„Transformation von Osteospermum ecklonis mit ... - ArchiMeD

Material und Methoden 40
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2.3.12. Ligation
Die Ligation der linearisierten Klonierungsvektoren mit den entsprechenden Fragmenten erfolgte unter
Verwendung der T4 DNA-Ligase. Für eine effektive Ligationsreaktion sollte das Verhältnis von
Vektor zu klonierendem Fragment 1:3 betragen. Die Abschätzung der einzusetzenden Volumina
geschah durch Vergleich der Leuchtintensität der im Agarosegel aufgetrennten Banden.
10x Ligationspuffer: 200 mM Tris-HCl, pH 7.6
50 mM ATP
50 mM MgCl2
50 mM DTT
Ligationsansatz: 7 µl Vektor und Fragment im Mengenverhältnis 1:3
1 µl PEG 4000
1 µl 10x Ligationspuffer
1 µl T4 DNA-Ligase (1U/µl, Boehringer Mannheim)
Σ 10 µl
Der Ligationsansatz wurde 12-16 h bei 14°C (Butterfach des Kühlschranks) inkubiert.
Eine blunt-end Ligation erforderte besondere Reaktionsbedingungen: Der Ansatz enthielt zusätzlich 1-
1.5 µM Hexamincobalt-III-chlorid und 10-15% (w/v) PEG 4000. Beide Substanzen haben zwei
Effekte auf die Ligation. Einerseits erhöhen sie die Ligationsrate um 1-3 Größenordnungen, dies
erlaubt Ligationen bei niedrigen Enzym- und DNA-Konzentrationen. Andererseits beeinflussen sie die
Verteilung der Ligationsprodukte; intramolekulare Ligationen werden unterdrückt, die
Ligationsprodukte entstehen verstärkt aus intermolekularen Verknüpfungen (Sambrook et al., 1989).
10x blunt-end Ligationspuffer: 200 mM Tris-HCl, pH 7.6
50 mM MgCl2
50 mM DTT
5 mM ATP