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Zellbasierte Assays Chemische Biologie „Wir wollen Biologie screenbar machen“ Zellbasierte Assays und das damit verknüpfte Feld der chemischen Biologie werden immer wichtiger, um biologische Prozesse oder Krankheiten grundlegend zu verstehen. Im April erhielt die vom Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie koordinierte EU-Infrastruktur EU-Openscreen die langfristige Förderzusage der Bundesregierung. In der Initiative bündeln vorhandene Screening- Zentren in Europa ihre Ressourcen für das Substanzscreening. Gesucht werden Substanzen, die in zentrale biologische Vorgänge eingreifen und ein vertieftes Verständnis davon vermitteln, wie etwa Krankheiten entstehen, Pflanzen wachsen oder Zellen sich differenzieren. LABORWELT sprach mit Dr. Ronald Frank, dem Koordinator von EU-Openscreen, über die Ziele der Initiative und wie sie erreicht werden sollen. LABORWELT Wofür steht EU-Openscreen und was sind die Ziele der Initiative? Frank EU-Openscreen ist ein Netzwerk von europäischen Screening-Zentren und Experten für chemische Biologie, die gemeinsam eine Sammlung von 200.000 bis 300.000 Substanzen aufbauen und in Screenings benutzen wollen, um biologische Vorgänge besser zu verstehen. Die Substanzen werden von Europäischen Experten nach verschiedensten Kriterien aus kommerziellen und akademischen Quellen ausgewählt sowie von Chemikern bereitgestellt. Die Sammlung soll Informationen über die biologische Wirkung von Substanzen auf verschiedenste biologische Systeme liefern. Anders als zum Beispiel die European Lead Factory schauen wir nicht nur auf Arzneimittelkandidaten, sondern es geht auch um Agrar- und Umweltforschung – also alles, wo Biologie und Chemie zusammenkommen. Als Initiative des European Strategy Forums on Research Infrastructures (EFSRI) ist es das Ziel von EU-Openscreen, sogenannte Toolsubstanzen bereitzustellen und ihre Wirkung in einer Datenbank zu erfassen. Die Toolsubstanzen sollen helfen, das grundlegende Verständnis biologischer Prozesse zu verbessern. EU-Openscreen setzt damit einen Schritt vor verwertungs- und IP-orientierteren Initiativen an, wie der in diesem Jahr gestarteten European Lead Factory oder der Alliance of Translational Research Centres. Tab. 1: An EU-Openscreen beteiligte Screeningzentren Screening-Zentrum CeMM, PLACEBO FIMM Helsinki FMP Berlin Fundación Medina, Granada IMG Prague IRBM Rome PPSC USEF Santiago de Compostela XVI | 14. Jahrgang | Nr. 3/2013 Standort. Austria Finland Germany Spain Czech Republic Italy The Netherlands Spain LABORWELT Inwieweit kann denn ein so offener Ansatz zum Technologietransfer beitragen? Frank Wir sehen in vielen Fällen, dass die Translation in Sackgassen landet. Unserer Meinung nach liegt das daran, dass das Wissen darüber, wie Sub stanzen auf biologische Vorgänge wirken, noch viel zu begrenzt ist. Ein tieferes grundlegendes Verständnis über die Wirkung und Toxizität von Substanzen auf Mensch und Umwelt hilft besser, das Risiko eines teuren Scheiterns in später Entwicklungsphase zu verkleinern, als es im Geheimen immer wieder mit dem gleichen Ansatz zu versuchen. Wenn wir erst einmal grundlegende Prinzipien besser verstehen, wird es möglich sein, mit weniger Entwicklungskandidaten eine bessere Erfolgsrate zu erzielen. Deshalb wollen wir die breite Biologie screenbar machen. Ein wichtiges Mittel dazu ist auch das High Content-Screening (HCS) mit zellbasierten Assays. LABORWELT Das Projekt steckt schon mitten in der mit 3,7 Mio. Euro von der Europäischen Kommission geförderten Vorbereitungsphase … Frank Die Vorbereitungsphase läuft noch bis 2015. Dann wird EU-Openscreen die eigens von der Kommission geschaffene Rechtsform ERIC annehmen und – finanziert von den EU- Mitgliedstaaten, deren Unterschriften wir derzeit einsammeln – die Arbeit aufnehmen. Wir werden an voraussichtlich acht Screeningzentren mit einer wöchentlichen Kapazität von 200.000 Substanzen screenen, um das gesamte Wirkspektrum inklusive neuer Effekte und Nebenwirkungen zu erfassen. Standards, die eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse und Daten gewährleisten, werden derzeit in einem eigenen Arbeitspaket etabliert. LABORWELT: Wieviel Geld brauchen Sie denn pro Jahr? Dr. Ronald Frank ist der Koordinator von EU-OPENSCREEN am Leibniz Institut für Molekulare Pharmakologie (FMP) in Berlin und leitet dort auch die Arbeitsgruppe Chemische Systembiologie. Der Chemiker ist Mitgründer und CEO der Berliner AIMS Scientific Products GmbH. Nach seiner Promotion 1980 wechselte er zur Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF) in Braunschweig, das heutige Helmholtz- Zentrum für Infektionsforschung (HZI). Dort arbeitete er über chemische Gen- Synthese, die kombinatorische Synthese von Nukleinsäuren und Peptiden und richtete die High-Throughput-Screening- Plattform des Zentrums ein. Frank Um die aus dem deutschen ChemBioNet hervorgegangene Infrastruktur am Leben zu halten, brauchen wir etwa 2,5 Mio. Euro jährliche Betriebskosten. Dazu kommen natürlich die Projekte , die wir mit mindestens 10 Mio. Euro pro Jahr veranschlagen. Diese müssen aus verschiedenen Quellen finanziert werden. Wir hoffen aber, dass sich viele EU-Länder an sogenannten Project Calls beteiligen. Insgesamt erwarten wir europaweit eine jährliche Auslastung von etwa 200 Projekten, von denen mindestens 50 von solchen EU-OPENSCEEENspezifischen Calls finanziert werden sollten. LABORWELT: Werden Sie auch die Entwicklung neuer Methoden vorantreiben? Frank Wir stimulieren die Entwicklung neuer Methoden im wissenschaftlichen Umfeld der der beteiligten Zentren und Partnerinstitute, haben aber kein eigenes Budget, um eine Methodenentwicklung durchzuführen. Wir suchen aber den Austausch mit Entwicklern, Verbrauchsmittel- und Reagenzienherstellern sowie Biotech-Unternehmen. t.gabrielczyk@biocom.de LABORWELT
RNAi-Knockdown Zellbasierte Assays Funktionelle Genanalyse Neue Vektoren für zellbasierte Assays mit fast 100% Knockdown-Effizienz Zellbasierte funktionelle Studien der Gendepletion und Genüberexpression zählen heute zu den unverzichtbaren Werkzeugen der molekularbiologischen Grundlagen- und angewandten klinischen Forschung. Voraussetzung für ein aussagekräftiges Zellmodell ist dabei die homogene, hocheffiziente und spezifische Genregulation. Forscher der Sirion Biotech in München haben kommerziell erhältliche und In-house- RNAi-Plattformen miteinander verglichen und eine Screening-Technologie für die Identifizierung hochaktiver shRNAs (RNAiONE) für das Gene Silencing entwickelt. RNAiONE Abb. 1: Validierung von 15 shRNA-Sequenzen gegen hGPCRx mittels der RNAiONE- Technologie wurde sowohl auf die RNA-Polymerase (RNA- Pol)-III- als auch die RNA-Pol-II-abhängige shRNA-Expression adaptiert. Dies erlaubt den effektiven Einsatz in einem eigens dafür entwickelten konstitutiven und induzierbaren viralen Expressionsvektor. Die aufeinander abgestimmte Kombination von shRNA-Validierung und dem Design des viralen Vektors ermöglicht die Entwicklung stabil und transient exprimierender Zellmodelle, die einen fast vollständigen Knockdown zeigen. Die hohe Knockdown-Effizienz der neuen Zellmodelle markiert einen signifikanten Fortschritt für die Grundlagenforschung, die Targetfindung und das zellbasierte Screening. Das Verfahren bis hin zu einem homogenen effizienten Knockdown-Zellpool, der eine klonale Selektion verzichtbar macht, besteht aus vier Schritten: (a) shRNA-Design, (b) shRNA-Validierung mit RNAiONE, (c) Integration in die gewünschte virale Vektor Plattform, d) Zellmodell-Generierung. Als Funktionskontrolle dieser Plattform dient die induzierbare Depletion eines spezifischen Abb. 2: Knockdown-Effizienz der besten shRNA-Sequenz 15 im stabilen induzierbaren HEK293-Zellmodell humanen G-Protein-gekoppelten Rezeptors (hGPCRx) in HEK293-Zellen: Abbildung 1 zeigt die Validierung von 15 shRNA-Sequenzen gegen hGPCRx mittels RNAiONE. Die effizienteste Sequenz 15 wurde anschließend in SIRION Biotechs induzierbare lentivirale Plattform kloniert und ein stabiles HEK293-Zellmodell mittels lentiviraler Transduktion generiert. Das Ergebnis in Abbildung 2 zeigt deutlich den hocheffizienten Knockdown (KD) von 90% auf mRNA-Ebene nach Dox-Applikation. Kontakt Dr. Kathrin Schmitt Director, Sales & Marketing schmitt@sirion-biotech.de • Hoher Automatisierungsgrad • Reduktion von Proben- und Reagenzienvolumen • Robuste, gebrauchsfertige Testmaterialien
Seite 1 und 2: LABORWELT Nr. 3 / 2013 - 14. Jahrga
Seite 3 und 4: Intro Zellbasierte Assays Zellmodel
Seite 5 und 6: Parallele Dimension DASGIP ® Biore
Seite 7 und 8: Drug Screening Zellbasierte Assays
Seite 9 und 10: Drug Screening Zellbasierte Assays
Seite 11 und 12: Diagnostik Advertorial ››› SE
Seite 13 und 14: Screening Advertorial ››› ZEL
Seite 15: Interaktionsanalyse Zellbasierte p5
Seite 19 und 20: Verbände Service Diagnostik-Netzwe
Seite 21 und 22: BioTek Instruments Cytation TM 3 ve
Seite 23 und 24: The best thing that can happen to a

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