Dissolved organic matter in water of Daugava river

Melanokortīna 1. receptora gēna polimorfismu funkcionālās lomasizvērtēšana, izmantojot konfokālo lāzerskenējošo mikroskopijuA.Ozola* 1 , R.Petrovska 1 , I.Mandrika 1 , O.Heisele 1 , D.Pjanova 11 Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs, Rīga, Latvijae-mail: aija.ozola@biomed.lu.lvIevads. Melanoma ir ļaundabīgs ādas audzējs, kas veidojas no melanocītiem. Viens nozināmākajiem melanomas riska gēniem ir melanokortīna 1. receptora gēns (MC1R), kasiesaistīts ķermeņa pigmentācijas regulācijā. MC1R ir ļoti polimorfs. Asociāciju pētījumos irparādīta biežāk sastopamo MC1R polimorfismu saistība ar ķermeņa pigmentāciju un/vaipaaugstinātu melanomas risku, savukārt in vitro pētījumos ir pierādīta to ietekme uz receptorafunkcionālo aktivitāti. Pārējie MC1R polimorfismi ir reti sastopami, un tāpēc tiek uzskatīts, kato ietekme uz melanomas risku nav vērā ņemama. Tomēr daļa no šiem polimorfismiem varētumainīt receptora funkcionālo aktivitāti un līdz ar to arī ietekmēt melanoma risku.Mērķis. Izvērtēt Latvijas populācijā atrasto reto MC1R polimorfismu (g.133T>C Phe45Leu,g.248C>T Ser83Leu, g.265G>C Gly89Arg, g.284C>T Thr95Met, g.363C>G Asp121Glu,g.493G>A Val165Ile, g.550G>C Asp184His, g.562G>A Val188Ile, g.637C>T Arg213Trp)ietekmi uz receptora funkcionālo aktivitāti.Metodes. Izmantojot PCR mutaģenēzi, tika izveidoti MC1R konstrukti ar minētajiempolimorfismiem. Mikroskopijas vajadzībām tika izveidots otrs MC1R konstruktu komplekts,kurā polimorfismus saturošie MC1R varianti tika sajūgti ar GFP (green fluorescent protein).Visi konstrukti tika ekspresēti BHK (baby hamster kidney) šūnās. Konstrukti bez GFP tikaizmantoti cikliskā adenozīna monofosfāta (cAMP) aktivācijas līmeņa noteikšanai. Konstruktiar GFP tika analizēti, izmantojot konfokālo lāzerskenējošo mikroskopu Leica TCS SP2.Šūnām, kas tika analizētas mikroskopijā, membrānas tika iekrāsotas ar fluorescento krāsvieluAlexa Fluor 633 WGA (wheat germ agglutinin). MC1R konstruktu šūnas virsmas ekspresijaslīmeņa kvantitatīvai analīzei tika izmantots programma Leica Confocal Software (Las AFv2.6.0). Konfokālās mikroskopijas attēlos katrai no kopumā sešām šūnām (pa trim šūnām nodivām neatkarīgām transfekcijām) tika nejauši izvēlēti 10 lineāri ROI (regions of interest).ROI krustpunktā ar šūnas membrānu tika nolasīta GFP/WGA fluorescences intensitātesattiecība. Rezultātā katra konstrukta gadījumā tika iegūta datu kopa, kas sastāv no 120GFP/WGA vērtībām. Iegūtās GFP/WGA vērtības tika izmantotas kvantitatīvā receptora šūnasvirsmas ekspresijas līmeņa novērtēšanā, izmantojot neparametrisko Kruskal-Wallis testu unDunn’s daudzkārtējo salīdzinājumu testu.Rezultāti. Konfokālās lāzerskenējošās mikroskopijas attēlu analīze rāda, ka polimorfismuSer83Leu un Gly89Arg gadījumā MC1R ekspresija uz šūnas virsmas salīdzinājumā arsavvaļas tipa receptoru tiek pilnībā kavēta, Asp121Glu un Arg213T gadījumā virsmasekspresija ir pazemināta, bet pārējo polimorfismu gadījumā tā ir tādā pašā līmenī kā savvaļastipa receptoram. Matriksa tabula, kas tika izveidota, izmantojot ranga summas no Dunn’sdaudzkārtējo salīdzinājumu testa, rāda, ka ranga summu atšķirības starp polimorfajiem MC1Rvariantiem ar Ser83Leu, Gly89Arg, Asp121Glu vai Arg213T un savvaļas tipa receptoru irstatistiski ticamas (p