„Transformation von Osteospermum ecklonis mit ... - ArchiMeD

Material und Methoden 28
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Für die Überführung der N. benthamiana Pflanzen von in vitro- in Erdkultur wurden die steril
gehaltenen, bewurzelten Sprosse aus den Petrischalen genommen und das Medium vorsichtig in
lauwarmem Wasser abgespült. Es wurden solche Pflanzen ausgewählt, deren Wurzeln eine maximale
Länge von 1 cm hatten. Anschließend wurden die Pflanzen in eine 1:1 Mischung (v/v) von Topferde
(Floraton 1, Floragard Oldenburg, pH 5,5 bis 6,5) und Sand gesetzt. Diese Mischung wurde zuvor gut
durchfeuchtet. Die Töpfe wurden mit Deckeln von Petrischalen abgedeckt, um eine hohe
Luftfeuchtigkeit für die ausgetopften Pflanzen zu gewährleisten.
Um Pilzbefall, z.B. Botrytis sp., zu verhindern, wurden die Pflänzchen mit einem Fungizid mit
Kontaktwirkung eingesprüht (0.2 % RONILAN WG, BASF). Die Töpfe wurden in ein S1-
Gewächshaus mit 14 h Tageslänge bei künstlicher Beleuchtung gestellt. Nach 4 Tagen wurde die
Abdeckung ein wenig verschoben, um eine vorsichtige Luftzufuhr zu ermöglichen. Jeweils nach 2
Tagen wurde der Deckel ein weiteres Mal um 1 cm verschoben und schließlich nach insgesamt 10
Tagen vollständig entfernt. Teilweise kam es zu Welkephasen, die meisten Pflanzen erholten sich
jedoch wieder. Es zeigte sich aber, daß relativ kleine Pflanzen (4-5 Blattstadium) die Überführung aus
in vitro- in Erdkultur am besten verkrafteten und ohne Wachstumsverzögerung sofort weiterwuchsen.
2.2.2 Transformation und Regeneration von Osteospermum ecklonis
Für die Transformationsexperimente mit O. ecklonis konnte auf keine publizierten Protokolle
zurückgegriffen werden. Daher war es notwendig, zunächst eine Methode zur Regeneration von
Pflanzen aus vegetativem Gewebe zu finden. Aufgrund der Erfahrung mit N. benthamiana wurde auch
für O. ecklonis die Regeneration über Kallusbildung an Blattscheiben erwogen.
Regeneration von O. ecklonis
Als Pflanzengewebe für die Regenerationsversuche wurden ca. 1 cm 2 große Blattstücke von in vitro
vermehrten O. ecklonis verwendet. Diese Pflanzen waren auf Vermehrungsmedium F3 (MS, 10 g
Agar/l, 30 g Saccharose/l, 0.1 mg IAA, 1 mg Kinetin/l) angezogen worden. Es wurden möglichst
junge Blätter entnommen und entsprechend der Vorgehensweise bei N. benthamiana zerschnitten.
Zusätzlich wurden die Blattstücke mit wenigen Stichen oder Schnitten perforiert, um möglichst große
Wundflächen zu erzeugen. Anschließend wurden die Blattstücke auf MS-Platten (8.5 g Agar/l, 30 g
Saccharose/l) aufgelegt. Um geeignete Bedingungen für die Bildung adventiver Sprosse zu finden,
wurden verschiedene Kombinationen von Phytohormonkonzentrationen verwendet. Als
Phytohormone wurden ein Auxin (Indol-3-Essigsäure, IAA) und ein Cytokinin (6-Benzylaminopurin,
BAP) verwendet. Eine ausgewogene Kombination von Auxin und Cytokinin führt in vielen