„Transformation von Osteospermum ecklonis mit ... - ArchiMeD

Material und Methoden 44
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2.4.4. Multiplex-PCR
Für N. benthamiana wurde noch eine weitere PCR-Methode zum Nachweis des pGJ-LMV-Prot
Konstrukts eingesetzt, die Multiplex-PCR (Mannerlöf & Tenning, 1997). Bei dieser Methode wird
neben dem Nachweis des Transgens noch eine interne Kontrolle amplifiziert, hier ein Fragment des
Gens für NADH-Dehydrogenase, nad5 (Ecke et al., 1990). Die Amplifikation des Transgens und der
internen Kontrolle ergibt in der Multiplex-PCR nach Auftrennen im Agarosegel zwei Banden. Bei
einer untransformierten Pflanze ist nur das Fragment der amplifizierten internen Kontrolle sichtbar.
Reaktionsansatz: 0.4 µl 20 mM dNTPs
0.2 µl Primer PCASS (100 µM)
0.2 µl Primer LMV6260R (100 µM)
0.5 µl Primer NAD5-5 (100 µM)
0.5 µl Primer NAD5-3 (100 µM)
3 µl MgCl2 (25 mM)
5 µl 10x PCR-Puffer II (ohne MgCl2)
0.4 µl Taq DNA-Polymerase (5 U/µl)
1 µl genomische Pflanzen-DNA
38.8 µl H2O
∑ 50 µl
Die Amplifikation verlief nach folgendem Schema:
Denaturierung der Probe 94°C 3 min.
Danach 40 Amplifikationszyklen:
Matrizendenaturierung 94°C 30 sec.
Primeranlagerung 58°C 30 sec.
Elongation 72°C 1 min.
Anschließend ein verlängerter Elongationsschritt:
72°C 3 min.