„Transformation von Osteospermum ecklonis mit ... - ArchiMeD

Material und Methoden 36
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Reaktionsansatz : 5 µl Oligonukleotide (100µM)
2.5 µl 10x PNK-Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim)
2.5 µl 10 mM ATP
1 µl T4 Polynukleotidkinase (10 U/µl, Boehringer Mannheim)
14 µl H2O
Σ 25 µl
Inkubation des Reaktionsansatzes für 15 min. bei 37°C, anschließend Inaktivierung der PNK bei 75°C
für 10 min..
2.3.7. Amplifikation viraler cDNA-Fragmente
Die für die Konstruktion der LMV-Konstrukte notwendigen Amplifikationsschritte wurden mit Pwo
DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) aus Pyrococcus woesei durchgeführt. Durch seine
inherente 3'→5' Exonuklease-Aktivität hat Pwo DNA-Polymerase eine um das 10-fache höhere
Genauigkeit bei der Amplifikation gegenüber Taq DNA-Polymerase. Außerdem hat Pwo DNA-
Polymerase eine verbesserte Stabilität bei hohen Temperaturen. Durch die 3'→5' Exonuklease-
Aktivität der Pwo DNA-Polymerase war es notwendig, das Enzym erst direkt vor Beginn der
Amplifikation beizufügen. Zu diesem Zweck wurden zwei separate Reaktionsansätze vorbereitet, die
erst direkt vor dem Einsetzen der Reaktionsgefäße in die PCR-Maschine vereinigt wurden.
Reaktionsansatz 1: 0.5 µl 20mM dNTP
0.2 µl der jeweiligen Primer (100 µM)
1 µl pLMV15 (25 ng)
23.3 µl H2O
∑ 25 µl
Reaktionsansatz 2: 5 µl 10x Pwo-PCR Puffer (20 mM MgSO4)
0.5 µl Pwo DNA-Polymerase (5 U/µl)
19.5 µl H2O
∑ 25 µl