Messwertes von 3,24 . 10 -7 mol·l -1 .
95% Konfidenzintervall entsprechen 4σ.
Die Nachweisgrenze (3σ ) ist damit : 2,26 . 10 -8 mol·l -1 bzw. 4,03 µg·l -1
Berechnungsgrundlage siehe 8.4.
7

Skriptversion 21.12.04
Bestimmung bei 365 nm
Für ein 95%-Konfidenzintervall ist:
E = (11 412 ± 272 586)·c + 0,0035 ± 1,381
Die Schwankung des Y-Achsenabschnitts beträgt für das 95% Konfidenzintervall 1,381
Das entspricht einer Schwankung des Messwertes von 2,17 . 10 -4 mol·l -1 .
95% Konfidenzintervall entsprechen 4σ.
Die Nachweisgrenze (3σ ) ist damit : 9,10 . 10 -5 mol·l -1 bzw. 16247 µg·l -1
Berechnungsgrundlage siehe 8.4.
6.4.5 Bestimmung der Transmissionswerte
Die Transmissionswerte werden im Absorptionsmaximum rechnerisch nach E = - lg T bestimmt.
Messwerttabelle
c / mol·l -1 E 250 E 250korr T 250korr
1,00E-05 1,947 1,886 1,30E-02
6,67E-06 1,331 1,270 5,37E-02
4,44E-06 0,942 0,881 1,32E-01
2,96E-06 0,602 0,541 2,88E-01
1,98E-06 0,418 0,357 4,40E-01
1,32E-06 0,279 0,218 6,05E-01
8,78E-07 0,186 0,125 7,50E-01
5,85E-07 0,142 0,081 8,30E-01
0,00E+00 0,061 0,000 1,00E+00
Die Konzentrationsbeziehung ist nicht linear und folgt der Funktion T 250 = 1,0672e -445839c mit
dem Bestimmheitsmaß R 2 = 0,9989
Nach obiger Beziehung gilt: T = 10 -e·c·d . Die Beziehung Transmission zur Konzentration ist
also potentiell zur Basis 10. Daher gilt für die Konzentrationsbeziehung
T 250 = 1,0672 10 -193591.c
6.5. Aufnahme des Fluoreszenzspektrums von Anthracen
Eine Fluoreszenzküvette (viersichtig) mit der Anthracenlösung (in EtOH) wird mit Anregungslicht
bestrahlt und die Intensität des emittierenden Fluoreszenzlichtes in Abhängigkeit
zur Wellenlänge (360 -500 nm) gemessen. Die Fluoreszenz ist anhängig von der Absorption.
Geräteparameter: siehe Anleitung zum Versuch
Bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen (wie unter 6.4.1 ermittelt) werden Fluoreszenzspektren
aufgenommen (Diagramme 8.7,8.8).
8

Skriptversion 21.12.04
6.6. Konzentrationsabhängigkeit der Fluoreszenz von Anthracen
Es werden zum Vergleich dieselben Lösungen wie bei der Absorptionsspektroskopie benützt
um bei vorher ermittelter Anregungswellenlänge die Konzentrationsabhängigkeit zu bestimmen.
Die Intensität wird grafisch im Emissionsmaximum bestimmt.
Geräteparameter
Ex / nm 356 Em / nm 400
Verstärkung 512
PM Empfindlichkeit
Low
Maßstab
5,99 %/cm
Messwerte
c / mol·l -1
gemessene
Intensität /
cm
gemessene
Intensität
Nullkorrigiert
Intensität /
%
1,00E-05 13 11,3 67,5
6,67E-06 9 7,3 43,6
4,44E-06 6,5 4,8 28,7
2,96E-06 4,95 3,25 19,4
1,98E-06 3,95 2,25 13,4
1,32E-06 2,7 1,0 6,0
8,78E-07 2,4 0,7 4,2
5,85E-07 2,1 0,4 2,4
0,00E+00
Die Grafik zeigt eine lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration an
Anthracen in Ethanol.
9

Skriptversion 21.12.04
7. Diskussion
Zu den einzelnen Untersuchungen:
7.1. Küvettenvergleich
In Diagramm 1 werden vier verschiedene Küvetten auf das Maß ihrer Durchlässigkeit im UV-
Bereich miteinander verglichen. Dazu wurden die Küvetten im Strahlengang gegen Luft gemessen.
Extinktionen, die größer 2 sind, wurden bei der Auswertung nicht mit einbezogen, da
hier die Messungenauigkeit des Gerätes zunimmt.
Die Quarzküvette zeigt einen Extinktionskoeffizienten von 0,094 und eignet sich somit sehr
gut für Messungen im UV- Bereich.
Die Küvette, bestehend aus optischem Spezialglas, weist im Bereich von 400 bis 277 nm e-
benfalls eine sehr geringe Extinktion auf. Ab 277 nm steigt auch die Extinktion von optischem
Spezialglas an wodurch diese Küvette im Messbereich von 250 nm unbrauchbar wird.
Der Kunststoff zeigt einen höheren Koeffizienten im Bereich von 400 bis 292 nm. Bei 292
nm ist bei der Kunststoffküvette ein Absorptionsmaximum zu erkennen. Das Absorptionsmaximum
wird von der funktionellen Gruppen C=0 des Kunststoffes hervorgerufen. Sie absorbiert
bei 292 nm und macht sich im Diagramm durch einen Peak erkennbar. Aufgrund des
Absorptionsmaximums ist die Kunststoffküvette nicht im UV-Bereich einsetzbar ist.
Die Küvette aus Glas 103 hat ähnlich wie Kunststoff schon im langwelligen Spektralbereich
sehr hohe Extinktionswerte. Es besitzt jedoch kein Absorptionsmaximum.
Die Quarzküvette ist von den vier Küvetten am Besten für den UV- Bereich unter 300 nm geeignet.
Jede andere der getesteten Küvetten kann in einem Bereich über 300 nm verwendet
werden.
Im längerwelligen Bereich sollten Aspekte wie Lösemittelresistenz und Materialkosten
schwerer gewichtet werden.
7.2. Aufnahme einer Konzentrationsreihe
Als Stammlösung wurde eine 0,00001 molare Anthracen - Lösung vorgelegt, die in einem
Wellenlängenbereich von 200 - 400 nm gegen reines Ethanol gemessen wurde.
Zunächst wurden die Absorptionsmaxima bestimmt, die bei 250 und 356 nm liegen (Diagramm
2). Dann wurde eine Konzentrationsreihe mit sechs Verdünnungen hergestellt und von
jeder Verdünnung das Absorptionsspektrum aufgezeichnet. Dabei zeigt sich, dass die Extink-
10

Skriptversion 21.12.04
tion mit zunehmender Verdünnung linear abnimmt. Das Bestimmtheitsmaß der Konzentrationsreihe
liegt bei 250 nm bei 0,9988 (s. Diagramm 5a) und bei 356 nm bei 0,9438 (s. Diagramm
5b).
Für alle Konzentrationen wird der Extinktionskoeffizient über das Lambert - Beer - Gesetz
berechnet. Bei 250 nm beträgt der mittlere Extinktionskoeffizient 1,73 . 10 +5 L . mol -1 . cm -1 .
Die Messreihe zeigt einen relativen Fehler von 12,96 %. Bei 356 nm errechnete sich ein mittlerer
Extinktionskoeffizient von 1,27 . 10 +4 L . mol -1 . cm -1 mit einem relativen Fehler von
24,69 %.
Allgemein kann man den Diagrammen entnehmen, daß mit zunehmender Verdünnung die
Werte breiter gestreut sind. Dies ist auf Ungenauigkeiten beim Mischen und auf Ungenauigkeiten
der Pipetten zurückzuführen.
Über den Verlauf der Extinktions - Konzentrations - Kurve bei höheren Konzentrationen kann
keine Aussage gemacht werden. Es ist jedoch anzunehmen, daß die Kurve auch dann ihre Linearität
beibehält.
7.3. Bestimmung der Extinktionskoeffizienten
Unterschiede zwischen den aus den Einzelwerten ermittelten Extinktionskoeffizienten und
denen die grafisch bestimmt wurden können durch Ungenauigkeiten beim Herstellen der
Konzentrationsreihe und durch die relativen Fehler der Pipetten erklärt werden.
Prozentual gesehen liegen die Unterschiede bei 250 nm bei 12 % und bei 356 nm bei 10 %.
7.4. Rechnerische Bestimmung der Nachweisgrenze
Zunächst wurde die Regression des linearen Bereiches der Konzentrationsreihe der Anthracenlösung
bei 250 nm und 350 nm bestimmt und graphisch dargestellt. Zur Berechnung der
Nachweisgrenze wurden die Werte mit einer Exceltabelle (s. Anhang 7.12) statistisch ausgewertet.
Bei 250 nm ergab dies für den 95% - Vertrauensbereich des y - Achsenabschnittes (Extinktion)
eine Schwankung von 0,034. Das entspricht einer Schwankung des Messwertes von ±
3,24 . 10 -7 mol .·L -1 . Die daraus berechnete Nachweisgrenze liegt demnach bei 2,26 . 10 -8 mol·l -1
bzw. 4,03 µg·l -1
Eine Schwankung von 1,381 für den 95% - Vertrauensbereich des y - Achsenabschnittes ergab
sich bei 356 nm.
Dies entspricht einer Schwankung des Messwertes von ± 2,17 . 10 -4 mol .·L -1 . Die daraus berechnete
Nachweisgrenze liegt bei 39,10 . 10 -5 mol·l -1 bzw. 16247 µg·l -1
Die Genauigkeit bei 250 nm ist höher.
11

7.5. Aufnahme des Absorptionsspektrums von Anthracen
Skriptversion 21.12.04
Anthracen wird bei 250 nm in den angeregten Zustand überführt. Bei 323, 339, 356 und
375 nm erfährt das Molekül zusätzliche Schwingungsanregungen. Ein Rotationsübergang läßt
sich bei Anthracen nicht anregen, da das Molekül planar gebaut und ein π-Elektronensystem
vorliegt, das kein Dipolmoment besitzt. Dadurch werden die Schwingungsübergänge sichtbar.
Im Jablonski-Energiethermschema werden die Energiezustände eines Moleküls als horizontale
Striche dargestellt. Für einen Elektronenübergang ist ein großer Energiebetrag notwendig
(UV-Strahlung). Zum Übergang von einem Schwingungsübergang zum nächst höheren muß
ein größerer Energiebetrag (Infrarotstrahlung) aufgebracht werden. Für einen Übergang von
einem Rotationsniveau in das nächst höhere wird wenig Energie (Mikrowellenstrahlung) benötigt.
Bei reiner Elektronenanregung würde ein Linienspektrum als Absorptionsspektrum resultieren,
wie dies bei Atomen der Fall ist. Moleküle, die in Schwingung und Rotation versetzt
werden können, besitzen ein Bandenspektrum, da bei einem großen Energiebetrag auch die
kleineren Übergänge zusätzlich angeregt werden.
Unter Normalbedingungen befinden sich die Moleküle im untersten Elektronenzustand und
Schwingungszustand. Bei Zuführung von Energie wird diese vom Molekül aufgenommen und
das Molekül in einen energetisch höheren Zustand versetzt. Die Energiebereiche (Wellenlängenbereiche),
die das Molekül aufnimmt werden im Absorptionsspektrum sichtbar, wobei die
Wellenlänge umgekehrt proportional zur Energie der Strahlung ist. Damit können die Energiezustände
des Moleküls gedeutet werden.
Als Fluoreszenz wird die Energieabgabe nach erfolgter Anregung in Form von sichtbarem
Licht bezeichnet. Die Fähigkeit, zu fluoreszieren ist eng mit der Struktur des Moleküls verknüpft.
Deshalb fluoreszieren nur wenige Moleküle. Ein Stoff kann dann fluoreszieren, wenn
sein angeregter Zustand mindestens eine Dauer von 10 -8 s hat.
Zunächst wird die Energie stufenweise in Form von Zusammenstößen mit anderen Molekülen
und Schwingungsänderungen abgegeben (strahlungslose Desaktivierung). Dies hat zur Folge,
daß Energie verloren geht. Dadurch erfolgt die Emission bei einer höheren Wellenlänge (geringerer
Energie) als die Absorption. Durch die stufenweise Abgabe der Energie liegt das
Fluoreszenzspektrum immer im längwelligeren Bereich als das zugehörige Absorptionsspektrum.
Bei der Aufnahme des Spektrums von Anthracen (Diagramm 6a) wurden die oben genannten
fünf Maxima erhalten. Zwei dieser Maxima (251 nm und 356 nm) wurden als Anregungswellenlänge
für die Fluoreszenzmessung ausgesucht. Dort wurde aufgrund der hohen Absorption
die höchste Fluoreszenz erwartet, was sich den Ergebnissen zufolge bestätigte.
12

Skriptversion 21.12.04
7.6. Aufnahme der Fluoreszenzspektren von Anthracen
Eine mit Anthracenlösung gefüllte Fluoreszenzküvette wurde mit Anregungslicht bestrahlt
und die Intensität des emittierten Lichtes in Abhängigkeit zur Wellenlänge gemessen.
Um möglichst viele Moleküle auf einmal anzuregen benötigt man eine Lampe mit hoher Intensität.
Je mehr Moleküle angeregt werden, desto mehr Moleküle fluoreszieren auf einmal.
Daher wird eine Xenonlampe eingesetzt, da sie eine hohe Intensität besitzt.
Die Anthracenlösung weist bei 251 nm und 356 nm zwei unterschiedliche Spektren auf. Das
Spektrum mit der Anregung bei 251 nm, zeigt eine geringere Fluoreszenzintensität, als das
Spektrum, welches bei 356 nm aufgenommen wurde.
Da Anthracen bei 251 nm mehr Licht als bei 356 nm absorbiert, war zu erwarten, daß bei einer
Anregungswellenlänge von 251 nm mehr Moleküle pro Zeiteinheit fluoreszieren als bei
356 nm. Da aber die Strahlungsintensitätsverteilung der Xenonlampe mit zunehmender Wellenlänge
steigt werden bei 356 nm mehr Moleküle in der Lösung angeregt. Somit können
mehr Moleküle pro Zeiteinheit fluoreszieren.
7.7. Konzentrationsabhängigkeit der Fluoreszenz
Die Beziehung Transmission zur Konzentration ist potentiell zur Basis 10. Daher gilt für die
Konzentrationsbeziehung T 250 = 1,0672 10 -193591.c
Diagramm 8 zeigt eine lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration
an Anthracen in Ethanol. Die Geradengleichung lautet y = 7·10 6 x –1,6971.
Das Bestimmtheitsmaß beträgt R 2 = 0,9986.
13

Skriptversion 21.12.04
8. Anhang
8.1. Diagramm 1: Küvettenvergleich
Diagramm 1: Küvettenvergleich
5
4,5
4
3,5
E
3
2,5
2
Kunststoff
optisches Spezialglas
Quarzglas
Glas103
1,5
1
0,5
0
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
n / nm
14

Skriptversion 21.12.04
8.2. Diagramm 3: Absorptionsspektrum von Anthracen
Diagramm3: Absorptionsspektrum von Anthracen
3
2,5
2
E
1,5
1
0,5
0
200 250 300 350 400 450
l /nm
15

Skriptversion 21.12.04
8.3. Diagramm 4: Konzentrationsabhängigkeit der Absorption von Anthracen
Konzentrationsabhängigkeit der Absorption von Anthracen
3
2,5
Extinktion
2
1,5
1
1,00*10E-5
6,67*10E-6
4,44*10E-6
2,96*10E-6
1,98*10E-6
1,32*10E-6
8,78*10E-7
5,78*10E-7
0
0,5
0
200 250 300 350 400 450
Wellenlänge in nm
16

Skriptversion 21.12.04
8.4. Diagramm 6: Transmissionsspektrum von Anthracen(EtOH)
Konzentrationsabhängigkeit der Transmission
9,00E-01
8,00E-01
y = 1,0672e -445839x
R 2 = 0,9989
7,00E-01
6,00E-01
5,00E-01
t
4,00E-01
3,00E-01
2,00E-01
1,00E-01
0,00E+00
0,00E+00 2,00E-06 4,00E-06 6,00E-06 8,00E-06 1,00E-05 1,20E-05
c / mol . L -1
17

Skriptversion 21.12.04
8.5. Berechnungsgrundlage für die Bestimmung der Nachweisgrenze
Reststreuung um die empirische Regressionsgeraden (residual variance)
s
e
=
( y - yˆ
)
i
n - 2
Standardabweichung für a
s
2
i
a
= se
2
n
i
2
( x - x )
i
x
i
Standardabweichung für b
s
b
=
s
( x - x )
i
e
i
2
y^: Berechnetes y für die
Regressionsgeraden
S.50 Chemometrics I
y = bx + a
Berechnung: Absorption bei 250 nm
c / mol·l -1 E 250 x 2 (x-xq) 2 y^ (y-y^) 2
1,00E-05 1,886 1,00E-10 4,09E-11 1,908 4,96E-04
6,67E-06 1,270 4,45E-11 9,40E-12 1,263 4,24E-05
4,44E-06 0,881 1,97E-11 6,99E-13 0,832 2,43E-03
2,96E-06 0,541 8,76E-12 4,15E-13 0,545 1,71E-05
1,98E-06 0,357 3,92E-12 2,64E-12 0,355 2,63E-06
1,32E-06 0,218 1,74E-12 5,22E-12 0,228 9,19E-05
8,78E-07 0,125 7,71E-13 7,43E-12 0,142 2,89E-04
5,85E-07 0,081 3,42E-13 9,12E-12 0,085 1,82E-05
xq
3,60E-06
n 8 a -0,028
Trendlinie
df 6
b 193626
2,38E-02
se
t(5%;Df=6) 2,447
sa 1,38E-02
sb 2,73E+03 b = 193626 +/- 6677,2
a = -0,028 +/- 0,034
Nachweisgrenze: 2,26 . 10 –8 mol . L -1
18

Skriptversion 21.12.04
Berechnung: Absorption bei 356 nm
c / mol·l -1 E 356 x 2 (x-xq) 2 y^ (y-y^) 2
1,00E-05 0,113 1,00E-10 4,09E-11 1,908 3,22E+00
6,67E-06 0,075 4,45E-11 9,40E-12 1,263 1,41E+00
4,44E-06 0,076 1,97E-11 6,99E-13 0,832 5,71E-01
2,96E-06 0,033 8,76E-12 4,15E-13 0,545 2,62E-01
1,98E-06 0,027 3,92E-12 2,64E-12 0,355 1,08E-01
1,32E-06 0,016 1,74E-12 5,22E-12 0,228 4,48E-02
8,78E-07 0,007 7,71E-13 7,43E-12 0,142 1,82E-02
5,85E-07 0,010 3,42E-13 9,12E-12 0,085 5,67E-03
xq
3,60E-06
n 8 a +0,0035
Trendlinie
df 6
b 11412
9,70E-01
se
t(5%;Df=6) 2,447
sa
5,64E-01
sb 1,11E+05 b = 11412 +/- 272586
a = 0,0035 +/- 1,381
Nachweisgrenze 9,10 . 10 -5 mol·L -1
4 Sigma (95% Wahrscheinlichkeit)
Nachweisgrenze damit 3/4 der Gesamtschwankung
y^: Berechnetes y für die Regressionsgeraden
S.50 Chemometrics I
Grundgleichung in der Statistik
y = bx + a
19

Skriptversion 21.12.04
8.6. Diagramm 8: Fluoreszenzspektrum1 von Anthracen in (EtOH)
Bei 356 nm
Intensitätabhängigkeit der Fluoreszenz von Anthracen von der Konzentration
80
70
60
50
y = 7E+06x - 1,6971
R 2 = 0,9986
I / %
40
Reihe1
Linear (Reihe1)
30
20
10
0
0,00E+00 2,00E-06 4,00E-06 6,00E-06 8,00E-06 1,00E-05 1,20E-05
c / mol . L -1
20

Skriptversion 21.12.04
8.7. Diagramm 9: Fluoreszenzspektrum2 von Anthracen(EtOH) Konzentrationsreihe
rel. I
? / nm
21

Skriptversion 21.12.04
8.8. Diagramm9: Emissionsspektrum der Xe-Lampe
Detektierte Strahlungsintensität in Abhängigkeit der Wellenlänge
Strahler: Xe-Lampe Meßgerät: RF-540 Fluorophotometer
240
220
2000
1500
Detektierte Strahlungsintensität in Abhängigkeit der Wellenlänge
Strahler: Xe-Lampe Meßgerät: RF-540 Fluorophotometer
rel. Intensität
200
180
160
1000
500
0
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600
l / nm
140
120
100
230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360
l / nm
8.9. Berechnungsgrundlagen
Zu 6.4.4
Grundgleichungen:
a
x
= e
x·ln
a
a
y
lna
= e
y
y
y
10
2,303
10 ln y
= e = 10
M Anthracen : 178,24 g·mol -1
22