NOVA LiteTM F-Actin Rat Epithelial - inova

NOVA Lite TM IgG F-Actin 708250
Nur für Export. Nicht zum Verkauf in den USA.
Für die in-vitro-Diagnostik
CLIA-Komplexität: hoch
Verwendungszweck
Der NOVA Lite TM IgG F-Actin ist ein indirekter Immunfluoreszenz-Assay (IFA) auf einem
Darmepithelsubstrat aus der Ratte für das Screening und die semiquantitative Bestimmung von
Anti-F-Actin-IgG-Antikörpern in menschlichem Serum. Der Nachweis von Anti-F-Actin-IgG-
Antikörpern kann in Verbindung mit klinischen Befunden und anderen Labortests bei der
Diagnose von autoimmunen Lebererkrankungen wie etwa Autoimmunhepatitis (AIH) und
primär-biliärer Leberzirrhose (PBC) behilflich sein.
Zusammenfassung und Erklärung des Tests
Anti-F-Actin-IgG-Autoantikörper sind der Hauptbestandteil der sogenannten Antikörper gegen
glatte Muskulatur (ASMA). 1-6 Diese Antikörper sind bei bis zu 80% der Patienten mit
Autoimmunhepatitis (AIH) sowie bei bis zu 30% der Patienten mit primär-biliärer Zirrhose 2,6 zu
finden, ebenso wie bei Personen ohne AIH (in der Regel niedrige Titer). ASMA sind heterogen
und umfassen Antikörper gegen filamentöse (F) und globuläre (G) Formen von Actin sowie
andere Komponenten wie Tubulin und intermediäre Filamente. 3,4,7 Eine Reihe von
Autoantikörpern werden mit AIH assoziiert. IgG-Antikörper gegen F-Actin sind die
Autoantikörper mit der höchsten Spezifität für AIH. 2,5
F-Actin-IgG-ELISA, wie etwa der QUANTA Lite Actin IgG ELISA, ermöglichen den
quantifizierbaren Nachweis von Anti-F-Actin-IgG-Antikörpern bei einer Person, einige Labors
bevorzugen jedoch IFA-Verfahren zum Screening auf F-Actin-IgG-Antikörper oder deren
Bestätigung im Falle eines Nachweises anhand eines herkömmlichen Nieren-/Magen-
/Lebergewebeschnitts aus Nagern. Eine Differenzierung zwischen Anti-F-Actin-Antikörpern und
anderen Antikörpern gegen Bestandteile der glatten Muskulatur gestaltet sich oft als schwierig
anhand herkömmlicher IFA-Substrate wie Nieren-/Magen-/Lebergewebeschnitte. 2,5 Die
Identifizierung von Anti-F-Actin-Antikörpern ist bei der Diagnose von AIH äußerst hilfreich.
Derzeit gibt es kein „Goldstandard”-Verfahren zur Unterscheidung zwischen Anti-F-Actin und
1,2
anderen Reaktivitäten. Objektträger mit Epithelzellen aus Rattendarm, die anhand
patentrechtlich geschützter Wachstums- und Fixierverfahren hergestellt wurden, bieten eine
neue Substratoption für den Nachweis von Anti-F-Actin-IgG-Antikörpern mittels IFA. Mit diesem
Substrat werden einige der Einschränkungen anderer IFA-Verfahren überwunden, da das Anti-
F-Actin-IgG-Muster unterschiedlich ist und andere Antikörper, die auf Nieren/-Magen-/Leber-
Objektträgern Musterinterferenzen verursachen, auf dem Substrat mit Rattenepithelzellen nicht
interferieren.
Verfahrensprinzipien
Bei der indirekten Immunfluoreszenz werden Proben mit dem Antigensubstrat inkubiert und
ungebundene Antikörper durch Waschen entfernt. Das Substrat wird mit einem spezifischen
Fluorescein-markierten Konjugat inkubiert und ungebundene Reagenz durch Waschen entfernt.
Bei Betrachtung durch ein Fluoreszenzmikroskop weisen die Proben eine apfelgrüne
Fluoreszenz auf, die jenen Bereichen entspricht, wo der Autoantikörper gebunden ist. Eine
Probe gilt als positiv, wenn sich eine spezifische Färbung der F-Actin-Fasern um den Großteil
der Zellen herum in einem hexagonalen Muster und zuweilen der Fasern über Zellen
beobachten lässt.
Reagenzien
1. F-Actin-Objektträger; 12 Vertiefungen/Objektträger, mit Trockenmittel
2. Anti-Human-IgG-Konjugat (Ziege), Fluorescein-markiert in Puffer mit Evans Blau und
0,09% Natriumazid
3. IgG F-Actin Positivkontrolle, 1 Fläschchen Puffer mit 0,09% Natriumazid und humanen
Serumantikörpern gegen F-Actin, vorverdünnt
4. IFA-System Negativkontrolle, 1 Fläschchen Puffer mit 0,09% Natriumazid und nichthumanen
Serumantikörpern gegen F-Actin, vorverdünnt
5. PBS-Konzentrat (40-fach)
6. Eindeckmedium, 0,09%Natriumazid
7. Deckgläser
1

Warnhinweise
1. Sämtliches Material menschlichen Ursprungs, das für die Zubereitung der Kontrollen für
dieses Produkt verwendet wurde, wurde anhand eines von der US-amerikanischen
Arzneimittelbehörde FDA zugelassenen Verfahrens auf das Vorhandensein von HIV-,
HBsAg- und HCV-Antikörpern getestet und als negativ befunden. Das Vorhandensein
von HIV, HBV, HCV bzw. anderen Infektionsträgern kann mit keiner Testmethode
vollständig ausgeschlossen werden. Daher sind die IgG F-Actin Positivkontrolle und IFA-
System Negativkontrolle als potenziell infektiös zu behandeln. 8
2. Natriumazid wird als Konservierungsmittel verwendet. Natriumazid ist ein Giftstoff und
kann bei Verschlucken oder Aufnahme über die Haut bzw. Augen toxische Reaktionen
auslösen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohrleitungen reagieren und explosive
Metallazide bilden. Spülen Sie nach einer Entsorgung von Reagenzien über den Ausguss
mit reichlich Wasser nach, um mögliche Azidablagerungen zu verhindern.
3. Tragen Sie beim Hantieren mit den Reagenzien eine geeignete persönliche
Schutzausrüstung.
4. Verschüttete Reagenzien sofort aufwischen. Beachten Sie bei der Abfallentsorgung alle
bundes- und/oder landesweiten sowie örtlichen Vorschriften.
Vorsichtsmaßnahmen
1. Dieses Produkt ist für die in-vitro-Diagnostik vorgesehen.
2. Eine Verwendung anderer Bestandteile als der mit diesem Kit mitgelieferten kann zu
widersprüchlichen Ergebnissen führen.
3. Unvollständiges oder nachlässiges Waschen der IFA-Vertiefungen kann zu starkem
Hintergrund führen.
4. Wird dieser Test ganz oder teilweise an automatische Proben- oder andere
Flüssigkeitsverarbeitungsgeräte adaptiert, so kann dies gegenüber dem manuellen
Verfahren zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Es liegt in der Verantwortung eines
jeden Labors, die automatische Verarbeitung so zu validieren, dass Testergebnisse
innerhalb akzeptabler Bereiche erzielt werden.
5. Das Testergebnis wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Dazu zählen u.a. die
Ausgangstemperatur der Reagenzien, Lichtstärke der Mikroskoplampe, Genauigkeit und
Reproduzierbarkeit des Pipettierverfahrens, Gründlichkeit beim Waschen und Dauer der
Inkubationszeiten während des Tests. Achten Sie daher unbedingt auf konsistente
Bedingungen, um präzise und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
6. Es empfiehlt sich eine strenge Einhaltung des Protokolls.
Lagerung
1. Lagern Sie alle Reagenzien des Kits bei 2-8°C. Nicht einfrieren. Bei vorschriftsmäßiger
Lagerung und Handhabung sind die Reagenzien bis zum angegebenen Verfallsdatum
haltbar.
2. Verdünnter PBS-Puffer ist 4 Woche bei 2-8°C haltbar.
Probenentnahme
Dieses Testverfahren muss mit einer Serumprobe durchgeführt werden. Eine Zugabe von Azid
oder anderen Konservierungsmitteln zu den Testproben kann die Ergebnisse nachteilig
beeinflussen. Wärmebehandelte Proben bzw. Proben mit mikrobieller Kontamination, stark
hämolysierte oder lipämische Proben mit sichtbaren Partikeln dürfen nicht verwendet werden.
Nach der Entnahme Serum vom Gerinnsel trennen. Das Dokument H18-A3 des National
Committee on Clinical Laboratory Standards (NCCLS) empfiehlt folgende
Lagerungsbedingungen für Proben: 1) Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur bis maximal
8 Stunden. 2) Wird der Test nicht innerhalb von 8 Stunden durchgeführt, ist die Probe bei 2-8°C
kühl zu lagern. 3) Wird der Test nicht innerhalb von 48 Stunden durchgeführt bzw. für
Transportzwecke ist die Probe bei mindestens -20°C einzufrieren. Eingefrorene Proben müssen
nach dem Auftauen und vor dem Testen gut durchgemischt werden.
Verfahren
Packungsinhalt
5 F-Actin-Objektträger, 12 Vertiefungen
1 Anti-Human-IgG-Konjugat (FITC), 7 ml
1 IgG F-Actin Positivkontrolle, 0,8 ml
1 IFA-System Negativkontrolle, 0,5 ml
2 PBS-Konzentrat (40-fach), 25 ml
2

1 Eindeckmedium, 7 ml
1 Packung mit 10 Deckgläsern
Zusätzlich benötigtes Material (nicht enthalten)
Mikropipetten zum Pipettieren von 15-1000 μl
Destilliertes oder deionisiertes Wasser
Spritzflaschen oder Pasteurpipetten
Feuchtkammer
1L-Behälter (zur Verdünnung der PBS)
Coplin-Gefäß
Fluoreszenzmikroskop mit 495 nm Erregerfilter und 515 nm Sperrfilter
Verfahren
Testvorbereitung
1. Lassen Sie alle Reagenzien und Proben Raumtemperatur (20-26 o C) annehmen.
2. Verdünnen Sie das PBS-Konzentrat: BITTE BEACHTEN: Verdünnen Sie das PBS-
Konzentrat im Verhältnis 1:40, indem Sie dem gesamten Inhalt der Flasche mit dem
PBS-Konzentrat 975 ml destilliertes bzw. deionisiertes Wasser hinzufügen und gut
mischen. Der PBS-Puffer wird zur Verdünnung der Patientenproben und als Waschpuffer
verwendet. Der verdünnte Puffer kann bis zu 4 Wochen bei 2-8°C gelagert werden.
3. Verdünnen der Patientenproben:
a. Erstes Screening: Verdünnen Sie die Patientenproben im Verhältnis 1:40 mit
verdünntem PBS-Puffer (d.h. fügen Sie zu 1,95 ml PBS-Puffer 50 μl Serum hinzu).
b. Titrierung: Stellen Sie serielle Zweifachverdünnungen aus der Verdünnung des
Eingangsscreenings für alle positiven Proben mit verdünntem PBS-Puffer her (d.h.
1:80, 1:160, 1:320... bis zum Endpunkt).
Testablauf
1. Vorbereitung der Substrat-Objektträger: Lassen Sie den Objektträger
Raumtemperatur annehmen, bevor Sie ihn aus dem Beutel nehmen. Beschriften Sie den
Objektträger mit einem Bleistift und legen Sie ihn in eine geeignete Feuchtkammer.
Geben Sie 1 Tropfen (20-25 μl) der unverdünnten positiven und negativen Kontrolle in
die Vertiefungen 1 bzw. 2.Geben Sie 1 Tropfen (20-25 μl) der verdünnten Patientenprobe
in die restlichen Vertiefungen.
2. Inkubation der Objektträger: Inkubieren Sie den Objektträger 30 ± 5 Minuten lang in
einer Feuchtkammer (ein feuchtes Papiertuch flach auf den Boden eines verschlossenen
Kunststoff- oder Glasbehälters gelegt sorgt für die richtigen Feuchtigkeitsbedingungen).
Lassen Sie das Substrat während des Testablaufs nicht austrocknen!
3. Objektträger waschen: Waschen Sie das Serum nach der Inkubation mithilfe einer
Spritzflasche oder Pipette vorsichtig mit verdünntem PBS-Puffer ab. Richten Sie den
Objektträger und den PBS-Strahl so aus, dass keine Probe in andere Vertiefungen
gelangt. Richten Sie den Strahl niemals direkt auf die Vertiefungen, um eine
Beschädigung des Substrats zu vermeiden. Falls gewünscht, können Sie die
Objektträger bis zu 5 Minuten in ein Coplin-Gefäß mit verdünntem PBS-Puffer legen.
4. Zugabe des Fluoreszenzkonjugats: Überschüssigen PBS-Puffer ablaufen lassen.
Geben Sie den Objektträger zurück in die Feuchtkammer und decken Sie jede Vertiefung
sofort mit einem Tropfen Fluoreszenzkonjugat ab. Inkubieren Sie die Objektträger für
weitere 30± 5 Minuten.
5. Objektträger waschen: Wiederholen Sie Schritt 3.
6. Deckglas: Jedes Labor hat zwar seine eigene Methode zum Eindecken von
Objektträgern, folgendes Verfahren wird jedoch empfohlen:
a. Legen Sie das Deckglas auf ein Papiertuch.
b. Tragen Sie das Eindeckmedium durchgehend auf den unteren Rand des
Deckglases auf.
c. Überschüssigen PBS-Puffer ablaufen lassen. Legen Sie den Objektträger mit der
unteren Kante zuerst auf das Deckglas auf und senken Sie ihn langsam auf das
Deckglas ab, sodass das Eindeckmedium zur oberen Kante des Objektträgers
fließt, ohne dass sich Luftblasen bilden bzw. eingeschlossen werden.
3

Qualitätskontrolle
Die IgG F-Actin Positivkontrolle und IFA-System Negativkontrolle sollten auf jedem Objektträger
mitgeführt werden, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien und Arbeitsschritte richtig
ausgeführt wurden. Geeignete zusätzliche Kontrollseren können mittels Aliquotierung gepoolter
Humanserumproben gewonnen und bei < -70 o C gelagert werden. Die Testergebnisse gelten als
gültig, wenn alle nachstehend aufgelisteten Kriterien erfüllt wurden. Wurde eines dieser Kriterien
nicht erfüllt, so müssen das Testergebnis als ungültig angesehen und der Test wiederholt
werden.
1. Die unverdünnte F-Actin-IgG-Antikörper Positivkontrolle muss > 3+ sein.
2. Die IFA-System Negativkontrolle muss negativ sein.
Interpretation der Ergebnisse
Negative Reaktion: Eine Probe gilt als negativ, wenn die spezifische Färbung (siehe
Beschreibung unter „Positive Reaktion“ gleich wie oder weniger als die IFA-System
Negativkontrolle ist. Proben können verschiedene Stufen einer spezifischen Färbung bzw.
Hintergrundfärbung anderer Zellkomponenten aufweisen, jedoch negativ für Anti-F-Actin-IgG-
Antikörper sein.
Positive Reaktion: Eine Probe gilt als positiv, wenn sich eine spezifische Färbung mit größerer
Intensität als die IFA-System Negativkontrolle auf den F-Actin-Fasern um den Großteil der
Zellen herum in einem hexagonalen Muster und zuweilen auf den Fasern über Zellen
beobachten lässt.
Bestimmen Sie den Grad bzw. die Intensität der Fluoreszenz anhand folgender Kriterien:
4+ Grelle apfelgrüne Fluoreszenz
3+ Helle apfelgrüne Fluoreszenz
2+ Deutlich erkennbare positive Fluoreszenz
1+ Niedrigste spezifische Fluoreszenz, die eine deutliche Differenzierung der F-Actin-
Färbung von der Hintergrundfluoreszenz ermöglicht.
Auswertung des Musters: Je nach Art und relativer Anzahl der in der Probe vorhandenen
Antikörper lassen sich verschiedene Muster nukleärer und/oder zytoplasmatischer Färbung
feststellen. Es sollte nur das oben unter „Positive Reaktion“ beschriebene Muster als positiv für
Anti-F-Actin-IgG-Antikörper gewertet werden. Alle anderen Muster sind als negativ zu werten.
Grenzen des Verfahrens
1. Ein Anti-F-Actin-IgG-Muster mit hohem Titer weist auf AIH hin, sollte jedoch nicht als
diagnostisch gewertet werden. Das Anti-F-Actin-IgG-Ergebnis ist gemeinsam mit anderen
Laborbefunden sowie der Anamnese des Patienten zu betrachten.
2. Die Testsensitivität wird von einer Reihe externer Faktoren beeinflusst, u.a. die Art des
verwendeten Fluoreszenzmikroskops, Stärke und Alter der Lichtquelle, verwendete
Vergrößerung, Filtersystem und Erfahrung des Anwenders.
3. Wird anstelle des 515nm-Sperrfilters ein Bandpassfilter verwendet, kommt es
möglicherweise zu verstärkter Artefaktbildung.
4. Zur Beschriftung der Objektträger sollte ausschließlich ein Bleistift verwendet werden. Bei
Verwendung anderer Schreibutensilien können Artefakte entstehen.
5. Alle zum Waschen der Objektträger verwendeten Coplin-Gefäße müssen frei von
jeglichen Farbstoffrückständen sein. Bei Verwendung von Coplin-Gefäßen mit
Farbstoffrückständen können Artefakte entstehen.
6. Die Leistungsdaten des Tests wurden ausschließlich für Serum bestimmt und nicht für
Plasma oder andere Probenarten.
Erwartungswerte
Die Eignung des NOVA Lite TM IgG F-Actin für den Nachweis von F-Actin-IgG-Antikörpern wurde
anhand des Vergleichs mit dem im Handel erhältlichen QUANTA Lite TM F-Actin IgG ELISA
(INOVA Diagnostics, Inc) beurteilt. Die ELISA-Ergebnisse wurden als positiv bestätigt, wenn die
Patientenprobe > Einheiten betrug und als negativ, wenn sie < als 20 Einheiten betrug.
Normalbereich
493 Proben von normalen Blutspendern wurden mit dem NOVA Lite TM IgG F-Actin getestet. Mit
Ausnahme von 4 Proben lieferten alle der 493 normalen Proben (Spezifität 99,2%) ein
negatives Ergebnis beim NOVA Lite TM IgG F-Actin.
4

Vergleich zwischen dem NOVA Lite TM IgG F-Actin IFA und QUANTA Lite TM
F-Actin IgG ELISA
Zur Bestimmung der prozentualen positiven und negativen Übereinstimmung der Tests wurden
992 Proben mit Antikörpern gegen verschiedenste Antigene mit dem NOVA Lite TM IgG F-Actin
IFA und dem QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA getestet. Diese Proben umfassten 493 normale
Blutspender, 60 Patienten mit klinisch definierten Erkrankungen (rheumatoide Arthritis, SLE und
Sklerodermie), 40 Proben mit definierten Antikörpern (Infektionserkrankungen und
Autoantikörper) sowie 399 Proben von Patienten mit Verdacht auf Lebererkrankung.
Az=992
QUANTA Lite TM Actin IgG
ELISA
Positiv
QUANTA Lite TM Actin IgG
ELISA
Negativ
Gesamt
NOVA Lite IgG F-Actin
Positiv 269 21** 290
NOVA Lite IgG F-Actin
Negativ 69* 633 702
Gesamt 338 654 992
Positive Übereinstimmung in % 269/338 (80%)
Negative Übereinstimmung in % 633/654 (97%)
Gesamtübereinstimmung in % 902/992 (91%)
*39 der 69 sind schwach-positive ELISA
** 14 der 21 waren 1+ IFA (niedrige Reaktivität)
Referenzen
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8. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National
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5

Hersteller:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Technical Service (Domestic) : 877-829-4745
Technical Service (International) : 00+ 1 858-805-7950
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628250DEU February 2010
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