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Zellbasierte Assays Drug Screening Abb 2: Aufgaben und Verknüpfung der Arbeitspakete (Work Package, WP) in StemBANCC. PNS: Periphere Neuropathien, CNS: Zentralnervöse neurodegenerative- und neurodysfunktionale Erkrankungen, QC: Qualitätskontrolle die Pharmaforschung. Im Idealfall stellt ein solches Zellmodell die physiologisch und pathologisch relevanten Aspekte einer Erkrankung realistisch nach und ist zugleich HTS-kompatibel. Zellmaterial Körpereigene, differenzierte Primärzellen sind im Prinzip das ideale Ausgangsmaterial für die Entwicklung zellbasierter Krankheitsmodelle, denn sie repräsentieren am besten die gewebespezifischen, physiologischen Prozesse in vivo. Allerdings lassen sich die meisten relevanten Primärzelltypen in Zellkultur nicht oder nur schlecht vermehren. Sie sind daher nicht in der benötigten Menge und Qualität verfügbar, in der sie in der Arzneimittelentwicklung benötigt werden. Diese Limitierung wurde durch zwei Kernentwicklungen weitgehend überwunden. Erstens: Im Zuge der Forschung an humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) wurden unlängst Kulturverfahren entwickelt, die diese sich selbst erneuernden Zellen in praktisch unbegrenzter Menge verfügbar machen [1,2] . Zusätzlich gelang es in zahlreichen Arbeiten, die In vitro-Differenzierung der pluripotenten Zellen in fast jeden humanen Zelltyp voranzutreiben [3] . Die Herstellung sogenannter induziert-pluripotenter Stammzellen (iPS-Zellen) [4] aus Körperzellen markiert einen zweiten Durchbruch. Dabei werden ausdifferenzierte adulte Zellen durch transiente Überexpression vier definierter Faktoren in einen pluripotenten „ES-Zellen äquivalenten“ Status reprogrammiert („targeted reprogramming“). Die bahnbrechenden Verfahren zur Herstellung von iPS-Zellen helfen, die ethisch VIII | 14. Jahrgang | Nr. 3/2013 bedenkliche Verwendung von Embryonen als Ursprung von hES-Zellen zu vermeiden. Zusätzlich eröffneten sie die vergleichsweise einfache Kultivierung pluripotenter Zellen aus Zellmaterial von Patienten, die an spezifischen, klinisch manifesten Erkrankungen leiden. Im Prinzip können iPS-Zellen damit als Ausgangsmaterial für die Bereitstellung großer Mengen generell jedes humanen, individualspezifischen Zelltyps dienen. Hierfür werden aus Patienten, bei denen ein Krankheitsbild gut dokumentiert ist, nach Einverständniserklärung („informed consent“) minimalinvasiv Zellen entnommen – etwa Fibroblasten aus Hautbiopsien oder Blutzellen – und daraus iPS-Zelllinien gewonnen. Nach Expansion dienen diese zur Differenzierung gewebespezifischer, erkrankungsrelevanter Zelltypen, mit denen krankheitsassoziierte Prozesse in Zellkultur gut nachgebildet und funktionell validiert werden können. Als wichtige Kontrollen dienen hierbei iPS-Zellen und deren Abkömmlinge aus nicht erkrankten, genetisch verwandten Patienten, die keine krankheitsauslösende Genmutation tragen. Alternativ oder zusätzlich werden iPS-Zellen von verschiedenen „gesunden“ Kontrollprobanden als Vergleichspopulation herangezogen, um die Spezifität und Aussagekraft eines Zellmodells kritisch zu prüfen. Bei einem Wirkstoffscreening können dann im Prinzip sogar phänotypische Unterschiede zwischen einem krankheitsspezifischen Zellmodell im Vergleich zum „gesunden Kontrollmodell“ zur Auswertung („Readout“) herangezogen werden, ohne die molekularen Grundlagen der Erkrankung (also die vermeintlichen Drug Targets) in allen Einzelheiten zu kennen. Die revolutionären Möglichkeiten dieser Technik dürfen nicht darüber hinwegtäuschen, © StemBancc dass die Verfahren extrem komplex sind und die Zusammenarbeit von Klinikern, Grundlagenforschern und der Pharmaindustrie erfordern, um ihr Potential voll zu erschließen. Hier setzt StemBANCC (StemBANCC.org) an, ein von der Innovative Medicines Initiative (IMI; imi.europa.eu) gefördertes Projekt [6] . IMI ist eine Public Private Partnership der Europäischen Kommission mit dem EU-Pharmaverband EFPIA (efpia.eu). Abzielend auf die zunehmende Inzidenz von Erkrankungen einer alternden Gesellschaft, hat das Programm fünf Krankheitsgruppen ins Visier genommen. Hierzu zählen periphere Neuropathien (beispielsweise krankhafte Schmerzen und Amyotrophe Lateralsklerose), zentralnervöse neurodegenerative- und neurodysfunktionale Erkrankungen (einschließlich Migräne, Demenz, Autismus und Schizophrenie) sowie Diabetes und Patienten mit prominenter Arzneimittelallergie („adverse drug reaction“). Ein Kernziel des Programms, das im Oktober 2012 begann und forschende Pharmafirmen für fünf Jahre mit Forschern aus der Akademia zusammenbringt, ist die Isolierung und Charakterisierung von 1.500 iPS-Zelllinien – wobei jeweils drei Linien aus ingesamt 500 Patienten inklusive einer Population von Kontrollprobanden hergestellt werden sollen. Abgelegt in einer Biobank, werden diese Zelllinien weltweit der Forschung zur Verfügung stehen. Ambitioniertes Arbeitsprogramm Mit einem ambitionierten Arbeitsprogramm und 35 beteiligten Partnerorganisationen in ganz Europa (Abb. 1, Details unter www.stembancc.org) steht StemBANCC vor zahlreichen logistischen und vor allem technologischen Herausforderungen. Bei der Induktion von iPS-Zellen besteht zum einen das Problem, dass teilweise unvollständig reprogrammierte Zellartefakte entstehen, die iPS- Zellen morphologisch ähneln, die Eigenschaften ursprünglicher iPS-Linien jedoch nicht widerspiegeln. Die andere Gefahr besteht in der Induktion genomischer Veränderungen (Aberrationen) – hervorgerufen durch den Prozess der Reprogrammierung selbst oder durch die Anreicherung chromosomaler Variabilität, die bereits in den Ausgangszellen vorhanden ist. Die Inzidenz hierfür scheint vom Alter des Patienten abhängig zu sein, eventuell von der vorliegenden Erkrankung sowie vom somatischen Zelltyp, der zur Reprogrammierung verwendet wird. Außerdem wurde in jüngster Zeit eine Vielzahl von Techniken zur Induktion von iPS-Zellen beschrieben. Sie reichen von genomisch integrierenden und nicht-integrierenden viralen Genfähren über proteinbasierte Ansätze bis hin zu chemischen Wirkstoffen, die alle ihre Vor- und Nachteile haben [5] . Als Konsequenz setzt StemBANCC strikt auf die Vereinheitlichung von Methoden, um die LABORWELT
Drug Screening Zellbasierte Assays bestmögliche Qualität und Vergleichbarkeit der etablierten iPS-Zelllinien in der entstehenden Zellbank sicherzustellen. Basierend auf der Erfahrung der Pharmapartner wurden „Standard Operating Procedures“ (SOPs) etabliert, die den Ablauf bei der Entnahme von Zellproben in der Klinik regeln sowie die verwendete Reprogrammierungsmethode und die Kriterien beim „Picken“ entstehender iPS-Zellklone. Ebenso sind die anschließenden Verfahren und Materialien zur Kultivierung, Kryokonservierung und Lagerung der Zelllinien in der Biobank klar definiert. Für die Reprogrammierung wurde ein kommerzielles, Sendai-basiertes Kit gewählt (CytoTune®, LifeTechnologies), da das Verfahren bereits gut etabliert ist, hierbei keine Integration der Reprogrammierungsfaktoren ins Genom auftritt und auch die patentrechtliche Situation klar ist. Der nächste Kernpunkt von StemBANCC zielt auf die Charakterisierung der generierten iPS-Linien nach aktuellen Standards ab. Hierfür werden molekulare Profile auf Ebene des Genoms, <strong>Transkript</strong>oms, Proteoms und Metaboloms erstellt. Um ihre Identität und Qualität eindeutig zu bestätigen, werde die iPS-Linien nach standardisierten Protokollen in repräsentative Zelltypen differenziert. Die „Omics“ und Differenzierungsdaten fließen in einem spezifischen Arbeitspaket zusammen, werden bioinformatisch ausgewertet und anschließend mit den zugrundeliegenden, reichhaltigen Klinikdaten verknüpft und sicher hinterlegt. Abzielend auf die praktische Anwendung der Zellen für die In vitro-Modellierungen von Erkrankungen, umfasst das Programm zahlreiche Arbeitspakete (Abb. 2), die auf die Weiterentwicklung der Massenkultivierung undifferenzierter Zellen abzielen sowie deren effiziente Differenzierung in relevante, neuronale Subtypen und pankreatische Betazellen zum Ziel haben. Die Zelltypen werden molekular, funktionell und pharmakologisch charakterisiert und einem weiteren Kernziel des Programms zugeführt: der Entwicklung von Assays, die neben den phänotypischen Aspekten der Erkrankung auch ein Wirkstoffscreening erlauben sollen; hierbei ist auch die Reparatur bekannter Gendefekte zur Bereitstellung isogener iPS-Kontrollzelllinien vorgesehen sowie die spezifische Integration von Reportergenen, jeweils durch homologe Rekombination in definierte Loci. Außerdem wird an der Bereitstellung von Kardiomyozyten, Hepatozyten und Nierenzellen gearbeitet, die als wichtige Zelltypen vor allem für toxikologische Assays in der Wirkstoffentwicklung dienen. Fazit Ein solches Unterfangen kann nur durch professionelles Projektmanagement gelingen. In StemBANCC wurde hierfür ein übergeordnetes Arbeitspaket etabliert, das über die Projektlaufzeit hinaus die Organisation, die projektinterne Kommunikation und die Interaktion mit relevanten europäischen und internationalen Programmen fördert. Zusammenfassend soll StemBANCC ein Ressourcenzentrum werden, das gut charakterisierte humane iPS-Zelllinien für ein breites Spek trum neuronaler, neurodegenerativer, aber auch einiger Stoffwechsel- und Herzmuskel-spezifischer Erkrankung bereitstellt. Gepaart mit einer systematischen Dokumentation der Eigenschaften dieser Zelllinien und dem zugrundeliegenden, klinischen Krankheitsbild, bietet das Projekt eine ausgezeichnete Grundlage für die anvisierte Innovation bei der Entwicklung von Krankheitsmodellen in der Kulturschale – und damit die Basis für ein besseres Verständnis von Krankheitsursachen und zur Entwicklung wirkungsvoller Medikamente. Literatur [1] Olmer R, Lange A, Selzer R S, Kasper C, Haverich A, Martin U, Zweigerdt R. (2012). Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue engineering. Part C, Methods 18,772-84. [2] Zweigerdt R, Olmer R, Singh H, Haverich A, Martin U. (2011). Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature protocols 6,689-700. [3] Williams LA, Davis-Dusenbery BN, Eggan KC. (2012). SnapShot: directed differentiation of pluripotent stem cells. Cell 149,1174-1174 e1. [4] Takahashi K, Yamanaka S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126,663-76. [5] Gonzalez F, Boue S, Izpisua Belmonte JC. (2011). Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nature reviews. Genetics 12,231-42 [6] Support from the Innovative Medicines Initiative joint undertaking under grant agreement n° 115439, resources of which are composed of financial contribution from the European Union‘s Seventh Framework Programme (FP7/2007- 2013) and EFPIA companies‘ in kind contribution Korrespondenzadresse Dr. Robert Zweigerdt Medizinische Hochschule Hannover (MHH) Klinik für Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie (HTTG) Leibniz Laboratorien für Biotechnologie und künstliche Organe (LEBAO) REBIRTH - Zentrum für Regenerative Medizin Carl-Neuberg-Str. 1, 30625 Hannover Tel.: +49-(0)511-532 5023, Fax: -532 8819 zweigerdt.robert@mh-hannover.de NanoLuc ® Lernen Sie die nächste Generation der Luciferase Reporter kennen! 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Seite 13 und 14: Screening Advertorial ››› ZEL
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Seite 21 und 22: BioTek Instruments Cytation TM 3 ve
Seite 23 und 24: The best thing that can happen to a

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