Dissolved organic matter in water of Daugava river

Mycobacterium tuberculosis antibiotiku rezistenci izraisošo mutācijunoteikšana pēc DNS denaturācijas laikā novērotajām fluorescences līmeņaizmaiņāmA.Kalviša 1 , I. Jansone 1 , V. Baumanis 11 Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs, Rīga, Latvijae-mail: adrija.kalvisa@gmail.comIevads: Ar rezistenci saistīto punktveida mutāciju spektrs un izvietojums M. tuberculosisgenomā ir plašs, tādēļ ir nepieciešama metode ātrai mutāciju klātbūtnes konstatēšanaivairākos genoma fragmentos vienlaicīgi. Augstas izšķirtspējas DNS kušanas līknesanalīze (high resolution melting jeb HRM) ir metode, kas pēc fluorescences nosakamutāciju izraisītas DNS fragmentu denaturācijas īpašību izmaiņas. HRM izmantošanaiepriekš veiksmīgi izmantota, nosakot mutācijas pēc DNS, kas izdalīta no M. tuberculosistīrkultūrām 1 , tomēr nav skaidras metodes pielietošanas iespējas atšķirīgas kvalitātesklīnisko paraugu analīzē.Mērķis: Noskaidrot HRM metodes pielietošanas iespēju robežas M. tuberculosisantibiotiku rezistences mutāciju molekulārģenētiskajai noteikšanai no klīniskā materiālaizdalītos DNS paraugos. Pārbaudīt metodes jutību genoma fragmentos ar atšķirīgiemmutāciju veidiem un mainīgu mutāciju daudzveidību.Metodes: Darbā tika izmantota M. tuberculosis DNS, izdalīta no slimnieku klīniskāmateriāla. Pētījuma objekti:a) ar streptomicīna rezistenci saistītās mutācijas 16S rRNS kodējošā rrs gēna fragmentā18 paraugos (2 dažādas mutācijas 8 paraugos, 10 savvaļas tipa paraugi).b) GyrA gēna hinolonu rezistenci determinējošā rajona (QRDR) mutācijas 32 paraugos (8dažādas mutācijas 13 paraugos, 8 savvaļas tipa paraugi un 3 jaukta tipa paraugi).DNS fragmenti pavairoti ar reālā laika PCR (polimerāzes ķēdes reakcijas) iekārtu Viia7(LifeSciences) DNS interkalējošas fluorescentās krāsas klātbūtnē. Katrs paraugsamplificēts divās paralēlās reakcijās. Mutāciju klātbūtne konstatēta, mērot interkalējošaskrāsas fluorescenci pakāpeniskā temperatūras pieaugumā un salīdzinot amplikonadenaturācijas temperatūru (T D ) ar atskaites DNS fragmenta T D . Visi iegūtie dati parmutāciju klātbūtni salīdzināti ar sekvenēšanas rezultātiem.Rezultāti: a) HRM analīze rrs gēna 8/8 mutantiem paraugiem un 7/10 savvaļas tipaparaugiem sakrita ar sekvenēšanas rezultātiem, savukārt atlikušie 3 savvaļas tipa paraugudati bija pretrunīgi.b) GyrA gēnam sakrita tikai 3/13 savvaļas tipa un 1/8 mutanto paraugu piederība, bet 3jaukta tipa paraugi deva pretrunīgus rezultātus.Secinājumi: HRM metode veiksmīgi izmantota streptomicīna rezistences mutācijukonstatēšanai un atšķiršanai no neitrālām mutācijām. Savukārt liela mutāciju daudzveidībaun mutācijas, kuru ietekme uz T D ir maza, apgrūtina mutāciju atšķiršanu un HRMizmantošanu hinolonu rezistences noteikšanai klīniskajos paraugos.1. Chen, X., Kong, F., Wang, Q., Li, C., Zhang, J., Gilbert, G.L. Rapid detection of isoniazid,rifampin, and ofloxacin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates using highresolution melting analysis. J Clin Microbiol, 2011, vol. 49, p. 3450-7- 22 -