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46 Introduction tet tetO 7 CMVmin rtetR VP16 tetR VP16 tetO 7 CMVmin Gène d’intérêt rtTA rtetR VP16 tetR tet VP16 tet rtetR VP16 tetO 7 CMVmin Gène d’intérêt Fig. 14 – Système inductible par la tétracycline Tet-On Dernières améliorations du système Tet-On De nombreuses modifications ont récemment été apportées au système Tet-On afin de réduire le niveau basal d’expression et d’augmenter l’efficacité du système en réponse à la doxycyline. Le progrès majeur a été l’isolation de deux nouveaux variants de rtTA, nommés rtTA2 S -S2 et rtTA2 S -M2 : ils sont toujours sensibles à la doxycycline mais ont un niveau d’activité basal beaucoup plus faible dans l’état non induit que le Tet-On originel [246]. De plus, leur séquence a été optimisée par l’usage des codons, permettant une meilleure expression et une plus grande stabilité. Enfin ils possèdent un domaine de transactivation minimal noté VP16-F3 qui consiste en trois répétitions en tandem d’un peptide de 12 acides aminés dérivé de VP16 [246]. rtTA2 S -S2 présente un niveau basal légèrement plus faible que rtTA2 S -M2, ce dernier présentant néanmoins l’avantage d’être environ 10 fois plus sensible à la doxycycline [216,246]. Plusieurs études ont prouvées que ces deux transactivateurs étaient capable de contrôler efficacement in vivo la transcription de nombreux transgènes après transfert dans différents tissus et ce avec une grande variété de vecteurs [216, 247, 248]. Néanmoins des études de dose/réponse semblent montrer que la robustesse du contrôle est perdue à fortes doses de vecteurs. Un contrôle plus strict du bruit de fond résiduel du système Tet-On a également été obtenu en rajoutant un répresseur de transcription, ou «silencer» tTS (tetracycline transcriptionnal silencer) sous contrôle également de la tétracycline. Le tTS est le résultat de la fusion du domaine répresseur KRAB (Kruppel-associated Box) de la protéine humaine Kid-1 avec le répresseur de la transcription tetR initial [249]. La co-expression du rtTA et d’un tTS permet une régulation très sensible : en absence de doxycycline, le tTS se lie au tetO et inhibe la transcription basale ; en rajoutant la doxycycline, le tTS se dissocie de sa cible ADN pendant que le rtTA devient actif et active la transcription (figure 15). Plusieurs études semblent montrer effectivement qu’un tel système dual rtTA/tTS réduit de façon significative le bruit de fond basal de l’expression d’un transgène in vivo [250–252]. Les versions les plus évoluées du système Tet-On combinent même les variants du rtTA, rtTA2 S -S2 et rtTA2 S -M2, avec le répresseur tTS [251–253].
4. Régulation temporelle de l’expression des gènes 47 tet tetO 7 CMVmin tetR KRAB tetO 7 CMVmin rtetR VP16 tetR VP16 tet rtetR KRAB tetO 7 CMVmin Gène d’intérêt tTS rtTA tetR rtetR KRAB VP16 tetR tet tet KRAB tet rtetR tet tetR rtetR KRAB VP16 VP16 tetO 7 CMVmin Gène d’intérêt Fig. 15 – Système inductible par la tétracycline Tet-On + tTS Remarques Les systèmes Tet sont de loin les systèmes de régulation les plus utilisés actuellement. Une de leurs originalités repose sur l’origine procaryote des séquences tetR/rtetR et tetO qui assure une réponse spécifique et l’absence d’effets pléiotropiques. De plus, la doxycycline est un antibiotique non toxique pour les cellules de mammifères, dont la pharmacologie est bien connue et dont l’administration semble bien tolérée par les patients. La doxycycline est disponible par voie orale, a une demi-vie de 14-22 heures et a l’avantage de bien pénétrer dans les tissus. Les dernières versions du système Tet-On ont fonctionné chez les rongeurs et les singes avec des doses de doxycycline du même ordre de grandeur que celles couramment utilisées dans un but antibiotique [252]. La doxycycline est bien tolérée au moins à court et moyen terme (quelques mois) ; son seul inconvénient est que des traitements in vivo prolongés peuvent conduire à son accumulation dans les os ce qui a pour conséquence une libération lente de la drogue et donc une extinction du système Tet-On plus lente. Ceci représente une limitation pour des utilisations sur de longues périodes. Il faut également noter une possible résistance à cet antibiotique au cours du temps bien que cet antibiotique soit de moins en moins utilisé, et une possible immunogénicité du transactivateur de part son origine procaryote (voir chapitre 2). Systèmes basés sur des récepteurs aux hormones stéroïdes Système inductible par l’ecdysone : chez les insectes, l’ecdysone active une série d’événements transcriptionnels via un récepteur hétérodimérique formé du récepteur nucléaire EcR et du produit du gène ultraspirale (UPS). En présence de l’hormone, le récepteur EcR, complexé à USP se lie à des éléments de réponse et permet une transactivation de la transcription. Ce système naturel de régulation a été modifié pour être utilisable chez les mammifères [254]. Un récepteur chimérique contenant le domaine de transactivation de VP16 fusionné à la partie
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