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44 Introduction – inductibilité : le système doit avoir un niveau d’expression basal faible et une induction rapide et élevée. – biodisponibilité : l’inducteur doit être une drogue biodisponible par voie orale et capable de pénétrer tous les types tissulaires. – réversibilité : l’inducteur doit avoir une cinétique d’élimination rapide dans tous les tissus pour permettre des cycles répétés et rapides d’induction/répression. – immunogénicité : l’activateur de transcription et l’inducteur doivent avoir un faible potentiel immunogène. – dose-dépendance : la réponse du système doit être modulable par variation de la concentration de l’inducteur. – «ON» switch : l’inducteur doit activer la transcription («ON» switch) plutôt que l’inhiber («OFF» switch). Les systèmes «OFF» posent en effet plusieurs problèmes : ils nécessitent pour éteindre le système une exposition prolongée à la drogue inductrice et les cinétiques d’inductions dépendent fortement des cinétiques d’élimination de la drogue. – flexibilité : les composantes du système de régulation doivent pouvoir être facilement modulables (mutations ponctuelles par exemple) pour une optimisation éventuelle ou une adaptation du système à différentes configurations thérapeutiques ou tissus spécifiques. Systèmes existants basés sur des éléments endogènes Les premiers systèmes de régulation de l’expression génétique développés reposaient sur des éléments de réponse endogènes (promoteurs, séquences activatrices de transcription («enhancers»)) qui répondaient à des changement physiologiques ou environnementaux exogènes tels que la chaleur [235], l’hypoxie [236], des cytokines [237] ou des métaux lourds [238] par exemple. Ces systèmes présentent cependant un risque d’interférence avec les réseaux endogènes de régulation des cellules cibles, répondant aux mêmes inducteurs. Ces phénomènes pleïotropiques peuvent conduire à des effets secondaires non contrôlés [233]. C’est pourquoi de nouvelles approches de régulation basées sur des séquences exogènes (non mammifères ou des versions mutées d’éléments endogènes) ont été développées. Systèmes existants basés sur des éléments exogènes Systèmes régulables par la tétracycline Système suppressible par la tétracycline : Tet-Off Le système régulable à la tétracycline a été développé initialement par Gossen et Bujard en 1992 sous le nom de système Tet-Off. Ce système est basé sur les éléments de régulation de l’opéron du gène de résistance à la tétracycline du transposon Tn10 d’Escherichia coli [239]. Chez la bactérie, la résistance à la tétracycline est assurée par une protéine dont l’expression est induite par l’antibiotique. L’induction se fait au niveau transcriptionnel en déplaçant par changement conformationnel une protéine répresseur de la transcription (tetR), normalement fixée sur un opérateur tetO. Pour créer le système initial Tet-Off suppressible par la tétracycline, une protéine de fusion artificielle tTA a été construite en fusionnant le domaine de transactivation de la protéine VP16 du virus de l’herpès simplex avec le domaine de liaison à tetO de la protéine tetR. Le résultat est donc une protéine de fusion activatrice de transcription et sensible à la tétracycline. Sept copies de la séquence de tetO ont été placées en amont du promoteur minimum du CMV. Ainsi, en absence de tétracycline, la protéine de fusion tTA se fixe sur tetO et active la transcription. Par contre en présence de tétracycline, la protéine tTA subit un changement de conformation ce
4. Régulation temporelle de l’expression des gènes 45 qui diminue son affinité pour tetO et inactive ainsi indirectement l’initiation de la transcription (figure 13). tet tetO 7 CMVmin tetR VP16 tetR VP16 tetO 7 CMVmin Gène d’intérêt tTA tetR VP16 tetR tet VP16 tet tetR VP16 tetO 7 CMVmin Gène d’intérêt Fig. 13 – Système suppressible par la tétracycline Tet-Off Une induction d’un facteur 10 5 a été reportée dans des cellules HeLa exprimant tTA constitutivement en passant de 1mM à une absence totale de tétracycline dans le milieu de culture [239]. Chez des souris transgéniques, des facteurs d’induction allant de 1 à 5000 ont été mesurés en fonction du tissu étudié [240]. Ce système de régulation a également été utilisé avec succès in vivo avec le gène de l’érythropoïétine [241] ou celui d’immunoglobulines permettant la production régulée d’anticorps monoclonaux [147]. Système inductible par la tétracycline : Tet-On Le principe du système Tet-Off implique d’administrer l’antibiotique inhibiteur pour annuler l’expression du gène d’intérêt. Ceci risque, dans certains cas, de nécessiter des traitements assez longs avec l’antibiotique. C’est pourquoi, à partir de ce système Tet-Off supressible par la tétracycline, le groupe de Bujard a développé en 1995 un système inductible par la tétracycline appelé Tet-On [242]. Quatre acides aminés du tetR ont été modifiés pour créer le rtetR (reverse tetR). La protéine transactivatrice rtTA qui contient cette séquence n’a de forte affinité pour tetO qu’en présence de tétracycline ou de ses analogues (tels que la doxycycline) (figure 14). Ce système a montré une bonne inductibilité en réponse à la tétracycline ou son analogue la doxycycline : un facteur de plus de 1000 fois a été observé dans des cellules HeLa exprimant le rtTA de manière constitutive en ajoutant de la doxycycline dans le milieu de culture. Chez des souris doublement transgéniques, une régulation positive induite par la doxycycline a été observée et les facteurs d’induction varient de 1 à 7000 selon les tissus [243]. Bien qu’efficace, les applications in vivo de ce système inductible ont été moins nombreuses que celles du système Tet- Off car de grandes quantités de doxycycline doivent être administrées et ce système de régulation Tet-On originel présente plus d’expression basale que le système Tet-Off, probablement due à une légère fixation résiduelle du rtTA au tetO en absence d’inducteur. Quelques-unes sont relatées dans la littérature [241,244,245].
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Conclusion Le transfert de gène a
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Résumé Transfert de gène in vivo
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