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Zellbasierte Assays Expertenpanel HCS-Optimierung Dr. Andreas Pippow, Fraunhofer-Institut für für Angewandte Informationstechnik, Sankt Augustin; Prof. Dr. Ursula Graf-Hausner, Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, Zürich; Dr. Christoph Sachse, Cenix Bioscience GmbH, Dresden Das phänotypische oder High-Content-Screening bietet komplexe Informationen über die Wirkungen von Substanzen auf Zellen. Allerdings gibt es gerade bei der Verarbeitung der riesigen Datenmengen und bei neueren Technologien, wie dem funktionellen Screening von dreidimensionalen Mikrogeweben, noch zahlreiche Herausforderungen. XII | 14. Jahrgang | Nr. 3/2013 Prof. Dr. Ursula Graf-Hausner Dozentin und Forschungsleiterin an der ZHAW und Leiterin des Kompetenzzentrums TEDD LABORWELT Wo liegen die Hauptvorteile von 3D-Mikrokulturen beim Wirkstoffscreening und wohin geht der Trend? Graf-Hausner Die klassische zweidimensionale Zellkultur spiegelt die Situation im lebenden Organismus zu wenig wider, als dass sie für die Wirkstoffentwicklung und Testung von Substanzen geeignet wäre. Denn verschiedene Zelltypen kommunizieren miteinander und bilden komplexe Organsysteme. Deshalb ist der Bedarf an physiologisch relevanten und aussagekräftigen dreidimensionalen (3D) Gewebemodellen klar ausgewiesen. Pharmaunternehmen können mit solchen Modellen aus menschlichen Zellen die Sicherheit von Medikamenten in frühen Phasen der Entwicklung besser gewährleisten und erhebliche Kosten sparen. Die Reduktion von Tierversuchen durch die Anwendung alternativer Testverfahren ist hochwillkommen, in der Kosmetikbranche sind Tierversuche seit März diesen Jahres verboten. Um diesem Bedürfnis der Industrie nachzukommen, haben viele Technologiefirmen Methoden entwickelt, um geeignete 3D-Gewebemodelle herzustellen. Einige verwenden dazu natürliche oder synthetische Gerüstsubstanzen, zum Beispiel gelartige Polymere, in denen die Zellen eingebettet werden können. Andere Technologien funktionieren ohne Gerüste, hier werden die Zellen etwa in hängenden Tropfen zu Mikrogeweben herangezüchtet. Trotz zahlreicher heute im Handel erhältlichen Systeme (Cu r r Opin Bio t e c h - n o l 23(5):803-809) gibt es noch viel zu tun. Denn es gibt keine Standards oder Qualitätsnormen. Verfügbarkeit und Reproduzierbarkeit der Modelle müssen gewährleistet sein. Zahlreiche Herausforderungen sind noch zu lösen, wie etwa die Automatisierung, Analyse des Readout, die Kombination mehrerer Organsysteme. Verschiedene Gruppen zeigen bereits fantastische Resultate, sie nennen es „Body on a Chip“. Ein Zukunftstrend ist auch das Bioprinting: hier werden organähnliche Modelle mit einem Tintenstrahldrucker Lage für Lage gedruckt. Also jede Zelle an den Ort ihrer Bestimmung, schön eingebettet in die umgebende Matrix. Welche Methoden sich letztlich durchsetzen werden, wird die Zukunft zeigen. Dr. Andreas Pippow Wissenschaftlicher Koordinator im Bereich High-Content-Analyse am Fraunhofer-FIT in Sankt Augustin LABORWELT Wie und wo kann weiteres Effizienzpotential beim HCS-Datenmanagement genutzt werden? Pippow Für das High-Content-Screening gibt es von verschiedenen Herstellern Standard-Softwareprodukte, mit denen sich Forscher innerhalb ihrer Daten orientieren können. Neben Bilddaten können auch Ergebnisse der Bildanalyse, statistische Analysen, Assaybeschreibungen oder chemische Verbindungen erfasst werden. Die Grenze effektiven Datenmanagements wird erreicht, wenn Ergebnisse mit anderen Experimenten integriert werden sollen. Wenn sie zum Beispiel Faktoren gefunden haben, die das Neuronenwachstum beschleunigen und sie dann Daten anderer Forscher mit einbeziehen möchten, um den Mechanismus besser zu verstehen, wird dies heute nicht gut unterstützt, insbesondere bei der Einbeziehung von genomischen oder metabolomischen Daten. Eine von uns durchgeführte Umfrage in der forschenden Life-Sciences-Branche bestätigt Defizite bei der Datenintegration. Viele Anwender setzen unterschiedliche Systeme ein, deren Datenbestände bzw. Datenbanken sich schlecht inte grieren lassen. Ein typischer Wissenschaftler arbeitet an vielen Projekten gleichzeitig und ist auf die Ergebnisse anderer Partner angewiesen. Die Vielzahl der Insellösungen am Markt führt dazu, dass die Teilnehmer unserer Studie ein Viertel ihrer Arbeitszeit mit dem Verwalten von Daten verbringen müssen. Wir sehen hier enormes Einsparpotential einerseits durch Fortbildung im effizienten und regulatorisch korrekten Umgang mit heterogenen Daten, andererseits durch die Entwicklung neuer flexibler Datenintegrationslösungen. Wir wollen auch Softwarehersteller ansprechen, damit sie verstärkt moderne Datenmanagementansätze und gemeinsame Schnittstellen einsetzen. Dr. Christoph Sachse Director Cell-based Services, Cenix Bioscience GmbH, Dresden LABORWELT Was sind die Vorteile von 3D Assays in RNAi- Anwendungen? Sachse Für immer mehr Zellkulturmodelle werden Daten publiziert, die auf ein „physiologischeres“ Verhalten von 3D-Kulturen im Vergleich zu 2D-Kulturen derselben Zellen hindeuten. Ein Beispiel sind Leberzelllinien, die unter 3D- Bedingungen höhere Albumin-Produktion und CYP-Induktion zeigen und sich somit besser für In-vitro-Toxizitätsstudien eignen. Auch in der Onkologie sind 3D-Assays inzwischen zu einem festen Teil der Pharmaforschung geworden. Die Anwendung von 3D-RNAi-Assays ist von uns erfolgreich etabliert worden. Die Verwendung von BME oder der InSphero-Plattform ermöglicht eine Miniaturisierung in 96-Well- Platten und damit einen erhöhten Durchsatz, so dass sich etwa Proliferations-, Viabilitäts-, Colony Formation- oder Zytokin-Assays nicht nur für Target-Validierungsstudien, sondern auch für Screens anbieten. Herausforderungen derartiger Assays sind zum einen die Wahl eines geeigneten Zellmodells sowie die Optimierung eines siRNA-Transfektionsprotokolles (besonders bei nicht-transformierten Zellen), zum anderen die Etablierung von Mikroskopie und Bildanalyse bei High-Content Assays, meist via konfokale Mikroskopie oder Mikrogewebsschnitte. Zusätzliche Komplexität ergibt sich bei der Verwendung von Co-Kulturen (z. B. von Tumor- und Stroma-Zellen). Obwohl technisch anspruchsvoll, haben viele dieser Assays Potential, physiologisch ungleich relevantere Daten zu generieren als herkömmliche 2D-Assays; sie sind deshalb integraler Bestandteil des Cenix Assay-Entwicklungsprogramms. LABORWELT
Screening Advertorial ››› ZELLBASIERTES SCREENING Von Zellen zu Zahlen Für das zellbasierte Screening ist eine gleichbleibend optimale Bildqualität von höchster Wichtigkeit. SynenTec liefert dafür robuste automatisierte Mikroskopsysteme, die mittels digitaler Bildverarbeitung zelluläre Parameter ermitteln und darstellen. Das Cellavista und das neue NyONE sind durch die intuitive Benutzersteuerung schnell in jedem Zellkulturlabor effizient einsetzbar. Abb. 2: CHO-K1, 3fach-Fluoreszenzfärbung Abb. 1: NyONE Image Cytometer Mit dem Cellavista hat sich SynenTec in den letzten Jahren erfolgreich in den Zellkulturlabors der Pharmaforschung etabliert. Als kompakte Lösung ist das neue NyONE (Abb. 1) jetzt für den mittleren Probendurchsatz konzipiert. Beide Systeme realisieren die hochauflösende Abbildung von Zellen in Suspension und Adhäsion nicht-invasiv mittels Durchlichtdetektion. Zusätzlich ermöglichen leistungsstarke LEDs mit einer langen Lebensdauer detaillierte Fluoreszenzaufnahmen für die der laserunterstützte Autofokus die optimale Bildebene innerhalb von nur 100 ms automatisch einstellt. Die Kombination hochpräziser Mechanik und Optik gewährleisten eine überragende Bildqualität. Dabei werden die optische und geometrische Auflösung der CCD-Kamera ideal miteinander kombiniert und eine Bildauflösung von unter einem halben Mikrometer pro Pixel erreicht. Dieser „NANO-VIEW“ in die einzelne Zelle ermöglicht detaillierte Auswertungen (siehe Abb. 2). Durch den passgenauen Übergang der Einzelbilder (stitching) wird eine exakte Zellzahlbestimmung in den Randbereichen jeder Aufnahme gewährleistet. Dies führt zu einer präzisen Quantifizierung der Zellkultur. Variierende Ansprüche an die Bildqualität werden durch den Wechsel von Objektiven erreicht. Der automatische Objektivwechsel ermöglicht Bildaufnahmen bis zur einer 40x Vergrößerung. Die reine Durchlichtmikroskopie kann dabei sowohl den Startpunkt einer Klonierung (Applikation: SINGLE CELL CLONING), als auch den weiteren Kultivierungsverlauf dokumentieren (Applikation: CELL CONFLU- ENCE). Durch Markierung der Zellen mit Fluoreszenz-Farbstoffen oder Trypanblau werden Applikationen wie SUSPENSION CELL COUNT, TRANSFECTION EFFICIENCY, LIVE/DEAD ASSAYS und APOPTOSE ermöglicht. Die drei Fluoreszenzkanäle im NyONE decken die große Mehrheit der zellbasierten Assays ab. Das Cellavista ergänzt diese Kanäle um grün/amber/rot, mit denen eine Vielzahl weiterer Flourophore anregbar sind. Bei gleichzeitiger Aufnahme eines Durchlicht- und eines Fluoreszenzkanals wird eine 96-well Mikrotiterplatte innerhalb von nur 3 Minuten gemessen und ausgewertet (2x Objektiv, full-well scan, Cellavista). Die Messung von Mikroskop-Slides, Mikrotiterplatten und Zellkulturflaschen eröffnen eine übergangslose Analyse der Zellkultur vom µL-Stadium bis hin zum mL-Maßstab. Zudem kann das Cellavista System um Inkubatoren, Liquid-Management, Plate Stacker, Clone Picker, bis hin zu komplett automatisierten Lösungen erweitert werden (unter anderem realisiert mit Hamilton, Tecan, PAA). Mit einer integrierbaren Inkubationskammer ist es möglich, eine lückenlose Dokumentation des Kultivierungsverlaufes zu erzeugen (LIVE CELL IMAGING), wie es z.B. bei der Applikation WUNDHEILUNG oder CHEMO TAXIS wichtig ist. Die erhobenen Bilddaten werden entweder parallel zur Aufnahme oder zeitversetzt ausgewertet. Dazu werden verschiedene Auswerteroutinen (Operatoren) angeboten, die mit voreingestellten Parametern auf die jeweilige Applikation zugeschnitten sind. Diese können individuell angepasst werden. Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt z. B. als HEAT-MAP, HISTOGRAMM oder SCATTER PLOT (Abb. 3) und ermöglicht eine sofortige Interpretation. Somit bietet SynenTec mit dem Cellavista und dem NyONE auf unterschiedliche Anforderungen zugeschnittene Komplettlösungen für die effiziente und kostengünstige Automatisierung in jedem Zellkulturlabor. Getreu dem Motto: „From cells to numbers“. Kontakt Abb. 3: Benutzeroberfläche des NyONE mit Auswertung zu LIVE/DEAD (grün/rot) und APOPTOSE (gelb); rechts: Auswertungen als Heat-map (Viabilität) und Histogramm (Compactness). LABORWELT Dr. Sebastian Giehring und Dr. Regine Lümen SynenTec Bio Services GmbH Johann-Krane-Weg 42 48149 Münster regine.luemen@synentec-bioservices.com www.synentec-bioservices.com 14. Jahrgang | Nr. 3/2013 | XIII
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Seite 7 und 8: Drug Screening Zellbasierte Assays
Seite 9 und 10: Drug Screening Zellbasierte Assays
Seite 11: Diagnostik Advertorial ››› SE
Seite 15 und 16: Interaktionsanalyse Zellbasierte p5
Seite 17 und 18: RNAi-Knockdown Zellbasierte Assays
Seite 19 und 20: Verbände Service Diagnostik-Netzwe
Seite 21 und 22: BioTek Instruments Cytation TM 3 ve
Seite 23 und 24: The best thing that can happen to a

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