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36 Introduction Etude d’expression et fonction de gènes L’électrotransfert est un outil efficace pour l’étude de l’expression et des fonctions d’un gène dans une grande diversité de tissus. Cette technique est en particulier utilisée en biologie du développement [125]. Saito et al. ont par exemple réalisé un électrotransfert dans le cerveau d’embryons de souris in utero et ex utero [126] : ils ont observé l’expression de la GFP dans différentes régions ciblées du cerveau et ont visualisé la morphologie de neurones. Dans une autre étude, l’électrotransfert a été utilisé pour l’invalidation d’un gène d’une voie de signalisation dans une étude de régénération de nageoire [209]. ARN interférence Très récemment il a été démontré qu’un ARN double brin pouvait être introduit efficacement par électrotransfert in vivo dans différents tissus, tels que l’embryon de poulet [210, 211], le cerveau de rat [212], le muscle de souris [213,214] ou la rétine [135], conduisant au mécanisme d’ARN interférence. Ces deux approches, transfert d’un ADN ou d’un ARN double brin par électrotransfert in vivo, sont deux méthodes complémentaires et utiles pour l’analyse de fonction de gènes. En effet deux stratégies sont couramment utilisées pour étudier la fonction d’un gène in vivo : l’analyse du gain ou de la perte de fonction. L’électrotransfert in vivo est un outil pour ces deux stratégies : le gain de fonction peut être obtenu en surexprimant un gène d’intérêt, alors que la perte de fonction peut être obtenue par stratégie antisens ou ARN interférence. Dans ce contexte, on peut citer par exemple, le développement de l’électrotransfert in ovo chez le poulet qui permet d’introduire simplement et efficacement divers acides nucléiques dans l’embryon de poulet, qui est un modèle classique pour des études de développement [215]. Etude de systèmes de régulations L’électrotransfert peut être un outil efficace pour l’étude et la mise au point de systèmes de régulation, comme le système à la tétracycline qui nécessite la co-transfection d’au moins deux plasmides au sein d’une même cellule. Par exemple, Lamartina et al. ont étudié par électrotransfert l’activité de nouveaux transactivateurs sensibles à la doxycycline dans un système de régulation [216]. Nous avons également étudié par électrotransfert l’efficacité d’un système de régulation de l’expression de gène composé de trois plasmides utilisant le système répressible à la tétracycline combiné à une stratégie antisens ( [217] et chapitre 2). 4 Régulation temporelle de l’expression des gènes 4.1 Une large étendue d’applications Dans le contexte du transfert de gène in vivo, il est très utile voire même indispensable de disposer d’un système de régulation de l’expression de gène, que ce soit pour appréhender leur fonction ou pour moduler leur activité à des fins thérapeutiques. A l’heure actuelle, la connaissance de l’ensemble du génome humain a comme conséquence le clonage et la caractérisation fonctionnelle de nombreuses nouvelles protéines, qui exigeront des études fonctionnelles à la fois in vitro et in vivo. Étudier la fonction d’un gène nécessite souvent l’expression du gène à un moment bien particulier (développement), d’où l’intérêt de disposer
4. Régulation temporelle de l’expression des gènes 37 d’un système de régulation efficace. En effet, éteindre totalement ces gènes (animaux K-O) ou les surexprimer (animaux transgéniques) peut parfois conduire à une létalité embryonnaire [218,219]. Pour un développement clinique sûr et efficace de traitements par thérapie génique, il est indispensable de développer des systèmes de régulation capables de moduler finement l’expression de gènes afin d’éviter les effets indésirables d’un surdosage. En effet, pour assurer une efficacité biologique optimale, la quantité de protéines exprimées dans les cellules cibles ou dans la circulation sanguine doit se situer dans la fenêtre thérapeutique de la maladie à traiter. De plus une expression continue du gène thérapeutique ne peut être autorisée pour un traitement thérapeutique : il est essentiel de contrôler le moment où le «gène médicament» est exprimé et l’arrêt du traitement si nécessaire. 4.2 Stratégies de régulation de l’expression d’un gène De l’ADN à la protéine : de nombreux points de régulation possibles Chez les eucaryotes, la plupart des gènes sont localisés dans le noyau des cellules. Leur expression ayant lieu dans le cytoplasme, il faut un intermédiaire qui permette la transmission fidèle de l’information d’un compartiment à l’autre : c’est l’ARN messager (ARNm) qui joue ce rôle pivot dans la cellule. Ce dernier constitue une cible intéressante pour le développement de stratégies de régulation de l’expression d’un gène. Deux approches ont été envisagées : agir soit en amont de la synthèse de l’ARNm en modulant l’activité du promoteur qui en contrôle la transcription, soit au niveau ou surtout en aval de la transcription, en neutralisant la molécule d’ARN messager. NOYAU ENVELOPPE NUCLEAIRE CYTOPLASME Transcription Maturation Epissage Passage Traduction ADN ARN transcrit ARN messager ARN messager Protéine fonctionnelle ou non fonctionnelle Modifications post-traductionnelles Protéine fonctionnelle Régulation par un contrôle de l’initiation de la transcription Régulation par neutralisation de l’ARN messager Fig. 11 – Schéma général de la synthèse d’une protéine avec les différentes étapes de transcription et de traduction ainsi que les deux stratégies de régulation possibles.
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