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Zellbasierte Assays Stammzellen der Vergangenheit wurden etwa Assays zu epigenetisch relevanten Enzymen entwickelt wobei verschiedenste Detektionstechnologien und die Automatisierung genutzt wurden. Entsprechend gängiger Praxis wurden für die Hit-Bestätigung und -Charakterisierung auch zelluläre Sekundär-Assays entwickelt und angewendet. Aktuell stehen beim ESP sowohl für biochemische als auch zellbasierte Screens eine Reihe modernster Technologien sowie eine entsprechende Infrastruktur zur Verfügung. Für die Suche nach Stammzell-aktiven Substanzen nutzte der ESP in der jüngsten Vergangenheit aber vor allem phänotypische Screens oder Screening-Formate. Anders als beim Target-basierten Screening wird hierbei eine komplexe physiologische Zellantwort genutzt und mit geeigneten Detektionstechnologien gemessen. Dabei kamen sowohl einfache Lumineszenz-Technologien (Reporter-Gen-Assays) als auch das High Content Screening (HCS) zum Einsatz. Vor allem das HCS bietet für Drug Discovery-Ansätze enorme Möglichkeiten, da bei dieser Bild-basierten Screening-Technologie die Möglichkeit besteht, eine Vielzahl von Parametern gleichzeitig zu bestimmen. So lassen sich zugleich etwa Differenzierungsund/oder Pluripotenz-Marker in Zellen detektieren, aber auch morphologische Eigenschaften von Organellen, Zellen oder Zell-Populationen (z. B. Stammzell-Kolonien) charakterisieren. Projektbeispiele und Performancedaten An den folgenden Beispielen sollen das Potential von Stammzellen und die vielfältigen Möglichkeiten ihres Einsatzes in Ultra- Hochdurchsatz- (uHTS)- und High Content- Screens (HCS) verdeutlicht werden. Auch die Kombination von uHTS für den Primärscreen und HCS für das Hit-Profiling zur Bestimmung von Dosiswirkungen scheint ein vielversprechender Weg zu sein. (1) In einem Verbund-Projekt der Systembiologie wurde ein Hochdurchsatz-Screen integriert und 250.000 Substanzen auf ihre Wirksamkeit bezüglich Drug iPS untersucht. Dabei kam ein einfaches Zellmodell unter Verwendung von Reportergen- Assays zum Einsatz, mit denen die <strong>Transkript</strong>ion von vier relevanten Stammzell- Faktoren getrennt nachgewiesen wurde. Um die Spezifität der Ergebnisse nachzuweisen, wurden rund 500 Hits in einem Reporter-Gen-Counter-Assay getestet sowie ihre Wirksamkeit dosisabhängig mit 11 Verdünnungen im Reportergen sowie in vier korrespondierenden HCS-Assays mit embryonalen Karzinom-Zellen charakterisiert. Mittels Luciferase-Assay wurden dabei 1,5 Millionen Datenpunkte erzeugt, VI | 14. Jahrgang | Nr. 3/2013 Durchführung eines Drug iPS-Screens mittels uHTS und HCS allein die Bild-Daten hatten eine Größe von 2 Terabyte. (2) In einem HCS-Projekt beinhaltete die Screening-Kampagne einen phänotypischen Primär-Screen bei dem mehr als 23.000 Substanzen getestet wurden. Die Expression wurde sowohl von Pluripotenz- als auch von Differenzierungsmarkern in embryonalen Stammzellen der Maus (mES) nachgewiesen. Das ausgesprochen anspruchsvolle Zellsystem und der Assay wurde vom akademischen Partner (Institut für Stammzellforschung am Helmholtz-Zentrum München) entwickelt. Im HCS wurden sowohl ein endodermaler Differenzierungsmarker sowie der wichtigste Pluripotenzmarker als auch die Morphologie der Zellen und Kolonien detektiert beziehungsweise charakterisiert. Besondere technologische Schwierigkeiten wie der Mediumwechsel mit erneuter Substanz-Zugabe als auch die Herausforderungen einer komplexen Bilderkennung wurden automatisiert gelöst. Durch den Einsatz von weiteren Bioinformatik-Tools konnte für diesen aufwendigen Screen eine Hit-Expansion erreicht und eine Reihe von analogen Substanzen ebenfalls im HCS als Hits bestätigt und charakterisiert werden. (3) In Zusammenarbeit mit einer akademischen Forschungsgruppe und dem Hersteller OLink werden dessen moderne Färbemethoden (Proximity Ligation Assay) eingesetzt und an die HCS-Anforderungen angepasst um die Interaktion von Schlüsselmolekülen in Stammzellen zu untersuchen, wobei die Signal-Netzwerke bei der genetischen Reprogrammierung und Differenzierung zu neuronalen Zellen analysiert werden. (4) Die Charakterisierung von neuronalen Zellen (neurite outgrowth) und Herzmuskelzellen (cardiac hypertrophy) kann mit einem spezifischen HCS-Assay analysiert werden. Dieser Assay wurde auf Basis von humanen iPS-Zellen von dem Partner Cellular Dynamics International hergeleitet und etabliert und steht somit für Drug Discovery-Kampagnen zur Verfügung. Diese Beispiele zeigen, dass Technologien verfügbar sind, um Stammzellen auch in Screening-Kampagnen einzusetzen und mit den entsprechenden Pluripotenz-Markern in Maus- und humanen-Stammzellen im Hochdurchsatz zu detektieren. Sowohl bei einfachen phänotypischen Screens als auch komplexen HCS-Anwendungen bestand in jüngster Vergangenheit die wichtigste Aufgabe des ESP in der Überführung und Anpassung der aktuellen relevanten Forschungsergebnisse in „Screening-taugliche Assay-Technologien“. Ein Blick in die Zukunft zeigt, dass zusätzlich zu den klassischen, bereits beschriebenen Wirkmechanismen die nächste Generation der Nachahmer-Proteinarzneimittel völlig andere und zum Teil sehr individuelle und produktspezifische Wirkmechanismen hat, für die geeignete Verfahren zur Bestimmung der Bioaktivität entwickelt werden müssen. Korrespondenzadresse Oliver Keminer European ScreeningPort GmbH Schnackenburgallee 114 22525 Hamburg Tel.: +49-(0)40-303764-288 Fax: +49-(0)40-303764 177 oliver.keminer@screeningport.com www. screeningport.com Quelle: European ScreeningPort LABORWELT
Drug Screening Zellbasierte Assays StemBANCC: iPSC-basierte Zell- und Tox-Modelle Dr. Robert Zweigerdt, Medizinische Hochschule Hannover, Martin Graf, F. Hoffmann La-Roche AG, Basel 10 times smaller - 5 times better Die Etablierung neuer Standards bei der Herstellung und Charakterisierung patientenspezifischer induziert-pluripotenter Stammzellen (iPSCs) wird für deren industrielle Anwendung bei der Entwicklung von Wirkstoffen immer wichtiger. Mit dem Start des StemBANCC-Projektes der Innovative Medicines Initiative (IMI) bündeln akademische Forschungsgruppen, Biotechund Pharmaunternehmen ihre Kompetenzen, um krankheitsrelevante humane iPSCs (hiPSC) zu etablieren, die für biologische Krankheitsmodelle und das prädiktive Toxikologiescreening neuer Leads genutzt werden können. Die Entwicklung neuer Medikamente stellt Unternehmen vor große Herausforderungen. Trotz steigender Entwicklungskosten sinkt die Anzahl neu zugelassener Wirkstoffe stetig. Die Ursachen hierfür sind vielfältig. Manche Erkrankungen sind noch unzureichend beschrieben. Das fehlende Verständnis der zugrundeliegenden zellulären und molekularen Mechanismen machte die Suche nach geeigneten Wirkstoffen bisher praktisch unmöglich. Aber auch nach der Entdeckung krankheitsassoziierter Zielmoleküle („Drug Targets“), für die Wirkstoffe entwickelt werden können, stellt sich häufig heraus, dass diese letztlich nicht die Ursache der Erkrankung sind. Neben der Unwirksamkeit von Wirkstoffkandidaten ist die Toxizität neuer Substanzen ein Kernproblem der Pharmaforschung. Oft wird sie erst in fortgeschrittenen Phasen der kostspieligen Medikamentenentwicklung erkannt. In der konventionellen Medikamentenentwicklung werden Wirkstoffkandidaten, die an vorhandene Drug Targets binden, häufig in sogenannten Hochdurchsatzscreenings („High-Throughput-Screening“, HTS) aus einer Bibliothek mit zehntausenden Substanzen herausgefiltert. Hierzu werden meist etablierte Zelllinien verwendet, die aufgrund genomischer Veränderungen oft transformiert sind. Sie sind dadurch einfach zu kultivieren und genetisch modifizierbar und daher ideal für die Entwicklung und Durchführung von HTS-Verfahren, die ein einzelnes Drug Target oder einen Signalweg untersuchen. Das große Manko dieses Ansatzes liegt darin, dass die verwendeten Zelllinien in der Regel keinerlei Bezug zur Physiologie der Erkrankung und den davon betroffenen Zellen und Geweben haben. Zellspezifische Wirkungen und Nebenwirkungen von Wirkstoffkandidaten können damit also nicht erkannt werden. Phänotypisches Screening Die neuesten phänotypischen Screeningmethoden, bei denen Zellen als In vitro-Krankheitsmodelle fungieren sollen, versprechen dagegen entscheidende neue Impulse für • Get super effi cient pulldowns with Nano-Traps • Trace native proteins with Chromobodies ® • Enhance and stabilize fluorescent proteins with Nano-Booster • Analyze reversible proteinprotein-interactions with F2H assay ® Abb. 1: 35 Partner aus ganz Europa arbeiten im StemBANCC-Projekt mit. LABORWELT © StemBancc www.chromotek.com 14. Jahrgang | Nr. 3/2013 | VII
Seite 1 und 2: LABORWELT Nr. 3 / 2013 - 14. Jahrga
Seite 3 und 4: Intro Zellbasierte Assays Zellmodel
Seite 5: Parallele Dimension DASGIP ® Biore
Seite 9 und 10: Drug Screening Zellbasierte Assays
Seite 11 und 12: Diagnostik Advertorial ››› SE
Seite 13 und 14: Screening Advertorial ››› ZEL
Seite 15 und 16: Interaktionsanalyse Zellbasierte p5
Seite 17 und 18: RNAi-Knockdown Zellbasierte Assays
Seite 19 und 20: Verbände Service Diagnostik-Netzwe
Seite 21 und 22: BioTek Instruments Cytation TM 3 ve
Seite 23 und 24: The best thing that can happen to a

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