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Interaktionsanalyse<br />
Zellbasierte p53:Mdm2 und<br />
p53:Mdm4 HCS-Assays<br />
Die spezifische Aufhebung von Protein-Protein-Interaktionen (PPI)<br />
ist ein attraktiver Angriffspunkt für die Wirkstofffindung. Allerdings<br />
mangelt es bisher aufgrund der biologischen Komplexität an zuverlässigen<br />
und flexiblen zellbasierten Screening-Assays.<br />
Mit der im vergangenen Jahr publizierten Fluorescent Two-Hybrid<br />
(F2H)-Technologie (Me t h o d s Mo l Bi o l. 812: 275-82) steht eine neuartige<br />
mikroskopische Methode für das zellbasierte Screening zur Verfügung,<br />
die gängige Probleme löst. Der F2H-Assay ist vielseitig anwendbar,<br />
vollständig reversibel und liefert schnelle und leicht auslesbare<br />
Daten: Die interaktionsabhängige Kolokalisation von zwei unterschiedlichen,<br />
fluores zierenden Fusionsproteinen an der definierten<br />
Interaktionsplattform (ein inerter Verankerungspunkt im Nukleus<br />
von Säugerzellen). Mit dieser Methode konnte bereits eine Vielzahl<br />
von Protein-Protein-Interaktionen aus unterschiedlichen zellulären<br />
Kompartimenten – wie etwa Zytoplasma, Mitochondrien oder Zellkern-<br />
Zytoplasma pendelnde Proteine – erfolgreich darstellt werden.<br />
Interaktion<br />
GFP<br />
RFP<br />
Mdm<br />
2/4<br />
p53<br />
0 h<br />
p53/Mdm2<br />
+ Nutlin-3<br />
p53/Mdm4<br />
+ sMTide-02<br />
anchor<br />
Keine<br />
Interaktion<br />
Mdm<br />
2/4<br />
RFP<br />
Interaktionsplattform<br />
GFP<br />
p53<br />
Wirkstoffzugabe<br />
time<br />
1 h<br />
2 h<br />
Ihre Pipettierhilfe für das Labor<br />
anchor<br />
Interaktionsplattform<br />
7 h<br />
• CyBi ® -SELMA<br />
Schema der Protein-Protein-Interaktionsanalyse (links) und<br />
p53:Mdm2/Mdm4-Interaktion<br />
Darauf basierend haben wir zwei reversible F2H-Assays etabliert, um<br />
die Protein-Protein-Interaktionen zwischen dem Tumorsuppressor<br />
p53 und seinen Gegenspielern Mdm2 und Mdm4/MdmX parallel<br />
zu analysieren. Durch diese vergleichenden zellulären Assays können<br />
unterschiedliche Arten von Substanzen untersucht werden,<br />
beispielsweise Peptide oder niedermolekulare Substanzen („small<br />
molecules“). Dabei lassen sich direkt zellgängige Wirkstoffkandidaten<br />
identifizieren und charakterisieren. Wir bestimmen ihre Effizienz, die<br />
p53:Mdm2-Interaktion aufzuheben, durch automatisierte Mikroskopie<br />
und Bildauswertung. Gleichzeitig werden die jeweiligen Daten für<br />
die p53:Mdm4-Inhibition ausgewertet, und so vergleichende Studien<br />
angestellt. Außerdem liefern die zellulären Aufnahmen des F2H-Assays<br />
initiale Daten zur Zytotoxizität der untersuchten Substanzen. Zusätzlich<br />
können die F2H-Assays auch in lebenden Zellen durchgeführt und<br />
analysiert werden, wodurch in Echtzeit die Kinetik einer zellulären<br />
Protein-Protein-Interaktion visualisiert wird.<br />
» Semi-automatischer Pipettierer<br />
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Well Mikroplatten<br />
» Bewährte HTS-Technologie in<br />
einem kompakten Benchtop-<br />
System<br />
» Einfache und intuitive Bedienung<br />
mittels Touchscreen<br />
» Automatische Pipettierparameter<br />
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Methoden<br />
Kontakt<br />
Dr. Kourosh Zolghadr<br />
ChromoTek GmbH<br />
Am Klopferspitz 19<br />
82152 Martinsried<br />
+49. 89. 78 79 73 06<br />
+49. 89. 78 79 73 11<br />
k.zolghadr@chromotek.com<br />
www.chromotek.com<br />
LABORWELT<br />
European LabAutomation 2013<br />
06.- 07.06.2013<br />
Hamburg | Standnummer 29<br />
Liquid Handling. Automation. Service.<br />
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