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Interaktionsanalyse<br />

Zellbasierte p53:Mdm2 und<br />

p53:Mdm4 HCS-Assays<br />

Die spezifische Aufhebung von Protein-Protein-Interaktionen (PPI)<br />

ist ein attraktiver Angriffspunkt für die Wirkstofffindung. Allerdings<br />

mangelt es bisher aufgrund der biologischen Komplexität an zuverlässigen<br />

und flexiblen zellbasierten Screening-Assays.<br />

Mit der im vergangenen Jahr publizierten Fluorescent Two-Hybrid<br />

(F2H)-Technologie (Me t h o d s Mo l Bi o l. 812: 275-82) steht eine neuartige<br />

mikroskopische Methode für das zellbasierte Screening zur Verfügung,<br />

die gängige Probleme löst. Der F2H-Assay ist vielseitig anwendbar,<br />

vollständig reversibel und liefert schnelle und leicht auslesbare<br />

Daten: Die interaktionsabhängige Kolokalisation von zwei unterschiedlichen,<br />

fluores zierenden Fusionsproteinen an der definierten<br />

Interaktionsplattform (ein inerter Verankerungspunkt im Nukleus<br />

von Säugerzellen). Mit dieser Methode konnte bereits eine Vielzahl<br />

von Protein-Protein-Interaktionen aus unterschiedlichen zellulären<br />

Kompartimenten – wie etwa Zytoplasma, Mitochondrien oder Zellkern-<br />

Zytoplasma pendelnde Proteine – erfolgreich darstellt werden.<br />

Interaktion<br />

GFP<br />

RFP<br />

Mdm<br />

2/4<br />

p53<br />

0 h<br />

p53/Mdm2<br />

+ Nutlin-3<br />

p53/Mdm4<br />

+ sMTide-02<br />

anchor<br />

Keine<br />

Interaktion<br />

Mdm<br />

2/4<br />

RFP<br />

Interaktionsplattform<br />

GFP<br />

p53<br />

Wirkstoffzugabe<br />

time<br />

1 h<br />

2 h<br />

Ihre Pipettierhilfe für das Labor<br />

anchor<br />

Interaktionsplattform<br />

7 h<br />

• CyBi ® -SELMA<br />

Schema der Protein-Protein-Interaktionsanalyse (links) und<br />

p53:Mdm2/Mdm4-Interaktion<br />

Darauf basierend haben wir zwei reversible F2H-Assays etabliert, um<br />

die Protein-Protein-Interaktionen zwischen dem Tumorsuppressor<br />

p53 und seinen Gegenspielern Mdm2 und Mdm4/MdmX parallel<br />

zu analysieren. Durch diese vergleichenden zellulären Assays können<br />

unterschiedliche Arten von Substanzen untersucht werden,<br />

beispielsweise Peptide oder niedermolekulare Substanzen („small<br />

molecules“). Dabei lassen sich direkt zellgängige Wirkstoffkandidaten<br />

identifizieren und charakterisieren. Wir bestimmen ihre Effizienz, die<br />

p53:Mdm2-Interaktion aufzuheben, durch automatisierte Mikroskopie<br />

und Bildauswertung. Gleichzeitig werden die jeweiligen Daten für<br />

die p53:Mdm4-Inhibition ausgewertet, und so vergleichende Studien<br />

angestellt. Außerdem liefern die zellulären Aufnahmen des F2H-Assays<br />

initiale Daten zur Zytotoxizität der untersuchten Substanzen. Zusätzlich<br />

können die F2H-Assays auch in lebenden Zellen durchgeführt und<br />

analysiert werden, wodurch in Echtzeit die Kinetik einer zellulären<br />

Protein-Protein-Interaktion visualisiert wird.<br />

» Semi-automatischer Pipettierer<br />

» Schnelles und präzises Replizieren<br />

oder Befüllen von 96- und 384-<br />

Well Mikroplatten<br />

» Bewährte HTS-Technologie in<br />

einem kompakten Benchtop-<br />

System<br />

» Einfache und intuitive Bedienung<br />

mittels Touchscreen<br />

» Automatische Pipettierparameter<br />

und Speicherfunktion von kompletten<br />

Methoden<br />

Kontakt<br />

Dr. Kourosh Zolghadr<br />

ChromoTek GmbH<br />

Am Klopferspitz 19<br />

82152 Martinsried<br />

+49. 89. 78 79 73 06<br />

+49. 89. 78 79 73 11<br />

k.zolghadr@chromotek.com<br />

www.chromotek.com<br />

LABORWELT<br />

European LabAutomation 2013<br />

06.- 07.06.2013<br />

Hamburg | Standnummer 29<br />

Liquid Handling. Automation. Service.<br />

info@cybio-ag.com<br />

www.cybio-ag.com<br />

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