THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS 6 Capucine ...

More documents

Recommendations

Info

26 Introduction Choix des électrodes Le choix des électrodes dépend du tissu cible et de la taille de l’animal traité. Dans tous les cas, le type d’électrodes est d’une importance critique et doit être mûremement réfléchi. Lors d’un électrotransfert sur petit animal dans un tissu tel que le muscle squelettique, une tumeur ou le foie, la majorité des expérimentateurs utilisent des électrodes composées de deux plaques attachées à une pince. En effet ce type d’électrode peut être facilement appliqué en externe de chaque côté du tissu d’intérêt. Pour des animaux de plus grosse taille, les électrodes aiguilles sont plus souvent utilisées, car les électrodes plaques nécessiteraient un champ électrique trop fort (du fait de l’écart important entre les électrodes). Dans le cas des électrodes aiguilles, il peut s’agir de deux aiguilles ou d’un réseau d’aiguilles permettant des sites d’injection et d’électroporation multiples. Conditions électriques Plus précisément, la connaissance de l’intensité et de la distribution du champ électrique est très importante, pour obtenir d’une part un transfert de gène efficace mais également une toxicité réduite. La distribution du champ électrique dépend du tissu et du type d’électrodes entraînant ainsi une variation de l’intensité effective du champ (en V/cm) dans la zone traitée. La distribution du champ électrique est plus homogène pour des électrodes plaques que pour des électrodes aiguilles, et, pour un voltage identique, le champ électrique obtenu est plus faible pour des électrodes aiguilles que pour des électrodes plaques (figure 7) [86]. Fig. 7 – Calcul de la distribution du champ électrique pour des électrodes plaques (A.) ou aiguilles (B.) pour un champ de 1200 V/cm. Figure réalisée par Gehl et al. [86]. Pour chaque tissu et chaque espèce, il est nécessaire de déterminer les valeurs seuil du champ électrique : seuil réversible (perméabilisation) et seuil irréversible (dommage cellulaire) pour obtenir les conditions électriques optimales pour un transfert de gène avec le minimum d’effets toxiques. Dans ce contexte, Miklavcic et al. ont développé un modèle combinant des prédictions numériques et des observations expérimentales pour déterminer ces valeurs seuil dans le cas d’électrodes aiguilles pour délivrer des drogues dans le foie de rat [87]. Choix des impulsions Différents types d’impulsions électriques peuvent être appliquées : les impulsions exponentielles sont souvent utilisées pour des essais sur des cellules in vitro. Dans ce cas, la constante de temps dépend de la capacité et de la résistance du milieu. Les impulsions carrées sont plutôt utilisées pour des essais in vivo car ainsi le voltage et la durée des impulsions peuvent être réglés indépendamment de la résistance électrique du tissu.
2. Electrotransfert 27 Protocoles Un des avantages de l’électrotransfert d’ADN est la possibilité d’adapter le protocole électrique à différents tissus. Divers protocoles ont été publiés par différents groupes : des impulsions de faible voltage (100-300V) mais de longue durée (4-50ms) pour des essais sur des mélanomes [82] ou le muscle [88] par exemple, ou des impulsions de haut voltage (400-1200V/cm) mais de courte durée (95-300µsec) dans le foie [89], les tumeurs [90] ou le muscle [91]. Les paramètres électriques dépendent à la fois de la méthodologie employée et des caractéristiques électriques des tissus cibles : ceci permet une grande diversité de protocoles (tableau 3). espèce électrodes conditions gène Ref. souris plaque 200V/cm ; 8 p. ; 20ms; 1-2Hz Luc, hSeAP, hFIX [76,92] plaque 200V/cm ; 6 p. ; 20- 50ms; 1Hz Luc, LacZ [93] plaque 130V/cm ; 6 p. ; 60ms; 10Hz Luc,LacZ [94] aiguilles 90V/cm ; 1000p. bipolaires; 10 trains; 1s Epo, hSeAP [84] rat aiguilles 200V/cm ; 8 p. ; 50ms Epo [95] lapin 6-aiguilles 200V/cm ; 6p. ; 50ms; 1Hz HBsAg [96] cochon d’inde 6-aiguilles 200V/cm ; 6 p. ; 50ms; 1Hz HBsAg [96] cochon aiguille/plaque 100-200V/cm ; 60ms; 1Hz 6 p. ; SeAP, GHRH [97] 6-aiguilles 200V/cm ; 6 impuls. bipolaires; 20ms; 5Hz HBsAg [98] mouton aiguilles 150-200V/cm ; 1000 p. ; 200µs; 10 trains; 1s GFP [99] chèvre aiguilles 150-200V/cm ; 1000 p. ; 200µs; 5-10 trains; 2s MPB70, Ag85B, Hsp65 [100] vache aiguilles 150-200V/cm ; 1000 p. ; 200µs; 5-10 trains; 2s MPB70, Ag85B, Hsp65 [100] macaque 6-aiguilles 200V/cm ; 6 p. ; 50ms; 1Hz HIV-1 gag, env [101] Tab. 3 – Diversité de protocoles d’électrotransfert dans le muscle. Notations : p. : impulsions. Pour les abréviations, se reporter à la liste des abréviations . Toxicité Les conditions optimales de l’électrotransfert d’ADN dans un tissu donné, résultent d’un compromis entre l’efficacité du transfert d’ADN et une toxicité minimale au niveau cellulaire. La toxicité fait intervenir différents paramètres mais la perméabilisation est le principal puisque le milieu extérieur diffuse dans les cellules et modifie la composition du milieu interne. On peut également observer une sortie du milieu interne hors de la cellule. Ce paramètre de toxicité peut être réduit quand la durée et le niveau de perméabilisation sont minimaux.
Page 1: THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE
Page 4 and 5: 2 c’est 3,4 millions de pb, 1 bas
Page 6 and 7: 4 Table des matières Matériel et
Page 8 and 9: 6 Table des matières 2.2 Choix de
Page 10 and 11: 8 Table des matières 4.4.5 Etude d
Page 12 and 13: 10 Liste des abréviations gag grou
Page 14 and 15: 12 Introduction Maladies cardiovasc
Page 16 and 17: 14 Introduction aux dégradations m
Page 18 and 19: 16 Introduction actuellement testé
Page 20 and 21: 18 Introduction + + + + Tête catio
Page 22 and 23: 20 Introduction les sources de cavi
Page 24 and 25: 22 Introduction La différence de p
Page 26 and 27: 24 Introduction 2.3 Mécanisme de l
Page 30 and 31: 28 Introduction Un autre facteur de
Page 32 and 33: 30 Introduction tissu espèce gène
Page 34 and 35: 32 Introduction - c’est un tissu
Page 36 and 37: 34 Introduction 3.3 Production d’
Page 38 and 39: 36 Introduction Etude d’expressio
Page 40 and 41: 38 Introduction 4.3 Régulation par
Page 42 and 43: 40 Introduction bloquant physiqueme
Page 44 and 45: 42 Introduction Approche Descriptio
Page 46 and 47: 44 Introduction - inductibilité :
Page 48 and 49: 46 Introduction tet tetO 7 CMVmin r
Page 50 and 51: 48 Introduction NH2 terminale du r
Page 52 and 53: 50 Introduction p65 FRAP r FKBP12 C
Page 54 and 55: 52 Matériel et Méthodes Le plasmi
Page 56 and 57: 54 Matériel et Méthodes Le plasmi
Page 58 and 59: 56 Matériel et Méthodes vecteur 0
Page 60 and 61: 58 Matériel et Méthodes 2 Microbi
Page 62 and 63: 60 Matériel et Méthodes 1 à 2 he
Page 64 and 65: 62 Matériel et Méthodes Gène Fra
Page 66 and 67: 64 Matériel et Méthodes de l’ea
Page 68 and 69: 66 Matériel et Méthodes Deux lipo
Page 70 and 71: 68 Matériel et Méthodes la diluti
Page 72 and 73: 70 Matériel et Méthodes ambiante.
Page 74 and 75: 72 Matériel et Méthodes Préparat
Page 76 and 77: 74 Matériel et Méthodes 6.4 Trans
Page 78 and 79:
76 Matériel et Méthodes 7 Imageri
Page 81 and 82:
1 Suivi du transfert de gène par i
Page 83 and 84:
1.4. Signaux optiques 81 1.4 Signau
Page 85 and 86:
1.4. Signaux optiques 83 Fig. 1.3 -
Page 87 and 88:
1.6. Première mise au point : effe
Page 89 and 90:
1.7. Deuxième mise au point : éle
Page 91 and 92:
1.7. Deuxième mise au point : éle
Page 93:
1.8. Conclusion et perspectives 91
Page 96 and 97:
94 Chapitre 2. Système de régulat
Page 98 and 99:
Page 100 and 101:
Page 102 and 103:
100 Chapitre 2. Système de régula
Page 104 and 105:
Page 106 and 107:
Page 108 and 109:
Page 110 and 111:
Page 112 and 113:
Page 114 and 115:
Page 116 and 117:
Page 118 and 119:
Page 120 and 121:
Page 122 and 123:
Page 124 and 125:
Page 126 and 127:
124 Chapitre 3. Obtention d’antis
Page 128 and 129:
Page 130 and 131:
Page 132 and 133:
Page 134 and 135:
Page 136 and 137:
Page 138 and 139:
Page 140 and 141:
Page 142 and 143:
Page 144 and 145:
Page 146 and 147:
Page 148 and 149:
Page 150 and 151:
Page 152 and 153:
Page 154 and 155:
Page 156 and 157:
Page 158 and 159:
Page 160 and 161:
Page 162 and 163:
Page 164 and 165:
Page 166 and 167:
Page 168 and 169:
Page 170 and 171:
168 Chapitre 4. Etude de l’état
Page 172 and 173:
Page 174 and 175:
Page 176 and 177:
Page 178 and 179:
Page 180 and 181:
Page 182 and 183:
Page 184 and 185:
Page 186 and 187:
Page 188 and 189:
Page 190 and 191:
Page 193 and 194:
Conclusion Le transfert de gène a
Page 195:
long terme en analysant l’état d
Page 198 and 199:
196 Bibliographie [19] N. K. Green
Page 200 and 201:
198 Bibliographie [67] J. Teissie e
Page 202 and 203:
200 Bibliographie [107] M. J. Molna
Page 204 and 205:
202 Bibliographie [153] J. J. Drabi
Page 206 and 207:
204 Bibliographie [193] M. Dupuis,
Page 208 and 209:
206 Bibliographie [239] M. Gossen e
Page 210 and 211:
208 Bibliographie [284] H. Madry et
Page 212 and 213:
210 Bibliographie [329] C. A. Torre
Page 214 and 215:
212 Bibliographie [374] J. F. Coste
Page 218:
Résumé Transfert de gène in vivo
show all

THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS 6 Capucine ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?