UKJ-Forschungsbericht 2009/2010

Institut für Anatomie II
Institute of Anatomy II
Nach der Emeritierung von Prof. Dr. Karl-Jürgen Halbhuber zum
31.3.2009 wurde Prof. Dr. Gustav Jirikowski mit der kommissarischen
Leitung des Institutes beauftragt. Zum 1.11.2010 nahm Prof.
Dr. Andreas Gebert den Ruf auf diesen Lehrstuhl an.
Wissenschaftlicher Schwerpunkt in den Jahren 2009 und 2010
war die Erforschung der Wechselwirkung von Steroidhormonen
und Neuropeptiden im zentralen Nervensystem. Das methodische
Spektrum umfasst licht- und elektronenmikroskopische Histochemie,
in situ Hybridisierung, RT-PCR sowie Immunoassays.
Direktor: Prof. Dr. med. Andreas Gebert
Adresse: Teichgraben 7, 07743 Jena
Andreas.Gebert@med.uni-jena.de
www.anatomie2.uniklinikum-jena.de
After the retirement of Prof Halbhuber, 31.3.2009, Prof Jirikowski
was appointed temporary director of the institute. Prof Gebert
accepted chairmanship Nov. 1st 2010.
Scientific focus in 2009, 2010 was the interaction of steroid hormones
and neuropeptides in the central nervous system. Methods
include light and electron microscopical histochemistry, in situ
hybridization, RT PCR and immunoassays.
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Forschungsprojekte
Research projects
Lokalisation von Steroid-Bindungsproteinen in Nervenzellen
des Hypothalamus
(Prof. Dr. Gustav Jirikowski)
Der Hypothalamus ist ein Teil des Zwischenhirns, der unter anderem
die Hormone Vasopressin und Oxytocin produziert. Die Bildung
und Ausschüttung dieser Hormone, die den Blutdruck bzw.
die Reproduktion steuern ist von Steroidhormonen der Nebenniere
und der Keimdrüsen abhängig. Bisher wurde angenommen, dass
die Steroidwirkung ausschließlich über spezifische Rezeptoren im
Zellkern funktioniert. Unsere Befunde legen nahe, dass es noch
weitere Mechanismen geben muß, die Steroid-Bindungsglobuline
mit einem eigenen Rezeptorweg involvieren. Diese Bindungsproteine
werden auch in hypothalamischen Nervenzellen produziert.
Fluoreszenz-Markierung von Steroidhormonen
(PD Dr. Reimar Krieg, Prof. Dr. Gustav Jirikowski, Dr. Annett Eitner)
Aufnahme und Bindung von Steroidhormonen in vivo und in vitro
kann bisher nur schlecht untersucht werden. Im Zeitraum 04/2009
bis 12/2010 wurden deshalb 46 Steroid-Fluorochrom-Konjugate
mit potentieller Hormonaktivität und mit variierenden physikochemischen
Eigenschaften synthetisiert und patentiert. Sie werden
z.T. sehr effizient bei sehr geringer Zytotoxizität von lebenden Zellen
aufgenommen und sind Ausgangspunkt für Echtzeit-in-vivo-
Untersuchungen zur Aufklärung von Steroid-Protein-Wechselwirkungsmechanismen.
Synthese und Charakterisierung von Steroide-Derivaten
als neuartige oral wirksame Antimalaria-Wirkstoffe
(PD Dr. Reimar Krieg)
Gegenwärtig sind in 108 Ländern ca. 3 Milliarden Menschen von einer
Malaria-Infektion bedroht (1 Mio Tote jährlich allein in Afrika).
Die schnelle Entwicklung von Arzneimittel-Resistenzen durch den
Erreger Plasmodium falciparum macht die Suche nach prinzipiell
neuen Wirkstoffen zu einem zentralen Anliegen. Anknüpfend an
zurückliegende Arbeiten mit Steroiden konnten in Kooperation mit
der JLU Giessen Verbindungen mit starker Antimalaria-Aktivität im
Tiermodell gefunden, modifiziert und patentiert werden. Sie sind
Ausgangspunkt für vielversprechende Struktur-Eigenschaftsuntersuchungen
mit dem Ziel der Entwicklung eines Pharmakons.
Weitere Projekte
Elektronenmikroskopische Untersuchungen zu Veränderungen
der Niere nach Schwermetallvergiftung
(Dr. Hartmut Oehring)
Polarisationsmikroskopische Untersuchungen zur zellulären
Aufnahme von Nanopartikeln (Dr. A. Eitner)
Abb.1: Beispiel für Struktur-Eigenschafts-Betrachtungen an synthetisierten
iso-π-elektronischen Reaktiv-Farbstoffen: Von Peroxidasesubstraten
(linkes Beispiel) zu Kernfarbstoffen (rechts).
Fig.1: Example for structure-property-considerations on iso-πelectronic
reactive stains: left: PO-substrates, right: nucleic stains.
Neuartige Reaktiv-Fluorochrome zum histochemischen
Nachweis peroxidatischer Aktivität
(PD Dr. Reimar Krieg, Dr. Annett Eitner)
Peroxidase (PO) nimmt als Enzymmarker, insbesondere in amplifizierenden
Detektionssystemen, eine Spitzenstellung ein. Im Gegensatz
dazu und angesichts rasanter gerätetechnischer Fortschritte
und wachsender Anforderungen an moderne Detektionssysteme
(z.B. „IHC-multiplexing“) ist die Zahl an leistungsfähigen Substraten
sehr begrenzt und unzureichend (nur rot-braune bis schwarze
Chromogene, Fluoreszenz: nur „Tyramide“). Arbeiten zu inzwischen
patentierten neuartigen PO-Substraten zum Nachweis immungebundener
und endogener PO-Aktivität wurden fortgeführt. Struktur-Eigenschafts-Studien,
Synthese und histologisches Screening
führten auch zur Entwicklung neuartiger Fluoreszenzsonden für
andere Targets, z.B. zu Markern für Mastzellen, Keratin, Knorpel,
Nukleinsäuren und cytotoplamatischer RNA (Abb.1).
Einfluss der Beschichtung von Nanopartikeln auf deren
Internalisierung und Zelltoxizität (Dr. Annett Eitner)
Die Oberflächeneigenschaften von Nanopartikeln haben einen großen
Einfluss auf die Aufnahme und die Verträglichkeit der Partikel
in Zellen. Die Beschichtung der Nanopartikel bestimmt deren
Membranaffinität sowie deren zelluläre Toxizität unabhängig vom
eigentlichen Kernmaterial. Eine hohe Aufnahme von Nanopartikeln
ist erwünscht bei therapeutischen Anwendungen sowie bei
der Wärmebehandlung in der Tumortherapie. Aus diesem Grund
untersuchten wir 20 Eisenoxid-Nanopartikel mit unterschiedlichen
Beschichtungen hinsichtlich ihres Verhaltens zur Internalisierung
und Zytotoxizität mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie
und Rasterelektronenmikroskopie. Es zeigten sich hierbei große
Unterschiede in Abhängigkeit der Beschichtung (Abb.2).
Localization of steroid-binding proteins in hypothalamic
neurons
The hypothalamus, part of the diencephalon is source of the posterior
lobe peptides vasopressin and oxytocin. Synthesis and secretion
of these hormones, controlling blood pressure and reproduction
depends on serum levels of adrenal and gonadal steroids.
So far it has been assumed that steroid actions are exclusively mediated
through nuclear receptors and direct genomic effects. Our
findings suggest that additional mechanisms exist which involve
steroid binding globulins and specific membrane receptors. These
binding proteins are expressed in hypothalamic neurons.
Fluorescence labeling of steroid hormones
Uptake and binding of steroid hormones in vivo and in vitro has
been difficult to observe so far. Therefore, a series of 46 chimeric
steroid-fluorochrome conjugates with varying physico-chemical
properties was synthesized. Some of these compounds exhibit high
uptake rates by living cells and negligible cytotoxicity and provide
promising tools for real time in vivo investigation of steroid-protein
interactions.
Synthesis and characterization of steroid-derived compounds
as novel orally active antimalarials
Currently, there are around 3 billion people at risk of malaria infection
in 108 countries and there are up to 1 million deaths only
in Africa. Due to rapid development of resistance by the causative
parasite Plasmodium falciparum to established antimalarials, urgent
efforts are needed to identify effective, affordable, alternative
drugs. In connection with previous work on steroids and in collaboration
with the JLU Giessen, compounds with strong antimalarial
activity could be prepared. They now serve as lead compounds for
SAR and ongoing antimalarial drug discovery
Novel reactive fluorochromes for histochemical detection
of peroxidatic activity
Peroxidase (PO) plays a key role in many sophisticated detection systems.
However, the number of powerful PO substrates lags behind
technical advances and increasing demands on modern detection
systems (e.g. IHC-multiplexing). The small number of chromogenic
substrates currently available yields red-brown to brownish-black
reaction products only, while fluorescence applications are based
excusively on „tyramides“. Thus, novel substrates for histochemical
detection of immunobound and endogenous PO activity were developed
by our group and optimized by chemical tailoring. Also, in
continuation of this work, novel stains for histochemical detection
of mast cells, keratiin, cartilage, nucleic acids, and cytoplasmatic
RNA were obtained by structure-property-investigations, chemical
synthesis, and histochemical screening (Fig.1).
Abb.2: Internalisierung von Stärke-beschichteten magnetischen
Nanopartikeln in BT474-Zellen: 1) CLSM-Aufnahme, Darstellung
der Zellkerne (blau), Nanopartikel (grün) und Zellmembran (rot) 2)
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme: Detektion der Sekundärelektronen
bzw. der Rückstreuelektronen.
Fig.2: Internalization of magnetic nanoparticles in BT474-cells: 1)
CLSM-image, nuclei (blue), nanoparticles (green) and cell membrane
(red) 2) Scanning electron microscopy: Detection of secondary electrons
and back-scattered electrons (BSE).
Influence of nanoparticle coatings on internalization
and cytotoxicity
The chemical and surface properties of nanoparticles have major
impact on the internalization process and biocompatibility. The
coating material, and in particular the surface charge, often determines
membrane affinity as well as cytotoxicity of nanoparticles
independently of their core material. A high internalization of nanoparticles
is desirable for drug or gene delivery as well as for hyperthermia
cancer treatment. We investigated 20 different types of
magnetic nanoparticles with identical core materials but different
coatings. The intracellular uptake of these particles was observed
using confocal laser scanning microscopy and scanning electron
microscopy. The nanoparticles showed a heterogeneous behaviour
depending on their coating materials (Fig.2).
Further projects
Electron microsopical investigations on renal morphology
after heavy metal intoxication
Polarization microscopical observations of cellular uptake
of nanoparticles
Publications
• Jirikowski GF, et al. Distribution of vitamin D binding protein
(DBP) expressing neurons in the rat hypothalamus. Histochem.
Cell Biol., 2009, 131:365-370
• Pusch L, et al. Expression of corticosteroid binding globulin in human
astrocytoma cell line. Cell. Mol. Neurobiol., 2009, 29:583-588
• Sivukhina E, et al. Altered hypothalamic-pituitary adrenal axis
activity in patients with chronic heart failure. Horm. Metab. Res.,
2009, 41:1-7
• Sivukhina E, et al. Comparison of vasopressin and oxytocin
expressions in the hypothalamo-neurohypophysial system of
patients with chronic heart failure. Horm. Metab. Res. 2010,
42:56-60
• Krieg R, Halbhuber KJ. Detection of endogenous and immunobound
peroxidase - The status quo in histochemistry. (Review)
Progress in Histochem. Cytochem., 2010, 45/2:81-142
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