UKJ-Forschungsbericht 2009/2010

Arbeitsgruppe Biomolekulare Photonik
Biomolecular Photonics Group
Ein Ziel der Arbeitsgruppe für Biomolekulare Photonik ist es, neue
photonische Technologien zu entwickeln und biologischen Anwendungen
zuzuführen. Der Fokus liegt dabei auf quantitativen
multidimensionalen fluoreszenzmikroskopischen Techniken, die zur
Lösung verschiedener Fragestellungen (Protein-Protein-Interaktionen
in der postsynaptischen Membran von Neuronen, Schalten von
Ionenkanälen und DNA-Reparaturvorgängen) eingesetzt werden.
Die Arbeitsgruppe wurde 2010 in Lehrveranstaltungen im Bachelorstudiengang
Biochemie/Molekularbiologie und im Masterstudiengang
Molekulare Medizin eingebunden.
Leiter: Prof. Dr. Christoph Biskup
Adresse: Nonnenplan 4, 07743 Jena
christoph.biskup@mti.uni-jena.de
www.photonik.uniklinikum-jena.de
One of the aims of the Biomolecular Photonics Group is to establish
new photonic techniques and to use them in biologic research.
The focus is on the development and application of new quantitative
multidimensional fluorescence microscopy techniques, which
are used to detect protein-protein interactions in the postsynaptic
density of neurons, to elucidate DNA repair mechanisms and to
investigate the gating of receptor channels.
Since 2010 the group is offering seminars and courses for bachelor
students of Biochemistry/Molecular biology and master students
of Molecular Medicine.
Forschungsprojekte
Research projects
Quantitative multidimensionale Fluoreszenzmikroskopie
(Prof. Dr. Christoph Biskup, Dr. Birgit Hoffmann)
In der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie wird oft nur die
Information über die Intensität der von einem Fluorophor emittierten
Strahlung genutzt. Das Emissionslicht ist jedoch auch
durch seine spektralen Eigenschaften, seine Polarisationsrichtung
und die Fluoreszenzlebensdauer charakterisiert. Letztere wird
durch die physikalische und chemische Umgebung des Fluorophors
beeinflusst und kann damit Informationen über die molekulare
Umgebung des Fluorophors liefern. Die Arbeitsgruppe hat
mehrere Techniken zur spektralaufgelösten Fluoreszenzlebensdauermessung
etabliert, die auf Einzelphotonenzählung oder einem
Streak Camera System basieren. Anstatt der konventionellerweise
gemessenen Fluoreszenzabfallkurve erhält man so eine zeit- und
spektralaufgelöste Oberfläche (Abb.2), die eine weiterreichende
Analyse ermöglicht.
Entwicklung und Untersuchung von Nanosensoren
(Prof. Dr. Christoph Biskup), EU, TMBWK, BMBF 2006-2013
Fluoreszenzindikatorfarbstoffe, deren Fluoreszenz sich bei Bindung
von Ionen oder Biomolekülen ändert, können dazu benutzt
werden, die Konzentration dieser Analyte zu bestimmen. Oft wird
jedoch die gemessene Fluoreszenzintensität nicht nur durch den
Analyten, sondern auch durch andere Faktoren, wie Interaktion
mit zellulären Proteinen und Inhomogenitäten im Beleuchtungsstrahlengang
oder in der Indikatorverteilung verfälscht. Diese
Probleme lassen sich durch die Einbettung der Indikatoren zusammen
mit einem Referenzfarbstoff in Nanopartikel beheben. Die
Polymermatrix schützt den Indikatorfarbstoff vor der Interaktion
mit Proteinen, beeinträchtigt aber nicht die Analyterkennung. Das
Signal des Referenzfarbstoffes kann dazu benutzt werden, eine
Ungleichverteilung der Nanosensoren zu korrigieren.
In verschiedenen Verbundprojekten, an denen die Arbeitsgruppe
beteiligt ist, sollen neue Nanosensoren synthetisiert und deren
Biokompatibilität untersucht werden.
Optischer Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen
(Prof. Dr. Christoph Biskup, Dr. Birgit Hoffmann)
Fluoreszenzlebensdauermessungen können durch die Ausnutzung
des als Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) bezeichneten
physikalischen Phänomens auch zum Nachweis der molekularen
Nachbarschaft zwischen Proteinen eingesetzt werden. So kann die
Interaktion zwischen Proteinen in lebenden Zellen visualisiert und
verfolgt werden. Die Technik eignet sich auch dazu, die Interaktion
von Schlüsselproteinen in Signaltransduktionskaskaden zu erforschen
und in Hochdurchsatzverfahren Pharmaka zu untersuchen,
die diese Kaskaden stimulieren oder inhibieren.
Struktur-Funktions-Beziehungen von Ionenkanälen
(Prof. Dr. Christoph Biskup), DFG 2007-2011
Durch Kombination von optischen und elektrophysiologischen
Techniken lässt sich das Schalten (gating) eines Ionenkanals mit
anderen Ereignissen beispielsweise der Bindung von Liganden oder
Konformationsänderungen korrelieren. Durch Verwendung von
fluoreszenzmarkierten zyklischen Nukleotiden wurde in Zusammenarbeit
mit dem Institut für Physiologie II das Zusammenspiel
von Ligandenbindung und Aktivierung von CNG- und HCN-Kanälen
untersucht. Die Technik soll nun auf die Untersuchung von
Glutamatrezeptoren ausgedehnt werden.
Beteiligung von S100A11 an der Reparatur von DNA-
Doppelstrangbrüchen (PD Dr. Christian Melle), Wilhelm-Sander-Stiftung
2006-2013
S100-Proteine können durch Bindung an Interaktionspartner deren
Aktivität modulieren. Sie sind in verschiedene zelluläre Prozesse,
beispielsweise die Zellzyklus-Regulation, Zellwachstum und
Zellmotilität involviert. Wir konnten eine funktionelle Kolokalisierung
von S100A11 mit Proteinen detektieren, die an der homologen
Rekombinationsreparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen
(DSB) beteiligt sind (Abb.1). Hierbei hängt das Erkennen der Orte
mit DSB durch Rad54B von dessen Interaktion mit S100A11 ab.
Im Rahmen dieses Projekts wollen wir detailliert untersuchen, wie
S100A11 in den DNA-Reparaturprozess eingebunden ist.
Weitere Projekte
Regulation der p21-Proteinstabilität durch S100A11
(PD Dr. Christian Melle)
Herausragende Leistungen
Im Jahre 2010 richtete die Arbeitsgruppe einen internationalen
Mikroskopie/Nanosensor Workshop in Jena/Dornburg aus, der
durch die Europäische Union gefördert wurde.
Abb.1: S100A11 (grün)
und Rad51 (rot) kolokalisieren
mit geschädigter
DNA im Kern von
HaCaT-Keratinozyten.
Fig.1: Co-localisation
of S100A11 (green)
and Rad51 (red) in the
nucleus of HaCaT keratinocytes
containing
damaged DNA.
5 μm
Quantitative multidimensional fluorescence microscopy
In conventional fluorescence microscopy only the information
conferred by the fluorescence intensity is used. However, a fluorophore
is not only characterized by the intensity of the emitted
light, but also by its absorption and emission spectra, by its lifetime
in the excited state and the polarization of the emitted light.
The fluorescence lifetime does not only provide another dimension
of contrast, but can also be exploited for functional imaging. It is
sensitive to the physical and chemical environment of the fluorophore.
As such it is an excellent reporter of its surroundings.
The group has established several spectrally resolved fluorescence
lifetime imaging techniques based on time-correlated single photon
counting (TCSPC) and a streak camera system. Instead of a
single fluorescence decay curve, which is obtained by conventional
techniques, a fluorescence decay surface can be reconstructed
from the data obtained by these techniques (Fig.2).
Development of fluorescent nanosensors
Fluorescent ion indicators whose fluorescence changes upon the
binding of ions or biomolecules can be used to measure the concentration
of theses analytes. Often, however, it is difficult to relate
changes in the fluorescence intensity directly to the analyte
concentration since the overall magnitude of the signal is also dependent
on many other factors such as the local dye concentration
or the illumination intensity. One way to overcome these problems
is to incorporate the indicator dye together with a reference dye
in the polymer matrix of nanoparticles. In this way it is possible to
exploit the analyte recognition capabilities of the indicator and to
correct for changes in the indicator concentration by taking into
account the fluorescence signal of the reference dye. Moreover,
the polymer matrix is able to inhibit protein-dye interactions.
Optical protein-protein-interaction assays
Fluorescence lifetime measurements can be used to prove the
molecular vicinity of proteins by exploiting a physical phenomenon
called Förster resonance transfer (FRET). FRET between appropriately
labeled proteins only occurs when the labels are in
close vicinity (