„Transformation von Osteospermum ecklonis mit ... - ArchiMeD

Material und Methoden 42
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Eventuell konnte auf den Chloroform-Reinigungsschritt verzichtet werden, wenn eine niedrigere
Ausbeute toleriert werden konnte. Anschließend wurde die Probe bei Raumtemperatur 2 min.
inkubiert und 5 min. bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Pellet mit
500 µl 70% (v/v) Ethanol (-20°C) gewaschen. Anschließend wurde das Pellet in 100 µl TE (10 mM
Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) aufgenommen. Die Probe wurde 30 min. bei 65°C im Wasserbad
resuspendiert und danach über Nacht im Kühlschrank (+4°C) gelagert. Danach wurde die Probe 1 min.
bei 13.000 rpm zum Abtrennen ungelöster Bestandteile zentrifugiert und 5 µl des Überstands zur
quantitativen und qualitativen Kontrolle der Extraktion auf ein Agarosegel aufgetragen. Zur
Bestimmung der DNA-Konzentration mit dem "Fluorescent DNA Quantitation Kit" (Bio-Rad) im
Fluorometer wurden die aus O. ecklonis gewonnenen Proben 1:5 (v/v) verdünnt.
Für PCR-Nachweise des Transgens wurden pauschal 1µl der Gesamt-DNA als Matrize eingesetzt.
2.4.2. Nachweis des nptII-Gens
Der Nachweis des nptII-Gens, das in der T-DNA aller Transformationsvektoren (außer pBAR-SPL3)
als Selektionsmarker vorhanden ist, erfolgte durch PCR mit den Primern NPTII-3 und NPTII-5.
Reaktionsansatz: 0.2 µl 20 mM dNTPs
0.5 µl Primer NPTII-3 (100 µM)
0.5 µl Primer NPTII-5 (100 µM)
3 µl MgCl2 (25 mM)
5 µl 10x PCR-Puffer II (ohne MgCl2)
0.3 µl Taq DNA-Polymerase (5 U/µl)
1 µl genomische Pflanzen-DNA
39.5 µl H2O
∑ 50 µl
Die Amplifikation verlief nach folgendem Schema:
Denaturierung der Probe 94°C 1 min.
Danach 40 Amplifikationszyklen:
Matrizendenaturierung 94°C 20 sec.
Primeranlagerung 55°C 20 sec.
Elongation 72°C 45 sec.