THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS 6 Capucine ...

2. Electrotransfert 23
∆Ψs. La valeur ∆Ψs étant globalement la même pour les membranes biologiques (200-300mV),
cela signifie que la valeur seuil du champ électrique nécessaire pour obtenir une perméabilisation
de la membrane (Es) est inversement proportionnelle aux paramètres de forme et de taille de la
cellule considérée. Ainsi pour des cellules eucaryotes en culture (⊘ 10 à 30µm) Es est de l’ordre
de 1000V/cm, et de l’ordre de 6000V/cm pour des bactéries (E.coli ⊘ 1 à 5 µm).
Lorsque la valeur du champ électrique seuil est dépassée, plus la différence entre la valeur seuil
et la valeur appliquée est grande, plus la surface perméabilisée est étendue. En effet l’équation 2
montre que pour un champ électrique donné, la différence de potentiel transmembranaire induite
varie en fonction du point considéré sur la membrane. Plus l’angle formé entre la direction du
champ et la direction perpendiculaire à la tangente au point considéré augmente, plus le potentiel
transmembranaire induit diminue. Au delà d’un angle donné, ∆Ψi devient inférieur à la valeur
seuil permettant la perméabilisation. La relation entre le champ électrique appliqué et la surface
perméabilisée a été mise en évidence in vitro par marquage fluorescent des zones perméabilisées
de la cellule [68]. Ces travaux ont aussi montré que c’est d’abord la face de la cellule du côté
anode qui est perméabilisée, le potentiel de membrane négatif de la cellule s’ajoutant à celui créé.
Transfert d’ADN
Les mécanismes moléculaires du transfert d’ADN lors de l’électroperméabilisation sont encore
mal élucidés. Différents modèles ont été proposés :
Un modèle suggère que l’électroperméabilisation conduit à la formation d’«électropores» relativement
stables [64,69]. L’ADN plasmidique pourrait éventuellement passer la membrane après
une étape de liaison à la surface de la cellule puis par diffusion. Cependant ces pores n’ont jamais
pu être visualisés.
Une autre théorie suggère que l’ADN plasmidique passe la membrane pendant l’application
des impulsions électriques, et ceci grâce à des forces électrophorétiques associées au champ
électrique. Cet effet électrophorétique a été montré lors de différentes études : Klenchin et al.
ont démontré la nécessité de la présence de l’ADN au moment de l’application du champ électrique
[70]. De plus ils ont montré que l’efficacité de transfection dépendait de la polarité du
champ électrique. Sukharev et al. ont également montré que des impulsions de courte durée à
haut voltage (HV) induisaient une perméabilisation de la membrane mais pas de transfection, des
impulsions de longue durée à bas voltage (LV) n’induisaient également aucune transfection par
contre la séquence HV puis LV permettait d’obtenir une transfection. Une hypothèse proposée
était que la transfection des cellules perméabilisées par HV n’était possible que si on induisait
une électrophorèse de l’ADN avec LV [71].
Une étude par microscopie de fluorescence à l’échelle de la cellule [72] a révélé que des impulsions
électriques de l’ordre de la milliseconde induisaient une interaction entre la membrane électroperméabilisée
et l’ADN. Une accumulation de plasmide fluorescent a été observée au contact
de la membrane cellulaire côté cathode sans pour autant immédiatement se déplacer dans le
cytosol. Ainsi l’ADN doit être présent pendant les impulsions et l’électrophorèse induite par le
champ favorise son insertion dans la membrane, mais l’ADN ne franchit la membrane électroperméabilisée
que dans la minute suivante [73]. Le même groupe a récemment démontré la relation
directe entre l’interaction ADN/membrane et l’efficacité de transfection : une augmentation de
la surface de contact entre l’ADN et la membrane conduit à une plus forte expression [74].