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Zellbasierte Assays Stammzellen
der Vergangenheit wurden etwa Assays zu
epigenetisch relevanten Enzymen entwickelt
wobei verschiedenste Detektionstechnologien
und die Automatisierung genutzt wurden.
Entsprechend gängiger Praxis wurden für
die Hit-Bestätigung und -Charakterisierung
auch zelluläre Sekundär-Assays entwickelt
und angewendet. Aktuell stehen beim ESP
sowohl für biochemische als auch zellbasierte
Screens eine Reihe modernster Technologien
sowie eine entsprechende Infrastruktur zur
Verfügung.
Für die Suche nach Stammzell-aktiven
Substanzen nutzte der ESP in der jüngsten
Vergangenheit aber vor allem phänotypische
Screens oder Screening-Formate. Anders als
beim Target-basierten Screening wird hierbei
eine komplexe physiologische Zellantwort
genutzt und mit geeigneten Detektionstechnologien
gemessen. Dabei kamen sowohl
einfache Lumineszenz-Technologien (Reporter-Gen-Assays)
als auch das High Content
Screening (HCS) zum Einsatz.
Vor allem das HCS bietet für Drug Discovery-Ansätze
enorme Möglichkeiten, da bei
dieser Bild-basierten Screening-Technologie
die Möglichkeit besteht, eine Vielzahl von
Parametern gleichzeitig zu bestimmen. So
lassen sich zugleich etwa Differenzierungsund/oder
Pluripotenz-Marker in Zellen
detektieren, aber auch morphologische
Eigenschaften von Organellen, Zellen oder
Zell-Populationen (z. B. Stammzell-Kolonien)
charakterisieren.
Projektbeispiele und
Performancedaten
An den folgenden Beispielen sollen das
Potential von Stammzellen und die vielfältigen
Möglichkeiten ihres Einsatzes in Ultra-
Hochdurchsatz- (uHTS)- und High Content-
Screens (HCS) verdeutlicht werden. Auch die
Kombination von uHTS für den Primärscreen
und HCS für das Hit-Profiling zur Bestimmung
von Dosiswirkungen scheint ein vielversprechender
Weg zu sein.
(1) In einem Verbund-Projekt der Systembiologie
wurde ein Hochdurchsatz-Screen
integriert und 250.000 Substanzen auf
ihre Wirksamkeit bezüglich Drug iPS untersucht.
Dabei kam ein einfaches Zellmodell
unter Verwendung von Reportergen-
Assays zum Einsatz, mit denen die Transkription
von vier relevanten Stammzell-
Faktoren getrennt nachgewiesen wurde.
Um die Spezifität der Ergebnisse nachzuweisen,
wurden rund 500 Hits in einem
Reporter-Gen-Counter-Assay getestet
sowie ihre Wirksamkeit dosisabhängig mit
11 Verdünnungen im Reportergen sowie in
vier korrespondierenden HCS-Assays mit
embryonalen Karzinom-Zellen charakterisiert.
Mittels Luciferase-Assay wurden
dabei 1,5 Millionen Datenpunkte erzeugt,
VI | 14. Jahrgang | Nr. 3/2013
Durchführung eines Drug iPS-Screens mittels uHTS und HCS
allein die Bild-Daten hatten eine Größe
von 2 Terabyte.
(2) In einem HCS-Projekt beinhaltete die Screening-Kampagne
einen phänotypischen
Primär-Screen bei dem mehr als 23.000 Substanzen
getestet wurden. Die Expression
wurde sowohl von Pluripotenz- als auch von
Differenzierungsmarkern in embryonalen
Stammzellen der Maus (mES) nachgewiesen.
Das ausgesprochen anspruchsvolle
Zellsystem und der Assay wurde vom akademischen
Partner (Institut für Stammzellforschung
am Helmholtz-Zentrum München)
entwickelt. Im HCS wurden sowohl ein endodermaler
Differenzierungsmarker sowie
der wichtigste Pluripotenzmarker als auch
die Morphologie der Zellen und Kolonien
detektiert beziehungsweise charakterisiert.
Besondere technologische Schwierigkeiten
wie der Mediumwechsel mit erneuter
Substanz-Zugabe als auch die Herausforderungen
einer komplexen Bilderkennung
wurden automatisiert gelöst. Durch den
Einsatz von weiteren Bioinformatik-Tools
konnte für diesen aufwendigen Screen eine
Hit-Expansion erreicht und eine Reihe von
analogen Substanzen ebenfalls im HCS als
Hits bestätigt und charakterisiert werden.
(3) In Zusammenarbeit mit einer akademischen
Forschungsgruppe und dem
Hersteller OLink werden dessen moderne
Färbemethoden (Proximity Ligation Assay)
eingesetzt und an die HCS-Anforderungen
angepasst um die Interaktion von Schlüsselmolekülen
in Stammzellen zu untersuchen,
wobei die Signal-Netzwerke bei
der genetischen Reprogrammierung und
Differenzierung zu neuronalen Zellen
analysiert werden.
(4) Die Charakterisierung von neuronalen
Zellen (neurite outgrowth) und Herzmuskelzellen
(cardiac hypertrophy) kann mit
einem spezifischen HCS-Assay analysiert
werden. Dieser Assay wurde auf Basis von
humanen iPS-Zellen von dem Partner Cellular
Dynamics International hergeleitet
und etabliert und steht somit für Drug
Discovery-Kampagnen zur Verfügung.
Diese Beispiele zeigen, dass Technologien
verfügbar sind, um Stammzellen auch in
Screening-Kampagnen einzusetzen und mit
den entsprechenden Pluripotenz-Markern in
Maus- und humanen-Stammzellen im Hochdurchsatz
zu detektieren.
Sowohl bei einfachen phänotypischen
Screens als auch komplexen HCS-Anwendungen
bestand in jüngster Vergangenheit die
wichtigste Aufgabe des ESP in der Überführung
und Anpassung der aktuellen relevanten
Forschungsergebnisse in „Screening-taugliche
Assay-Technologien“.
Ein Blick in die Zukunft zeigt, dass zusätzlich
zu den klassischen, bereits beschriebenen
Wirkmechanismen die nächste Generation
der Nachahmer-Proteinarzneimittel
völlig andere und zum Teil sehr individuelle
und produktspezifische Wirkmechanismen
hat, für die geeignete Verfahren zur Bestimmung
der Bioaktivität entwickelt werden
müssen.
Korrespondenzadresse
Oliver Keminer
European ScreeningPort GmbH
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Quelle: European ScreeningPort
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