Diagnostik des variablen Immundefektsyndroms (CVID) - Karger

SackU, Tárnok A, RotheG(Hrsg):Zellulä reDiagnostik.Grundlagen,Methodenundklinische
AnwendungenderDurchflusszytometrie.Basel,Karger,2007,pp 721–740
..............................
Diagnostikdesvariablen
Immundefektsyndroms (CVID)
Klaus Warnatz,MichaelSchlesier
AbteilungRheumatologieundKlinischeImmunologie, MedizinischeKlinik,
Universitä tsklinikum Freiburg, Freiburgi. Br.,Deutschland
Einleitung
Das CVID (commonvariable immunodeficiency) ist die hä ufigste klinisch
relevante Immundefekterkrankung. In den westlichen Ländern liegt die Inzidenz
zwischen 1:20 000 und 1:200 000 [1]. Bei dieser Erkrankung handelt es
sich umein Antikö rpermangelsyndrom mit einer Erniedrigung von mindestens
zwei der Antikö rperklassen IgG, IgM und IgA um mindestens zwei Standardabweichungen
unter den altersentsprechenden Mittelwert ( www.esid.org ). Nach
den Diagnosekriterien der European Society of Immunodeficiency (ESID) beginnt
die Immundefizienz nach dem 2.Lebensjahr, und Impfantworten fehlen
meist. Da es sich bei dem CVID um eine Ausschlussdiagnose handelt, müssen
bekannte genetische, infektiöse und toxische Ursachen ausgeschlossen werden
(Tab. 1).
Ungefähr 20%derFälle[2,3]zeigeneinefamiliä reHä ufungundlasseneine
genetischeUrsachevermuten. EinegenetischeVerbindungbesteht zu derhä ufigeren,abermeist
klinischinapparentenselektivenIgA-Defizienz [4].Klinischfallen
die Patienten hä ufig erst als Jugendliche oder junge Erwachsene vor allem durch
rezidivierende respiratorischeInfektederoberenundunterenAtemwegeauf.Diese
fü hren unbehandelt zu einem irreversiblen Umbau der Bronchien und schließlich
zu einer schweren Lungenerkrankung. Im Gegensatz zu Patienten mit schweren
kombiniertenImmundefektenkommt esbeiCVID-Patientenvor allemzuInfektionenmit
bekapseltenBakterien. AtypischeInfektesindselten. Zusä tzlichleidenvie-

Tab.1. Differentialdiagnose des Antikö rpermangels (Quelle: www.esid.org )
Pathogenese Beispiele
Medikamenteninduziert Antimalariamittel
Captopril
Carbamazepin
Glucokortikoide
Fenclofenac
Goldsalze
Penicillamin
Phenytoin
Sulfasalazin
Methotrexat
Genetische Erkrankungen Ataxia telangiectasia
autosomale Formen des SCID
Hyper-IgM-Syndrom
Transcobalamin-II-Defizienz und Hypogammaglobulinä mie
X-chromosomale Agammaglobulinä mie
X-chromosomales lymphoproliferatives Syndrom (EBV-assoziiert)
X-chromosomales SCID
metabolische Störungen
Chromosomenanomalien
Chromosom-18q-Syndrom
Monosomie 22
Trisomie 8
Trisomie 21
Infektionskrankheiten HIV
kongenitale Rö telninfektion
kongenitale CMV-Infektion
kongenitale Infektion mit Toxoplasma gondii
EBV-Infektion
Hämatologische Tumoren Chronisch-lymphatische Leukä mie
Immundefizienz mit Thymom
Non-Hodgkin-Lymphome
B-Zell-Lymphome
Systemerkrankungen Immundefizienz durch Hyperkatabolismus von Immunglobulinen
Darmerkrankungen Lymphangiektasie
Schwere Diarrhö mit Proteinverlust
Malabsorption
Nierenerkrankung Nephrose
Schwere Verbrennungen Proteinverlust
Indikationen
722 Warnatz/Schlesier

Indikationen
le der Patienten imVerlauf der Erkrankung unter gastrointestinalen Infekten. Die
weitere Klinik umfasst Autoimmunphä nomene, Lymphoproliferation (Splenomegalie,
Lymphadenopathie), Lymphome und granulomatöse Entzündungsreaktionen[5].
Die Pathogenese diesesSyndroms ist weitgehend unklar und sicherlich heterogen.
In der Vergangenheit wurden sowohl Störungen der T-Zell- als auch
der B-Zell-Differenzierung und -Funktion beschrieben [6 – 8]. Die Diagnostik
umfasst neben der gründlichen Anamnese und Untersuchung des Patienten die
serologische Bestimmung der Antikö rpertiter, den serologischen Ausschluss
von Paraproteinen und auslösenden Infektionen, die Knochenmarkpunktion sowie
bildgebende Verfahren zur Erfassung von Organschä den. Die Durchflusszytometrie
ergänzt diese Diagnostik durch die Bestimmung der Lymphozytenpopulationen
imperipheren Blut und durch die Untersuchung auf bekannte
genetische Defekte. Die Bestimmung der Lymphozytenpopulationen dient dabei
dem Ausschluss schwerer Störungen des Immunsystems, großer monoklonaler
Populationen und der Identifizierung früher Störungen der B-Zell-Differenzierung
mit sehr niedrigen B-Zell-Zahlen im peripheren Blut, wie zum
Beispiel der X-chromosomalen Agammaglobulinä mie (Morbus Bruton) bei
Defekt der Bruton-Tyrosinkinase (BTK) [9].Durch Zusatzuntersuchungenwerden
die Hyper-IgM-Syndrome bei Defekten von CD40-Ligand (CD40L) und
CD40 [10] ausgeschlossen. Im Jahr 2003 wurde mit dem Nachweis einer homozygoten
ICOS-Defizienz (ICOS ¼ induzierbarer Kostimulator) bei zwei Familien
mit je zwei Patienten die erste monogenetische Ursache eines variablen
Immundefekts gefunden [11]. ICOS ist ein kostimulatorisches Molekül der
CD28-Familie, das nach Aktivierung auf T-Zellen exprimiert wird [12]. Dieser
Defekt lä sst sich imFACS nach Aktivierung von T-Zellen nachweisen. Die anderen
Unterformen des Hyper-IgM-Syndroms bei AID-, UNG- und NEMO-
Defizienz [10]dagegen kö nnenals Differentialdiagnosendurchdurchflusszytometrische
Untersuchungen bisher genauso wenig ausgeschlossen werden wie
die Unterformen des X-chromosomalen lymphoproliferativen Syndroms (XLP)
[13] bei SAP-Defizienz.
In letzter Zeit gewinnt die Durchflusszytometrie zunehmend anBedeutung
in der Klassifikation des CVID. Innerhalb der letzten 2Jahre wurden zwei Klassifikationsschemata
auf der Basis der Analyse der verschiedenen B-Zell-Subpopulationenvorgeschlagen
[14, 15]. Frühere Schemata, die auch T-Zell-Populationen
berücksichtigten [16], wie auch die funktionelle Klassifikation nach
Bryant etal. [17] konnten sich inder Klinik nicht durchsetzen. Zur Zeit wird in
einer europä ischen Multicenter-Studie die Konsistenz und klinische Relevanz
der beiden Klassifikationen getestet (Koordinator K. Warnatz), um sie anschließend
zusammenzufü hren. Leider stand das Ergebnis zum Zeitpunkt des Redaktionsschlussesnochaus.
Diagnostik desvariablenImmundefektsyndroms (CVID) 723

Protokoll
Prinzip
Vierfarbdurchflusszytometrie: Die beschriebenen Färbungensind reine Oberflä
chenfärbungen. Alle Protokolle sind auf Analysen am FACSCalibur (BD Biosciences,
Heidelberg, Deutschland) mit 488-nm-Laser und 635-nm-Dioden-Laser
sowie mit CellQuest-Software (BD Biosciences) ausgelegt. Entsprechende Adaptationen
an andere Zytometer mü ssen gegebenenfalls vorgenommen werden. Die
Grundlagen der Bedienung, Gerä teeinstellungen, Kompensierungen, zweidimensionalen
Punktwolken-Analysen (Dot-Plot) und das Setzenvon Auswertefenstern
(Regions,Gates) werdenals bekanntvorausgesetzt.
Fü rdie Fä rbungen werden periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral
blood mononuclear cells; PBMNCs) verwendet, die durch Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation
aus EDTA-Blutgewonnenwerden. VollblutfärbungenderB-ZellenmitgewaschenemBlutwerdeninderLiteraturbeschrieben[18],sindaberwegen
der Verwendung von Anti-Immunglobulin-Antikö rpern problematisch, da
Reste von Serumimmunglobulin die Fä rbungen stören. Einzelne Fä rbungen sind
nurnachentsprechenderIn-vitro-Aktivierungmöglich.
KleinerLymphozytenstatus
Indikationen
In einer Vollblutfärbung werden die jeweiligen Anteile der CD4-,
CD8-T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen bestimmt (Tab.3). Durch gleichzeitige
Bestimmung des Differentialblutbilds werden zusä tzlich die Absolutwerte ermittelt.
Ausschlussvon Differentialdiagnosen
Grundsä tzlich ist zu bemerken, dass durch die beschriebenen FACS-Untersuchungennur
quantitativeDefekte, aberkeinefunktionellensowieminimalstrukturellen
Verä nderungenerfasst werden. WeiterefunktionelleUntersuchungensind
bei entsprechender Indikation in Speziallabors mö glich. Zum Ausschluss des Hyper-IgM-Syndroms
bei CD40-Defekt (ehemalig Typ 3) wird CD40 auf B-Zellen
gefärbt. Sowohl CD40L- als auch ICOS-Defekte lassen sich nur auf aktivierten
T-Zellennachweisen. WährenddieICOS-Induktion nachStimulation in PBMNCs
untersucht werdenkann,empfiehltessichzum Nachweis derOberflä chenexpression
vonCD40L, CD4 þ TZellenvorheraufzureinigen.
Klassifikation desCVID
ImJahr 2002 beschriebenwir dieersteKlassifikation desCVID aufderBasis
durchflusszytometrischer Untersuchungen (Freiburg-Klassifikation [14]). Seitdem
724 Warnatz/Schlesier

Indikationen
wurde insbesondere durch die Gruppevon Prof. Ochsenhendler (Paris-Klassifikation,
[15]) eine weitere Klassifikation vorgeschlagen, die sich mit der ersten in
wesentlichenBefundenüberschneidet.
Freiburg-Klassifikation
Die B-Zell-Populationen werden anhand von 2Färbungen evaluiert (Tab.4).
DurchdieersteFä rbungB1werdendieZahlendernaiven(CD19þ CD27 IgM þ
IgD þ ), der IgM-Gedächtnis- (CD19þ CD27þ IgM þ IgD þ )und der klassengewechselten
Gedächtnis-B-Zellen (CD19þ CD27þ IgM IgD )erfasst. Die in
unsererErfahrungmeistnur sehr geringe Zahl an«IgMonly»-Gedä chtnis-B-Zellen
wird hierbei vernachlä ssigt, kann aber ohne Problem aus der Messung abgelesen
werden.
In einer zweiten Färbung B2wird der Anteil an transitionalen (CD19þ
CD21 int CD38 þþ IgM þþ) B-Zellen, Plasmablasten (CD19 low CD21 low
CD38 þþþ IgM – )und einer aktivierten CD21 low -Population (CD19 high CD21 low
CD38 low IgM þ )bestimmt.DieHerkunftderCD21 low -Population istunklar,in der
erstenStudiewurde abereineAssoziation dieserZellenmit Autoimmunphä nomenenundSplenomegalienachgewiesen.
Aus diesenbeidenFärbungenergibt sicheine EinteilungderPatienten,diein
demFlussschemavonAbbildung1dargestelltist.
Abb.1. Flussschema der Freiburg-Klassifikation von Patienten mit CVID. Die Klassifikation
beruht auf der Messung der verschiedenen B-Zell-Subpopulationen. Der Typ 1zeichnet sich
durcheineErniedrigungderklassengewechseltenB-Zellenaufunter0,4%derLymphozytenaus,
wä hrend Patienten des Typs2eine nahezu normale Anzahl haben. Der Typ 1kann anhand der
Expansion einer CD21 low B-Zell-Population auf ü ber 20% der B-Zellen ineinen Typ 1a und
einenTyp 1b( < 20%) unterschiedenwerden[14].
Diagnostik desvariablenImmundefektsyndroms (CVID) 725

Paris-Klassifikation
Die Einteilung der CVID-Patienten nach dem Pariser Schema [15] beruht
auf einer Färbung, die der Färbung B1der Freiburger Klassifikation entspricht.
Hierbei werden die Gruppen MB2 mit normalen Gedächtnis-B-Zellen, MB1 mit
erniedrigten klassengewechselten und normalen IgM-Gedächtnis-B-Zellen und
MB0 mit einer Reduktion beiderGedächtnis-B-Zell-Populationen unterschieden.
Als erniedrigt gelten Werte die 2Standardabweichungenunterhalb derNorm liegen.
In der untersuchten Kohorte lagen die Werte bei < 11% CD27þ B-Zellen
fü rdie Gruppe MB0 und < 8%klassengewechselte B-Zellen fü rdie Gruppe
MB1.
Material
Probenmaterial
8ml EDTA-antikoaguliertes Blut (nicht ä lter als 24h), bei Bestimmung von
ICOS undCD40LnachAktivierungzusä tzlich8ml.
Reagenzien
– Ficoll-Trennlö sung(1,077g/ml; Biochrom,Berlin,Deutschland)
– RPMI 1640(Biochrom)
– FCS(PANBiotech,Aidenbach,Deutschland)
– FACSFlow 1 (BD Biosciences)
– OptilyseB(Beckman-Coulter,Krefeld, Deutschland)
– IntraPrep(Beckman-Coulter)
– EntionisiertesWasser.
Gerä te
– FACSCalibur mit488-nm-Laserund635-nm-Dioden-Laser
– Standardpipetten
– Zentrifuge
– Zählkammer
– Vortex
– 50-ml-Falcon-Polypropylen-Rö hrchenmit Deckel(BD Biosciences)
– 15-ml-Falcon-Polypropylen-Rö hrchenmit Deckel(BD Biosciences)
– 12 75-mm-Falcon-Polystyrolrö hrchen(BD Biosciences)
– 0,5-ml-Probenrö hrchen mit Deckel (Biozym, Hessisch Oldendorf,
Deutschland).
Antikö rper
DieverwendetenAntikö rpersindin Tabelle2aufgelistet.
Indikationen
726 Warnatz/Schlesier

Indikationen
Tab.2. Liste der verwendeten Antikörper a
Antikörper Klon Fluorochrom Bestellnummer Lieferant
CD3 SK7 APC 345767 BD
CD4 13B8,2 FITC IM0448 BC
CD8 B9,11 PE IM0452 BC
CD16 3G8 PE IM1238 BC
CD19 J4,119 FITC IM1284 BC
CD19 J4,119 PC7 IM3628 BC
CD21 B-ly4 PE 555422 BD
CD27 M-T271 FITC F7178 Dako
CD38 HIT2 FITC 555459 BD
CD40 5C3 FITC 555588 BD
CD40-L TRAP1 PE 555700 BD
CD45 2D1 PerCP 345809 BD
CD56 NKH-1 PE IM2073 BC
CD69 FN50 FITC 555530 BD
Anti ICOS ISA-3 PE 12–9948–71 e-bioscience
Anti-IgM Ziege F(ab) 2 Cy5 109–176–129 JIR
Anti-IgD Ziege F(ab) 2 PE 2032–09 SB
Anti-kappa G20–193 FITC 555791 BD
Anti-lambda JDC-12 PE 555797 BD
Isotypkontrolle Maus-IgG1 PE IM0670 BC
BD ¼ BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland); BC ¼ Beckman-Coulter (Krefeld, Deutschland);
Dako ¼ DakoCytomation (Hamburg, Deutschland); SB ¼ SouthernBiotech (Biozol,
Eching, Deutschland); JIR ¼ Jackson ImmunoResearch Laboratories (Dianova, Hamburg,
Deutschland), e-bioscience ¼ Biocarta (Hamburg, Deutschland).
a Die hier angegebenen Antikörper werden von den Autoren benutzt. Andere Produkte sind
sicherlich alternativ verwendbar, müssen allerdings vorher selbst getestet werden.
Arbeitsschritte
Vollblutfärbung«KleinerLymphozytenstatus»
DieProtokollezurVollblutfärbungsindunter«CharakterisierungderB-Lymphozyten»
(sieheS.294)beschrieben. DieAntikö rper-Panels sindin Tabelle3dargestellt.
FärbungvonPBMNCs(Klassifikation,CD40-Expression)
Die Fä rbungen zum Ausschluss eines CD40-Defekts, monoklonaler Populationen
und zur Klassifikation finden an PBMNCs nach Aufreinigung ü ber Ficoll-
Dichtegradientenstatt.DietechnischeDurchfü hrungderFärbungenvon PBMNCs,
diemittels Ficollisoliert wurden,wurde bereitsin«CharakterisierungderB-Lymphozyten»;«Arbeitschritte»(sieheS.298)beschriebenDieAntikö
rpermischungen
derFreiburg-Klassifikation sindin Tabelle4zusammengefasst.
Diagnostik desvariablenImmundefektsyndroms (CVID) 727

Tab.3. Antikörpermischungen fü rkleines Lymphozyten-Panel a
FITC 100 m l PE 100 m l PerCP 50 m l APC 25 m l
K1 CD8 CD4 CD45 CD3
K2 CD19 CD56/16 b CD45 CD3
a Je 15 m lder Antikörpermischung fü rdie Fä rbung von 50 m lVollblut.
b Je 1:2,5 vorverdü nnt.
Tab.4. Antikörpermischungen fü rFreiburg-Klassifikation a
FITC 100 m l PE 100 m l PC7 25 m l FL4 25 m l
B1 CD27 (1 :5) Anti-IgD (1 :40) CD19 Anti-IgM-Cy5 (1 :40)
B2 CD38 CD21 CD19 Anti-IgM-Cy5 (1 :40)
B3 Anti-Kappa (1 :2) Anti-Lambda (1 :2) CD19 Anti-IgM-Cy5 (1 :40)
B4 CD40 ?? CD19 Anti-IgM-Cy5 (1 :40) b
a Je 10 m lder Antikörpermischung fü rdie Fä rbung von 5 10 5 PBNC ¼ 50 m lZellsuspen-
sion.
b Nur bei Verdacht auf Hyper IgM.
Tab.5. Antikörper-Panel zur Bestimmung von Aktivierung von T-Zellen a
FITC PE PerCP APC
A1 CD69 Isotyp G1 CD3 CD4
A2 CD69 ICOS CD3 CD4
A3 CD69 CD40L (CD154) CD3 CD4
a Eswerden je5m lder jeweiligen Antikörper auf 0,5–1,0 10 6 Zellen gegeben.
Indikationen
BestimmungvonCD40L-undICOS-ExpressionaufaktiviertenTZellen/
AktivierungvonT-Zellen
Zur Bestimmung der ICOS-Expression werden 1 10 6 Ficoll-isolierte
PBMNCs in24-Loch-Platten inRPMI 1640/10%FCS aufgenommen und fü r
16– 20 hbei 37 C/5%CO2 mit bzw. ohne 1 m g/ml PHA inkubiert. Die Zellen
werden anschließend in ein FACS-Rö hrchen überfü hrt, einmal inFACS-Medium
gewaschen (5min, 300 g )und mit der Antikö rpermischung entsprechend des
Protokollsfü rPBMNCsgefärbt. Zum Nachweis derAktivierungwerdendieT-Zellenzusä
tzlichmit CD69 gefärbt(Tab.5, A1 þ A2).
728 Warnatz/Schlesier

Indikationen
DieMethodik zumAusschlusseinesDefektsdesCD40Lwirdin «Angeborene
Immundefekte»; «X-chromosomales Hyper-IgM-Syndrom (XHIM)» (siehe
S.711)beschrieben(Tab.5, A1 þ A3).
Messung
Voraussetzung fü rdie B-Zell-Messung ist eine gute Gerä teeinstellung fü rdie
PhotomultiplierunddieFluorochrom-Kompensationen. Fü rgut titrierteAntikö rper
istdieKompensation innerhalbdesPanels einheitlich. InderRegelsinddieGerä -
teeinstellungensehr stabil ü berdieZeit,so dass nicht jedeMessungmitEinzelfärbungen
vorbereitet werden muss; die Gerä tekontrolle mit Beads inallen Farben
reicht aus.
Abb.2. Kleines Lymphozyten-Panel. a Die Lymphozytenregion (R1) wird im Fenster FL3
(CD45)/SSCgesetzt. DieverschiedenenLymphozytenpopulationenwerdendurchdieExpression
von CD3 (T-Zellen, unterteilt nach b CD4 þ und c CD8 þ ), d CD16þ CD56 þ CD3 – (NK-Zellen)
und e CD19þ (B-Zellen) charakterisiert.
Diagnostik desvariablenImmundefektsyndroms (CVID) 729

Messung«KleinerLympozytenstatus» (Abb.2)
Das Messdokument enthä lt ein zweidimensionales Aufnahmefenster mit den
Achsen FL3 (CD45) und Seitwä rtsstreulicht (side scatter; SSC). Eine AnalyseregionR1definiert
dieLymphozytenpopulation ü berdieExpression vonCD45 und
niedrigesStreulicht.Als weitereFensterwerdendieLymphozyteninFL1vs. FL4
undFL2vs. FL4dargestellt. 5000Lymphozytensolltenmindestens aufgenommen
werden.
MessungzurKlassifikation vonCVID (Abb.3)
Das Messdokument enthä lt ein zweidimensionales Akquisitionsfenster mit
den Achsen Vorwä rts- (forward scatter; FSC) und SSC. Eine Analyseregion R1
definiert dieLymphozytenpopulation ü berdasStreulicht.Ein weiteresFenstermit
den Achsen FL3 und FL4 enthä lt eine Region R2, die alle CD19þ B-Zellen einschließt.
Alternativ kann hier auch eine Histogrammdarstellung gewä hlt werden.
DieRegionenR1undR2werdenzum Aufnahme-«Gate»«B-Zellen» zusammengefasst.
Ein drittes Fenster stellt FL1 gegen FL2 dar und wird auf die Darstellung
der B-Zellen begrenzt (Gating). Die zu speichernden Ereignisse werden auf 5000
im «Gate» «B-Zellen» und zusä tzlich auf eine Zeitbegrenzung von 5min (fü r
500 m lProbenvolumen) gesetzt. Esempfiehltsich,alleZellenoderwenigstens alle
Lymphozyten zuspeichern, um spä ter die Spezifitä tunerwarteter Ergebnisse an
anderenZellenüberprüfenzukö nnen.
MessungzurBestimmungvonICOS-undCD40L-Expressionaufaktivierten
TZellen(Abb.4)
Die Zellen werden zunä chst ineinem zweidimensionalem Aufnahmefenster,
das bewusst größere Zellen einschließt, ü ber FSC und SSC und ein zusä tzliches
«Gate» auf CD4þ Zellen definiert (cave nach Stimulation ü ber CD3 ist CD3 nur
noch schwach auf der Oberflä che nachweisbar). Zum Nachweis der Aktivierung
werden ineinem zweiten Fenster die CD4þ Zellen (Gate1) entsprechend ihrer
Expression von CD69 (X-Achse) und CD40L bzw. ICOS (Y-Achse) dargestellt.
Mindestens 5000CD4 þ Zellensolltenaufgenommenwerden.
Datenanalyse
Indikationen
PeriphereLymphozytenpopulationen
Fü rdie Auswertung des kleinen Lymphozytenstatus wird entsprechend der
Abbildung2amitdenAchsenFL3(CD45)undSSC dasLymphozytenfenster(R1)
gesetzt. DerAnteil anCD4-undCD8-T-Zellen(UR,Abb.2bbzw.2c),NK-Zellen
(UL, Abb.2d) und B-Zellen (UL, Abb.2e) wird durch die jeweiligen Quadranten
ermittelt.DieAbsolutwertewerdendurchMultiplikation derGesamtlymphozyten-
730 Warnatz/Schlesier

Indikationen
"/ @H8A8E8

Abb.3b.
"/ @H8A8E8

Indikationen
Abb.3c.
"1 BJ :C:G:>

Abb.4. Nachweis einer monoklonalenPopulation. Inder Darstellungder B-Zellen (R1) im
FensterIgM/CD27 fälltbereitseinedeutlicheExpansionderCD27þ IgM þ Gedächtnis-B-Zellen
(UR, Quadrant 79%) auf. Im zweiten Fenster legt die massive Expansion der kappa-positiven
B-Zellen (kappa:lambda 15:1) eine monoklonale Population nahe. Weitere Untersuchungen ergabenbeidiesemPatientenein
Mantelzelllymphom.
Tab.6. Normalwerte fü rB-Zell-Subpopulationen imperipheren Blut a
B-Zell-Population Kurzbezeichnung Referenzbereich,%
CD19þ in CD45þ Lymphozyten B-Zellen 4,7 – 15,0
IgDþ CD27– in CD19þ B-Zellen naive und transitionale
B-Zellen
7,7 – 36,0
IgDþ CD27þ in CD19þ B-Zellen IgM-Gedächtnis-B-Zellen 7,8–36,0
IgD– CD27þ in CD19þ B-Zellen klassengewechselte
Gedächtnis-B-Zellen und
Plasmablasten
6,5–33,0
Kappa/lambda Leichtkettenverhä ltnis 1,1 – 2,0
CD21– CD38 – in CD19þ B-Zellen CD21– Subpopulation 1,1 – 6,9
M þþ D þþ CD38 þþ
in CD19þ B-Zellen
Transitional-B-Zellen 0,5–3,5
M – CD38 þþ (CD27þþ)
in CD19þ B-Zellen
Plasmablasten 0,5–4,1
a Die Referenzbereiche reprä sentieren die 5. – 95. Perzentile der B-Zell-Subpopulationen ge-
sunder Erwachsener (n ¼ 28).
Indikationen
(z.B. Immunglobulin neg )B-Zell-Populationen oder sogar monoklonale Populationen
(deutlich verschobenes Kappa-lambda-Verhä ltnis) (siehe auch «Durchflusszytometrie
in der Non-Hodgkin-Lymphom-Diagnostik», S.1001). Eine weitere
hä matologisch-onkologischeAbklä rungistdringendnotwendig.
734 Warnatz/Schlesier

Indikationen
Freiburg-Klassifikation (Abb.3)
DurchFärbungB1(Abb.3a – c, Panel1)werdenüberdiedifferentielleExpression
von IgM, IgD und CD27 naive (UL, CD27– IgD þ IgM þ ), IgM– (UR,
CD27þ IgD þ IgM þ )und klassengewechselte (LR, CD27þ IgD – IgM – )Gedächtnis-B-Zellen
unterschieden [19]. Die zweite Fä rbung B2(Abb.3a – c, Panel2)enthä
lt die Marker CD21 und CD38 zur Analyse weiterer B-Zell-Differenzierungsstufen.
So ist CD38 auf allen B-Zell-Vorlä ufern stark exprimiert (siehe
auch «Charakterisierung der B-Lymphozyten», S.294). Naive B-Zellen zeigen
eine intermediä re CD38-Oberflä chenexpression, wä hrend Gedä chtnis-B-Zellen
CD38 – sind. Ûber die niedrige Expression von CD21 und CD38 (R3) wird die
CD21 low B-Zell-Population abgegrenzt,diein dasSchemaderFreiburg-Klassifikation
eingeht.
Außerdemdefinierendiehohe IgM- undCD38-Expression dietransitionalen
B-Zellen(R4)[20]unddiefehlende oderniedrige IgM-unddiehöchsteCD38-ExpressiondiePlasmablasten(R5)[21].DiesePopulation
exprimiert CD27 höherals
Gedächtniszellen (Abb.3c, Panel 1)und muss daher bei der Bestimmung der
CD27þ klassengewechselten Gedächtniszellen von den CD27þ IgM Zellen
(LR)abgezogenwerden.
Befund
Die Auswertung und Normwerte fü rdie B-Zell-Subpopulationen sind in Tabelle6angegeben.
Dabei ist es sinnvoll, den Anteil der Gesamt-B-Zellen als Prozent
der Lymphozyten und die Subpopulationen inProzent der B-Zellen anzugeben.
Aus diesenAngabenkö nnengegebenenfallsauchaufLymphozytenbezogene
oderabsoluteWerteberechnetwerden.
Fü rdie Freiburg-Klassifikation wird zunä chst der Anteil an klassengewechselten
Gedächtnis-B-Zellen an den Gesamtlymphozyten bestimmt (Abb.3,Panel1).
Bei einem Anteil unter 0,4%handelt es sich umeinen Typ-1-Patienten
(zirka 75%der Patienten), bei mehr als 0,4%umeinen Typ-2-Patienten (zirka
25%der Patienten). Die Patienten vom Typ 1werden entsprechend dem Anteil
anCD21 low B-Zellenunterteilt ineinenTyp 1a mitdeutlicherExpansion(> 20%)
und einen Typ 1b mit nur geringer oder fehlender Expansion dieser Zellen
(Abb.3,Panel2). Interessanter Weise treten bei Patienten mit > 20%CD21 low
B-Zellen (Typ 1a) vermehrt Autoimmunphä nomene und eine Splenomegalie auf
[14]. Die Auswertung dieser FACS-Panels wird gerade anhand der europä ischen
Studie ü berprüft. Das Ergebnis stand zum Zeitpunkt des Redaktionsschlusses
noch aus. Genauere Informationen sind ü ber Dr. K. Warnatz (Klaus.Warnatz@
uniklinik-freiburg.de)
Diagnostik desvariablenImmundefektsyndroms (CVID) 735

DifferentialdiagnoseCVID
Indikationen
AusschlussmonoklonalerB-Zell-Populationen
Die Fä rbung B3 erlaubt Hinweise auf monoklonale B-Zell-Populationen
(Abb.4). Dazu wird nach Selektion von Lymphozyten und B-Zellen die Kappagegen
dieLambda-Leichtkettenexpression dargestellt. DiesesVerhä ltnissolltezirka50:50betragen.
DeutlicheAbweichungenundein nachweisbarerAnteil Leichtketten-negativer
B-Zellen sind nach Ausschluss von Plasmablasten (Färbung B2,
R5)verdächtige Hinweisefü ratypischeB-Zell-Populationen. AbnormePopulationentretenbeiCVID-PatientengelegentlichaufundsollteninZusammenarbeit
mit
denHämatologengenauerabgeklä rt werden.
AusschlusseinesHyper-IgM-Syndroms beiCD40-Defekt
HierzuwirddieExpressionvon CD40nach«Gating»aufB-Zellenuntersucht,
vondenennahezu 100% positivsein sollten. DieseUntersuchungerlaubt,wiebereits
erwä hnt, lediglich schwere strukturelle Defekte dieses Moleküls nachzuweisen.
DasHyper-IgM-SyndromaufgrundeinesDefektsdesCD40-Rezeptorsist extrem
selten (< 1% der Patienten mit Hyper-IgM-Syndrom) und wurde bisher nur
beiManifestation im frühenKindesalterbeschrieben. DieUntersuchungisteinfach
und ohne großen Aufwand durchzufü hren. Bei keinem der von uns untersuchten
CVID-Patientenkonntenwir mitHilfe dieserUntersuchungbishereineAbnormalitä
tnachweisen. BeipositivemErgebnissindweiterfü hrende genetischeundfunktionelleUntersuchungenzur
Diagnosesicherungnotwendig.
AusschlusseinesHyper-IgM-Syndroms beiCD40L-Defekt
Der Ausschluss von CD40L-Defekten ist aufwendig. Deshalb sollte dieses
Verfahrennur beibegründetemVerdacht angewendetwerden,d.h.beimä nnlichen
Patienten mit möglichst positiver Familienanamnese, bei denen der Serum-IgM-
Wert im oberenNormbereichliegtodererhö ht ist.
Dazu werden die aktivierten CD4 þ TZellen und nicht aktivierten Kontrollzellen
entsprechend Abbildung 5ausgewertet. Die aktivierten Zellen exprimieren
zunä chst hö here Mengen an CD69, bevor sie CD40L hochregulieren. Nicht aktivierte
T-Zellen sollten CD40L – sein. Als Kontrolle müssen parallel Zellen einer
gesundenKontrollestimuliert werden.
AusschlusseinesICOS-Defekts
Bei CVID-Patienten mit Hinweis auf eine autosomale Vererbung der Krankheit
sollte ein Defekt der ICOS-Expression untersucht werden. Auch diese Untersuchung
ist fü rdie Routine zu aufwendig. ICOS wird innerhalb weniger Stunden
aufaktiviertenT-Zellenexprimiert undistnach16him Gegensatz zu unstimulierten
Zellen gut nachzuweisen (Abb.5). Aufgrund der T-Zell-spezifischen Expres-
736 Warnatz/Schlesier

Indikationen
HD
Pat.
sion können andere Lymphozytenpopulationen als negative Kontrolle dienen. Als
positive Kontrolle muss auch hier eine gesunde Person mitgefü hrt werden. Die
Auswertung fü hren wir nach der Eingrenzung auf CD4þ T-Zellen analog zu der
Auswertung vonCD40L durch. DieEingrenzungauf CD4þ T-Zellen ist notwendig,
da die Expression des ICOS-Rezeptors auf CD4þ T-Zellen hö her als auf
CD8 þ T-Zellenist.
Kommentar
Isotyp
Anti-CD154 Anti-ICOS
CD69
Abb.5. Nachweis eines ICOS-Defekts. Nach Aktivierung von T-Zellen über 16hin vitro
können nach «Gating» auf CD4þ T-Zellen bei Gesunden (HD) sowohl CD40L als auch ICOS
deutlichaufderOberflä chenachgewiesenwerden. Als KontrollederAktivierungwirddieerhö hte
Expressionvon CD69 ausgenutzt. Im Vergleich zeigt der Patient (Pat.) zwar eine nahezu normale
CD40L-Expression, aberkeineICOS-Expression. Eshandelt sichhierbei um1der 9bisher
identifiziertenCVID-Patientenmit genetischem Defekt des ICOS [11]. Zusä tzlichsoll immer ein
unstimulierterKontrollansatz mitgefü hrtwerden(hiernicht dargestellt).
InunsererAbteilungwerdenroutinemä ßigdaskleineLymhozyten-Panelund
das B-Zell-Panel zur Klassifikation und zum Ausschluss atypischer Populationen
durchgefü hrt. Die Abgrenzung der unter «Differentialdiagnose CVID» (siehe
oben) aufgefü hrtenDifferentialdiagnosenbleibtbesonderenFällenvorbehalten. Im
Labor habensichdieB-Zell-FärbungenanFicoll-separiertenPBMNCsaus EDTAantikoaguliertem
Material sehr bewä hrt. Einige Labors fü hren B-Zell-Färbungen
Diagnostik desvariablenImmundefektsyndroms (CVID) 737

mitgewaschenemVollblutdurch. DiesesVorgehenstellteineAlternativedar,muss
abermit denentsprechendenKontrollenetabliert sein.Seit Redaktionsschlusssind
neuegenetischeDefektebeiCVID-Patientenidentifiziert worden(TACI,BAFF-R,
CD19),diehiernicht mehr berücksichtigtwerdenkonnten.
Qualitä tskontrolle
NebenderKontrollederspezifischenFärbungmitHilfe vonIsotypkontrollen
solltebeijederUntersuchungmöglichsteinegesunde Kontrollemitlaufen,um bei
stark abweichendenSubpopulationenFärbungsfehlerauszuschließen. DieStimulationsexperimente
sollten ebenfalls einerseits eine Mediumkontrolle (unstimuliert)
und eine gesunde Kontrollperson enthalten. Hochpathologische Befunde sollten
durcheineunabhä ngige zweiteMessungbestä tigtwerden.
Troubleshooting
InunseremBereichhaltenwir Auswertungenvon B-Zellenvon unter1%nur
beiausreichendemAusgangsmaterialfü rverwertbar. Derartige Auswertungensind
anderenfalls mit Vorsicht zu interpretieren. Unterschiedliche spezifische Antikö rper
und/oder Konjugate (z.B. CD38-PE vs. CD38-APC) fü hren zuunterschiedlichenErgebnissen,diebeiderAuswertungberücksichtigtwerdenmü
ssen. Hiersei
insbesondere auch auf die deutlich unterschiedliche Qualitä tder Anti-ICOS-Antikörperverwiesen.
DieProblemederIn-vitro-Stimulation vonT-Zellensindzahlreich.
ErwarteteErgebnisse
DieerwartetenErgebnissefü rdieB-Zell-Subpopulationensindin denjeweiligenAbschnittenundAbbildungenaufgefü
hrt.
BenötigteZeit
Indikationen
Die Prä paration der PBMNCs dauert etwa 1,5 h. Ebenso viel Zeit ist fü rdie
Oberflä chenfärbung einzuplanen. Die T-Zell-Stimulation zum Nachweis von
CD40L benötigt 0,5 ham ersten Tagzur Vorbereitung der Platten, 2ham 2.Tag
zurReinigungundInkubation derPBMNCs,dienach16 – 20 hÛber-Nacht-Kultur
738 Warnatz/Schlesier

Indikationen
weiterverarbeitetwerdenkö nnen. Fü rdieDatenaufnahmevon2000 – 5000deruntersuchtenZellenbenötigtmanpro
Färbungbis zu 5min.
Zusammenfassung
Das CVID ist ein heterogenes Antikö rpermangelsyndrom, das sich klinisch
entweder inder Kindheit (nach dem 2.Lebensjahr) oder inder 2. – 3. LebensdekadedurchrezidivierenderespiratorischeundgastrointestinaleInfektemanifestiert.Da
essichbeim CVID um eineAusschlussdiagnosehandelt,müssenbekannte
genetische, infektiöse und toxische Ursachen ausgeschlossen werden. Die
Diagnosekriterien sind durch die ESID ( www.esid.org )festgelegt. Die Durchflusszytometrie
dient neben der Abgrenzung von X-chromosomalen und autosomal
rezessiven Hyper-IgM-Syndromen (ehemalig Typ 1und 3) undder Agammaglobulinä
mie (B-Zell-Zahl < 1%) inletzter Zeit zunehmend auch der Klassifikation diesesheterogenenSyndroms.DazuwerdenPatientenentsprechenddesAnteilsverschiedener
B-Zell-Populationen imperipheren Blut eingeteilt. Aktuell wird im
Rahmen einer europä ischen Studie versucht, die Vorschlä ge aus der Freiburger
und der Pariser Klassifikation zu einer einheitlichen Klassifikation zusammenzufü
hren. Weitere durchflusszytometrische Analysen sind aktuell der Forschung
vorbehalten.
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