„Transformation von Osteospermum ecklonis mit ... - ArchiMeD

Material und Methoden 38
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2.3.9. Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Wenn im Gel aufgetrennte DNA-Fragmente für weitere Klonierungsschritte verwendet werden sollten,
wurden sie unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten und in ein 2-ml Mikroreaktionsgefäß
überführt. Die Eluierung erfolgte mit Hilfe des “JETSORB DNA Extraction-Kit” (Genomed), im
Wesentlichen nach Angaben des Herstellers. Sofern das Gewicht des Gelfragments 100 mg nicht
überschritt, wurden 300 µl Puffer A1 und 10 µl JETSORB Suspension hinzugefügt. Die Probe wurde
gevortext und 15 min. bei 50°C inkubiert. Anschließend wurde das Mikroreaktionsgefäß 20 sec. bei
11.000 rpm (Heraeus Biofuge 13) zentrifugiert und der Überstand vollständig abgenommen. Bei dem
anschließenden Waschen mit Puffer A1 und A2 war darauf zu achten, daß die JETSORB Silicat-
Partikel niemals durch Vortexen resuspendiert wurden. Nach dem letzten Waschschritt wurde das
Pellet 30 min. an der Luft getrocknet. Die Elution der DNA von den Silicat-Partikeln geschah durch
Zugabe von 15 µl H2O und anschließender Inkubation für 5 min. bei 60°C. Nach Zentrifugation der
Probe für 45 sec. bei 13.000 rpm wurde der Überstand abgenommen, in ein 0.5-ml
Mikroreaktionsgefäß überführt und ein weiteres Mal 45 sec. bei 13.000 rpm zentrifugiert. Durch die
zweifache Zentrifugation konnten enzymatische Reaktionen hemmende Silicat-Partikel sicher
abgetrennt werden.
2.3.10. Generieren von glatten Enden (blunt-ends)
Sollten kohäsive Enden von linearisierten Plasmiden mit glatten Enden (blunt-ends) eines Inserts
verknüpft werden, mußten zuvor die 5'-Überhänge aufgefüllt, bzw. die 3'-Überhänge abgebaut werden.
Das Auffüllen der 5'-Überhänge erfolgte mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E.
coli.
Reaktionsansatz: 10 µl restriktionsverdaute Plasmid-DNA (0.5-1 µg)
0.5 µl dNTPs (10 mM)
1 µl Klenow-Fragment (2 U/µl, Boehringer Mannheim)
2 µl 10x Klenow-Fragment Reaktionspuffer
5.5 µl H20
Σ 20 µl