Kärntner Schaf - Verein Kärntner Brillenschafe

2.3.5 Kapillarelektrophorese
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Die Fragmentlangenbestimmung der Amplifikate erfolgte mit einer lasergestu tzten
Kapillarelektrophorese. Dazu stand ein ABI Prism TM 310 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems, Wien) zur Verfu gung. Um alle Produkte einer Multiplex-Reaktion gleichzeitig
analysieren zu konnen, wurden die Primer mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen
markiert. Dabei musste darauf geachtet werden, dass die zu erwartenden Allellangenbereiche
einer Farbmarkierung sich nicht u berschneiden. Fur die 11 untersuchten Mikrosatelliten
wurde das folgenderma„ en gelost:
Tab. 6: Farbstoffmarkierung und Allellangen der 11 Mikrosatellitenmarker
Locus Multiplex-PCR Fluoreszenzfarbstoff Lange der Allele (bp)
McM42 1 FAM 81-107
TGLA53 1 FAM 140-163
OarFCB20 1 TET 85-116
INRA49 1 TET 133-159
MAF65 1 HEX 118-140
McM527 1 HEX 165-184
OarCP49 2 FAM 78-135
OarAE119 2 FAM 145-182
HSC 2 FAM 263-299
MAF214 2 TET 175-267
OarFCB11 2 HEX 120-145
Fu r die Kapillarelektrophorese wurde das gesamte PCR-Volumen von 15 –l eingesetzt. Zur
Denaturierung der Amplifikationsprodukte wurden in jedes PCR-Tube 60 –l Formamid
pipettiert und durch Auf- und Abziehen gut mit dem PCR-Ansatz gemischt. Zusatzlich
wurden die Proben vor dem Lauf bei 95 µC fu r 5 min denaturiert. Als Langenstandard wurde
GeneScan ’ -500 (TAMRA) Size Standard verwendet. Als Puffer stand 310 Genetic Analyzer
Puffer mit EDTA zur Verfu gung. Dieser wurde vor dem Einsatz 10fach verdu nnt. Die
Kapillare wurde mit dem Polymer POP-4 TM (Performance Optimized Polymer 4) gefu llt. Die
Vorbereitung und die Bedienung des Gerates erfolgte nach den Angaben des Herstellers
(Applied Biosystems, Wien).
2.4 Auswertung der Daten
Mittelwerte wurden stets mit Standardabweichung SD (©) angegeben.
2.4.1 Auswertung der Typisierungen
Die Auswertung der Typisierungen erfolgte mit den Softwareprogrammen GeneScan © 2.1.
und Genotyper © 2.1. (Applied Biosystems, Wien). GeneScan © 2.1. berechnet aus den
aufgenommenen Rohdaten der Kapillarelektrophorese mit Hilfe des Langenstandards die
jeweilige Lange der detektierten DNA-Fragmente. Das Softwareprogramm Genotyper © 2.1.