„Transformation von Osteospermum ecklonis mit ... - ArchiMeD
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Material und Methoden 24<br />
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Die Primer NAD5-5 und NAD5-3 (Mannerlöf et al., 1997) wurden als Kontrolle in PCR-Nachweisen<br />
zur Amplifikation eines Fragments des hochkonservierten <strong>mit</strong>ochondrialen Gens für NADH-<br />
Dehydrogenase, nad5 (Ecke et al., 1990) verwendet. Die Sequenz der Primer entspricht der Position<br />
1285-1307 (NAD5-5), bzw. Position 2093-2115 (NAD5-3) des <strong>mit</strong>ochondrialen Gens nad5 aus Beta<br />
vulgaris (GenBank X55786).<br />
Primer CHVE-5 und CHVE-3 dientem zum PCR-Nachweis des Gens chvE aus Agrobacterium<br />
tumefaciens. ChvE spielt als Monosaccharid-bindendes Protein eine wichtige Rolle bei der Induktion<br />
der Expression der vir-Gene (Shimoda et al., 1993). Die Primer binden an Position 854-873 (CHVE-5)<br />
und an Position 1461-1484 (CHVE-3). Die Positionen beziehen sich auf die unter GenBank D17457<br />
veröffentlichte Gensequenz. Mit dieser Primer-Kombination konnten regenerierte Pflanzen im PCR-<br />
Test auf eine Kontamination <strong>mit</strong> A. tumefaciens überprüft werden.<br />
Primer SPL3-35S entspricht einem Teil des 35S Promotors im SPL3-Konstrukt, Primer SPL3-241<br />
bindet innerhalb des SPL3-Gens an der Position 460-480 (GenBank Y09427). Zusätzlich enthält<br />
Primer SPL3-241 eine Xba I-Schnittstelle am 5'-Ende. Diese Primer-Kombination wurde zum PCR-<br />
Nachweis des SPL3-Konstrukts in transgenen Pflanzen benutzt.<br />
2.1.4. Chemikalien und Enzyme<br />
Sämtliche Restriktionsenzyme wurden <strong>von</strong> der Firma Eurogentec (Belgien) bezogen, Taq-DNA-<br />
Polymerase <strong>von</strong> der Firma Perkin-Elmer, Pwo-DNA-Polymerase und alle weiteren Enzyme, sofern<br />
nicht gesondert angegeben, <strong>von</strong> der Firma Boehringer Mannheim. Alle für Gewebekultur verwendeten<br />
Chemikalien, Medien, Phytohormone und Antibiotika wurden <strong>von</strong> der Firma Duchefa (Niederlande)<br />
bezogen.<br />
2.1.5. Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen<br />
<strong>Osteospermum</strong> <strong>ecklonis</strong> Pflanzen wurden <strong>von</strong> der Firma Kientzler zur Verfügung gestellt. Die bereits<br />
in vitro etablierten Pflanzen waren immunologisch auf Viren getestet und wurden in Weck-Gläsern<br />
auf MS-Medium <strong>mit</strong> 0.1 mg IES und 1 mg Kinetin pro Liter Medium geliefert. Die verwendeten<br />
Sorten sind Teil des Verkaufssortiments oder <strong>von</strong> züchterischem Interesse. Es handelt sich um O.<br />
<strong>ecklonis</strong>-Sorten aus der SPRINGSTAR®-Kollektion - 'Mira', 'Gemma', 'Sirius', 'Castor', 'Arctur' und<br />
'Pollux' - sowie 'Lila mini' und 'pp26/95'. Die in vitro Pflanzen wurden in einer Klimakammer bei<br />
24°C und einem Licht/Dunkel-Wechsel <strong>von</strong> 16 h/8 h angezogen.
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