„Transformation von Osteospermum ecklonis mit ... - ArchiMeD

Material und Methoden 34
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Vorbehandlung
Mit einer Bakterien-Kolonie wurden 5 ml Vorkultur (LB-Medium) angeimpft und über Nacht auf dem
Schüttler bei 200 rpm und 27°C inkubiert. Das LB-Medium enthielt in allen Schritten Antibiotika, die
sicherstellen, daß nur Bakterien mit Helfer-Plasmid wachsen (50 mg Gentamycin/l für GV3101
pMP90). Für den Stamm ATHV pEHA101 ist diese Selektion allerdings nicht möglich, da die
Kanamycin-Resistenz auf dem Helfer-Plasmid deletiert ist. Mit 3 ml der Vorkultur wurden 250 ml
Hauptkultur inokuliert und ebenfalls über Nacht auf dem Schüttler bei 200 rpm und 27°C inkubiert.
Bei einer OD600 nm von 0.5-0.6 wurden die Zellen geerntet, indem sie im Eisbad 10-15 min. gekühlt
und dann 10 min. bei 3000g in 50-ml Röhrchen (Falcon Tubes) bei 2°C in der Kühlzentrifuge (4000
rpm in Hermle Z383K) zentrifugiert wurden. Auch bei allen weiteren Arbeitsschritten sollten die
Zellen kühl gehalten werden, entweder auf Eis oder in der vorgekühlten Zentrifuge. Das
Bakterienpellet wurde in insgesamt 200 ml kaltem, sterilem Wasser aufgenommen (40 ml pro
Röhrchen) und ein weiteres Mal wie oben beschrieben zentrifugiert. Danach wurde das Pellet in
insgesamt 100 ml Wasser aufgenommen (20 ml pro Röhrchen). Nach einem weiteren
Zentrifugationsschritt wurde das Pellet in insgesamt 50 ml kaltem, sterilem 10%igem Glycerin
aufgenommen (10 ml pro Röhrchen). Die Suspensionen wurden vereinigt und in 30-ml Glasröhrchen
(Schott Mainz) bei 3000g 10 min. zentrifugiert. Das Pellet wurde in insgesamt 1 ml (500 µl pro
Röhrchen) kaltem, sterilem 10%igem Glycerin resuspendiert und in 50 µl Aliquots aufgeteilt. Diese
Aliquots wurden direkt für die Elektroporation verwendet oder in 1.5-ml Nalgene Cryotubes bei -80°C
eingefroren.
Elektroporation
In einem Eisbad wurden die vorbereiteten Zellen aufgetaut und die durch einen QUIA-Miniprep
gereinigte Plasmid-DNA sowie die Elektroporationsküvette (BioRad, 0.2 cm Elektrodenabstand)
gekühlt. Für eine Elektroporation wurden ca 50-100 ng Plasmid-DNA verwendet (entspricht ca 1-2 µl
aus einem QUIA-Miniprep). Am Elektroporator (BioRad Gene Pulser II + Pulse Controller II) wurden
folgende Parameter eingestellt: Spannungsstärke 2.5 kV, Kapazität 25 µF und Widerstand 200 Ω.
Die Plasmid-DNA (1-2 µl) wurde zu den Zellen (50 µl) pipettiert und gut vermischt. Nach 2 min.
Inkubation auf Eis wurde die Bakteriensuspension in die vorgekühlte Küvette gegeben. Diese wurde
sorgfältig von Wasser und Eis befreit und in den Probeschlitten des Elektroporators eingesetzt. Der
Spannungsimpuls wurde appliziert, der bei obigen Einstellungen ca. 5 ms dauerte. Sofort nach der
Elektroporation wurde 1 ml SOC-Medium [0.5% (w/v) Hefe-Extrakt, 2% (w/v) Trypton, 10 mM