Kärntner Schaf - Verein Kärntner Brillenschafe
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2.3.1.1 Methode NucleoSpin Multi96 Tissue/ MACHEREY-NAGEL<br />
19<br />
Material:<br />
2 ml Eppendorf Tubes<br />
Eppendorf-Schu ttler<br />
Multikanal-Pipetten<br />
Zentrifuge, Sigma 4-15C<br />
96er Deep-well Blocke (1,5 ml und 2 ml)<br />
NucleoSpin ’ Multi-96 Tissue Platten<br />
T1 (Lysispuffer, Kitkomponente)<br />
Proteinase K (20 mg/ml)<br />
B3 (Bindungspuffer, Kitkomponente)<br />
Ethanol absolut (99 %)<br />
BW (Waschpuffer, Kitkomponente)<br />
B5 (Waschpuffer, Kitkomponente)<br />
BE (Elutionspuffer = 5 mM TRIS/HCl, pH 8,5, Kitkomponente)<br />
Durchfu hrung: (nach Kit-Protokoll, modifiziert)<br />
Verdau:<br />
• Kegel in 2 ml Eppendorf Tubes geben<br />
• 590 –l T1 und 10 –l Proteinase K zu jeder Probe geben<br />
• bei 56 µC u ber Nacht auf Eppendorf-Schu ttler stellen<br />
Isolation:<br />
• BE auf 70 µC erwarmen<br />
• 205 –l Verdau in 2 ml-96well Platten u berfu hren<br />
• 200 –l B3 mit 8-Kanalpipette dazugeben und 10 min bei 70 µC inkubieren<br />
• kurz abzentrifugieren<br />
• 210 –l Ethanol absolut dazugeben und durch auf- und abpipettieren gut mischen<br />
• kurz abzentrifugieren<br />
• NucleoSpin ’ Multi-96 Tissue Platten in neue 2 ml-96well Platten stecken<br />
• Proben auf NucleoSpin ’ -Platten u berfu hren<br />
• 1 min bei 6000 x g zentrifugieren<br />
• umstecken in neue 1 ml-96well Platten<br />
• 500 –l BW dazugeben und 3 min bei 6000 x g zentrifugieren<br />
• umstecken in neue 1 ml-96well Platten<br />
• 500 –l B5 dazugeben und 3 min bei 6000 x g zentrifugieren<br />
• umstecken<br />
• und nochmal 500 –l B5 dazugeben und 5 min bei 6000 x g zentrifugieren<br />
• Eluat wegkippen und nochmal 3 min zentrifugieren<br />
• in neue 2 ml-96well Platten stecken und Filter 10 min bei 60 µC trocknen<br />
• 100 –l 70 µC warmen BE dazugeben und 1 min bei 6000 x g zentrifugieren<br />
• 100 –l 70 µC warmen BE dazugeben und nochmal 1 min bei 6000 x g zentrifugieren
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